本發(fā)明涉及一組抗氧化抑制黑色素生成的小肽、制備方法及其應(yīng)用，屬于生物醫(yī)藥及化妝品技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

東方女性歷來崇尚“膚如雪，凝如脂”的美白效果，人們一向追求白皙、潔潤的肌膚。因此，具有抑制由太陽光線及其他原因引起的色斑、色素沉著的美白劑的研究與開發(fā)，一直是化妝品行業(yè)關(guān)注的焦點(diǎn)。

紫外線引起的皮膚色素沉著主要在角質(zhì)細(xì)胞和黑色素細(xì)胞中發(fā)生，紫外輻射引發(fā)角質(zhì)細(xì)胞dna損傷，p53上調(diào)，最終導(dǎo)致角質(zhì)細(xì)胞α-msh(α-melanocytestimulatinghormone)的分泌量增加，當(dāng)α-msh與黑色素細(xì)胞膜上的mc1r(melanocortin1receptor)結(jié)合后，會激活腺苷酸環(huán)化酶產(chǎn)生胞內(nèi)第二信使環(huán)腺苷camp，環(huán)腺苷酸隨后激活pka(proteinkinasea)，后者通過creb(camp-responsiveelementbindingprotein)的磷酸化，從而激活mitf(microphthalmia-associatedtranscriptionfactor)基因的表達(dá)。最后，mitf有效激活與黑色素形成相關(guān)蛋白酶的表達(dá)，最終促進(jìn)黑色素的形成。mitf參與黑色素細(xì)胞的生存、增殖、分化,是調(diào)節(jié)黑色素形成的重要調(diào)控因子。通過與啟動子的結(jié)合來調(diào)節(jié)tyr(tyrosinase)、trp-1(tyrosinase-relatedprotein1)和trp-2(tyrosinase-relatedprotein2)的基因表達(dá)。

黑色素的合成是一系列復(fù)雜的酶促氧化反應(yīng)，以酪氨酸或多巴為底物，在酪氨酸酶的催化作用下氧化生產(chǎn)多巴醌，此氧化反應(yīng)過程是黑色素合成中的關(guān)鍵限速反應(yīng)，酪氨酸酶的過量表達(dá)是導(dǎo)致色素沉著過度的主要原因。因此，抑制該氧化反應(yīng)或酪氨酸酶的活性可以阻斷黑色素的生物合成反應(yīng)鏈，減少黑色素的生成，實(shí)現(xiàn)美白的效果。近年來，越來越多的化合物被證實(shí)能夠有效抑制酪氨酸酶的活性，它們被稱為酪氨酸酶抑制劑，如曲酸、熊果苷、維生素c衍生物以及一些天然提取物質(zhì)。但是，維生素c不穩(wěn)定，不易被皮膚吸收，難以廣泛應(yīng)用；熊果苷是一種含酚基的化合物，雖然安全但對酪氨酸酶的抑制效應(yīng)緩慢，且吸光性好不適合白天使用；曲酸的美白祛斑效果顯著但是具有一定的毒性，不能長期使用。

天然肽類原料具有安全、無毒、高細(xì)胞滲透性、高效能、短序列等優(yōu)點(diǎn)，添加到化妝品中能夠從根本上改善、修復(fù)皮膚出現(xiàn)的各種問題，特別在保濕、美白、抗皺、抗氧化、抗衰老等方面功效顯著。因此，研發(fā)一種高效、安全的多肽美白劑，具有良好的應(yīng)用前景。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一組抗氧化、抑制黑色素生成的小肽、制備方法及其應(yīng)用。

本發(fā)明的技術(shù)方案：

一組抗氧化抑制黑色素生成的小肽，包括短肽ogot、短肽magin-fl和短肽ansin-fl；

(1)短肽ogot：一種直鏈小肽，分子量為1407.80da，等電點(diǎn)是8.06，含有13個氨基酸殘基，全序列的一級結(jié)構(gòu)為:phe-val-pro-ala-ile-leu-cys-ser-ile-leu-lys-thr-cys；

(2)短肽magin-fl：一種直鏈小肽，分子量為1205.42da，等電點(diǎn)是9.21，含有10個氨基酸殘基，全序列的一級結(jié)構(gòu)為：phe-phe-arg-thr-ser-cys-arg-ser-val-cys；

(3)短肽ansin-fl：一種直鏈小肽，分子量為1593.90da，等電點(diǎn)是9.02，含有13個氨基酸殘基，全序列的一級結(jié)構(gòu)為：thr-ser-arg-cys-ile-phe-tyr-arg-arg-cys-val-cys-ser。

一組抗氧化、抑制黑色素生成的小肽的制備方法，首先，根據(jù)小肽的氨基酸序列合成小肽的全序列；再通過hplc反相柱層析脫鹽純化，并確定其純度大于95％；最后，用基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時間質(zhì)譜測定小肽分子量。

