本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及gbp蛋白及其編碼基因在調(diào)控植物產(chǎn)量中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

隨著人口數(shù)目的持續(xù)增加、耕地大面積的縮水和鹽漬化以及淡水資源的短缺問(wèn)題的加劇，使得環(huán)境脅迫更加嚴(yán)峻，這樣就勢(shì)必影響全球的農(nóng)業(yè)生產(chǎn)(rosegrantandcline,2003)。而高等植物本身植根于土壤之中，幾乎無(wú)自主性移動(dòng)能力，主要依賴根從土壤中吸收養(yǎng)料和水分來(lái)維持生活周期。而且根的發(fā)育直接受各種環(huán)境因子的炮轟，因此對(duì)作物根系發(fā)育的研究會(huì)直接影響其產(chǎn)量。并且在多細(xì)胞植物的胚后發(fā)育過(guò)程中，幼苗的地上和地下部分的末端出現(xiàn)兩類干細(xì)胞群即莖頂端分生組織(sam)和根分生組織(rm)，這些干細(xì)胞在一定的時(shí)空條件下進(jìn)行分裂，其子細(xì)胞除了自我更新外也作為各種組織和器官的細(xì)胞來(lái)源，維持了植物整個(gè)世代的生長(zhǎng)發(fā)育(weigelandjürgens,2002；laux,2003)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的一個(gè)目的是提供gbp蛋白的新用途。

所述gbp蛋白是如下a)或b)或c)或d)的蛋白質(zhì)：

a)氨基酸序列是序列2所示的蛋白質(zhì)；

b)在序列2所示的蛋白質(zhì)的n端和/或c端連接標(biāo)簽得到的融合蛋白質(zhì)；

c)將序列2所示的氨基酸序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白質(zhì)；

d)與序列2所示的氨基酸序列具有75％或75％以上的同源性且具有相同功能的蛋白質(zhì)。

本發(fā)明提供了gbp蛋白在調(diào)控植物根長(zhǎng)和/或分蘗數(shù)和/或種子數(shù)和/或產(chǎn)量中的應(yīng)用。

本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供與gbp蛋白相關(guān)的生物材料的新用途。

本發(fā)明提供了與gbp蛋白相關(guān)的生物材料在調(diào)控植物根長(zhǎng)和/或分蘗數(shù)和/或種子數(shù)和/或產(chǎn)量中的應(yīng)用；

所述與gbp蛋白相關(guān)的生物材料為下述a1)至a12)中的任一種：

a1)編碼gbp蛋白的核酸分子；

a2)含有a1)所述核酸分子的表達(dá)盒；

a3)含有a1)所述核酸分子的重組載體；

a4)含有a2)所述表達(dá)盒的重組載體；

a5)含有a1)所述核酸分子的重組微生物；

a6)含有a2)所述表達(dá)盒的重組微生物；

a7)含有a3)所述重組載體的重組微生物；

a8)含有a4)所述重組載體的重組微生物；

a9)含有a1)所述核酸分子的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞系；

a10)含有a2)所述表達(dá)盒的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞系；

a11)含有a3)所述重組載體的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞系；

a12)含有a4)所述重組載體的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞系。

上述應(yīng)用中，a1)所述核酸分子為如下1)或2)或3)所示的基因：

1)其編碼序列是序列1所示的cdna分子或dna分子；

2)與1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且編碼gbp蛋白的cdna分子或基因組dna分子；

3)在嚴(yán)格條件下與1)或2)限定的核苷酸序列雜交，且編碼gbp蛋白的cdna分子或基因組dna分子。

上述應(yīng)用中，所述調(diào)控為提高或降低。

本發(fā)明還有一個(gè)目的是提供gbp蛋白或與gbp蛋白相關(guān)的生物材料的新用途。

本發(fā)明提供了gbp蛋白或與gbp蛋白相關(guān)的生物材料在培育根長(zhǎng)變長(zhǎng)和/或分蘗數(shù)增加和/或種子數(shù)增加和/或產(chǎn)量提高的轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用。

本發(fā)明還提供了gbp蛋白或與gbp蛋白相關(guān)的生物材料在培育根長(zhǎng)變短和/或分蘗數(shù)減少和/或種子數(shù)減少和/或產(chǎn)量降低的植物中的應(yīng)用。

本發(fā)明還提供了gbp蛋白或與gbp蛋白相關(guān)的生物材料在植物育種中的應(yīng)用。

本發(fā)明還有一個(gè)目的是提供一種培育根長(zhǎng)變長(zhǎng)和/或分蘗數(