一組抗氧化、抑制黑色素生成的小肽用于制備抗氧化、抗黑色素生成、淡化色斑的美容護(hù)膚品。

一組抗氧化、抑制黑色素生成的小肽用作制備抗氧化藥物、食品添加劑。

本發(fā)明的有益效果：本發(fā)明提供的一種具有皮膚美白功效的多肽組合物，包含三種短肽：ogot，magin-fl和ansin-fl。該三種短肽具有極強(qiáng)的抗氧化活性，dpph的清除率高達(dá)89.94％；并且具有極強(qiáng)的酪氨酸酶抑制活性，半抑制濃度(ic50)低至18.47-36.07μm，而熊果苷的半抑制濃度為922.6μm，能夠抑制黑色素的生成，有助于提亮膚色，達(dá)到淡化色斑、改善暗啞、增白膚質(zhì)的目的；并通過mtt法和溶血試驗(yàn)測定多肽的毒性，結(jié)果顯示該組多肽的毒性極低，即使加藥濃度高達(dá)160μg/ml，溶血率也不超過1％。并且該組短肽分子量小、結(jié)構(gòu)簡單、無細(xì)胞毒性、無溶血活性、高組織滲透性、制備方法簡單?？捎糜谥苽淇购谏厣?、淡化色斑，美白抗氧化美容護(hù)膚品新原料，也可用作制備抗氧化藥物、食品添加劑，具有很好的應(yīng)用前景。

附圖說明

圖1是ogot，magin-fl和ansin-fl對hacat細(xì)胞的毒性圖。

圖2是ogot，magin-fl和ansin-fl對b16細(xì)胞的毒性圖。

圖中：

具體實(shí)施方式

以下結(jié)合附圖和技術(shù)方案，進(jìn)一步說明本發(fā)明的具體實(shí)施方式。

實(shí)施例1

ogot，magin-fl和ansin-fl的化學(xué)合成：

(1)ogot，magin-fl和ansin-fl的化學(xué)合成方法：根據(jù)短肽氨基酸序列，用自動多肽合成儀(433a,appliedbiosystems)合成其全序列，通過hplc反相柱層析脫鹽。

(2)分子量測定采用基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時間質(zhì)譜(maldi-tof)。

(3)純化的ogot，magin-fl和ansin-fl用高效液相色譜hplc方法鑒定其純度，分子量測定采用基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時間質(zhì)譜(maldi-tof)，等電聚焦電泳測定等電點(diǎn)，用自動氨基酸測序儀測定氨基酸序列結(jié)構(gòu)。

ogot，magin-fl和ansin-fl是直鏈短肽，其中，ogot分子量為1407.80da，等電點(diǎn)是8.06，含有13個氨基酸殘基，全序列的一級結(jié)構(gòu)為：phe-val-pro-ala-ile-leu-cys-ser-ile-leu-lys-thr-cys；magin-fl分子量為1205.42da，等電點(diǎn)是9.21，含有10個氨基酸殘基，全序列的一級結(jié)構(gòu)為：phe-phe-arg-thr-ser-cys-arg-ser-val-cys；ansin-fl分子量為1593.90da，等電點(diǎn)是9.02，含13個氨基酸殘基，全序列的一級結(jié)構(gòu)為：thr-ser-arg-cys-ile-phe-tyr-arg-arg-cys-val-cys-ser。

實(shí)施例2

ogot，magin-fl和ansin-fl抗氧化活性測定：

(1)dpph自由基清除活性(dpphradicalscavengingassay)

稱取一定量的dpph(2,2-diphenyl-1-picrylhydrazylhydrate，sigma，美國)，用甲醇溶解，配成6×10^-5m的溶液，現(xiàn)配現(xiàn)用。將48μldpph溶液和2μl樣品(2mg/ml)混合(最終樣品與dpph的質(zhì)量比為3:1)，室溫下避光靜置30min，于517nm處測定吸光值?？瞻讓φ战M以樣品溶解介質(zhì)代替待測樣品。實(shí)驗(yàn)做三個平行，紫外分光光度計(jì)調(diào)零時使用甲醇。

dpph·清除率(％)＝(ab－aa)/ab×100(ab:空白對照組吸光值；aa:樣品組吸光值)。

(2)abts^·+自由基正離子清除活性

abts(3-ethylbezothiazoline-6-sulfonicacid)(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)用pbs緩沖液(ph7.4)配成2mm的abts儲存液。將abts儲存液和70mm過硫酸鉀(k2s2o8)水溶液按體積比250:1混合，于室溫避光放置15-16h。試驗(yàn)開始前，將abts^·+釋至734nm波長處的吸光值為0.80±0.03。將4μl不樣品和96μl上述校正過的abts^·+溶液混合，室溫放置10min后，于734nm波長處檢測反應(yīng)液的吸光值。空白對照組為溶解樣品所用滅菌去離子水。實(shí)驗(yàn)做三個平行。

abts^·+清除率i(％)＝(ab－aa)/ab×100(ab:空白對照組吸光值；aa:樣品組吸光值)。

(3)還原力測定

10μl樣品(2mg/ml)與50μl磷酸鈉緩沖液以及50μl1％k3fe(cn)6混合，50℃水浴20min；然后加入50μl10％的三氯乙酸，3000rpm離心10min；取上清50μl，加入50μl去離子水和10μl1％fecl3。于700nm測光吸收。光吸收越強(qiáng)表示還原力越強(qiáng)。

表1.ogot，magin-fl和ansin-fl體外抗氧化活性

結(jié)果如表1所示，ogot、magin-fl和ansin-fl具有極強(qiáng)的抗氧化活性。

實(shí)施例3

酪氨酸酶半抑制濃度ic50值的測定：

酪氨酸酶活性抑制實(shí)驗(yàn)以l-dopa為反應(yīng)底物，檢測酪氨酸酶催化后的底物有色物質(zhì)多巴醌于475nm處的吸光度，間接反映樣品對酪氨酸酶的抑制活性。

采用100μl的反應(yīng)體系，先后加入磷酸鹽緩沖液、不同濃度樣品(10、25、50、100、200μm)及蘑菇酪氨酸酶加入后于37℃中保溫10min，再加入底物，于37℃反應(yīng)10min，測定475nm波長的od值。根據(jù)測得的od值計(jì)算蘑菇酪氨酸酶相對活性抑制率:抑制率(％)＝(1－實(shí)驗(yàn)組od值/對照組od值)×100％。

數(shù)據(jù)采用spss軟件計(jì)算各物質(zhì)的半抑制濃度ic50。

表2.arbutin，ogot，magin-fl和ansin-fl的ic50值

結(jié)果表明，樣品ogot，magin-fl和ansin-fl的半抑制濃度分別為46.07，27.07和59.44μm，而常用的酪氨酸酶抑制劑熊果苷的半抑制濃度為922.6μm，說明三個樣品具有極強(qiáng)的抑制酪氨酸酶的能力，可以減少黑色素的生成，將其應(yīng)用在化妝品添加劑中，可以提高化妝品的美白效果，具有很好的應(yīng)用前景。

實(shí)施例4

ogot，magin-fl和ansin-fl細(xì)胞毒性測定：

用mtt法檢測樣品ogot，magin-fl和ansin-fl對人永生化角質(zhì)細(xì)胞hacat和小鼠黑色素瘤b16的細(xì)胞毒性。

先將細(xì)胞于含有10％胎牛血清以及雙抗(青霉素和鏈霉素各100u/ml)的dmem中培養(yǎng)，待細(xì)胞長滿后，用0.25％的胰蛋白酶消化下來，用上述培養(yǎng)基洗兩次，重新懸浮細(xì)胞，細(xì)胞計(jì)數(shù)后將細(xì)胞懸浮液100μl加入到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，使每孔細(xì)胞數(shù)為10³個。過夜待細(xì)胞貼壁后，吸出培養(yǎng)基，加入含不同濃度樣品的完全培養(yǎng)基，對照組加入相同體積的完全培養(yǎng)基，置37℃、5％co2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)72h(中途換液一次)。培養(yǎng)結(jié)束后，96孔細(xì)胞培養(yǎng)板每孔加入20μl5mg/mlmtt溶液(用pbs緩沖液配制)，繼續(xù)培養(yǎng)4h后,吸出孔中液體，每孔加入150μldmso，搖床振蕩10min。酶標(biāo)儀檢測光吸收，測定波長為490nm，參考波長630nm。

結(jié)果如圖1和圖2所示，結(jié)果表明，無論是對hacat細(xì)胞還是b16細(xì)胞，樣品ogot，magin-fl濃度為160μg/ml時的細(xì)胞存活率仍可高達(dá)90％，說明樣品ogot，magin-fl不具有細(xì)胞毒性，對人體正常皮膚細(xì)胞不會產(chǎn)生傷害，因此十分利于其在美白化妝品添加劑領(lǐng)域進(jìn)一步的開發(fā)應(yīng)用。

實(shí)施例5

ogot，magin-fl和ansin-fl溶血活性測定：

將采集的健康人血與阿氏液混合抗凝，生理鹽水洗滌2次并重懸成107-108cell/ml的懸浮液。上述稀釋好的紅細(xì)胞懸液分別與溶解于生理鹽水的ogot，magin-fl和ansin-fl樣品混合，37℃保溫30min，再于1000rpm離心5min，上清液于540nm測吸收值。陰性對照使用生理鹽水，陽性對照使用tritonx-100，溶血百分比按以下公式計(jì)算：溶血百分比：h％＝(a樣品-a陰性對照)/a陽性對照×100％。

表3.ogot，magin-fl和ansin-fl的溶血率

結(jié)果表明三種樣品ogot，magin-fl和ansin-fl濃度為160μg/ml時的溶血百分比分別為0.10％、0.41％、0.67％。說明ogot，magin-fl和ansin-fl都不具有的溶血活性，不易引起人體紅細(xì)胞破裂溶解而對人體產(chǎn)生傷害，因此十分利于其在美白化妝品添加劑領(lǐng)域進(jìn)一步的開發(fā)應(yīng)用。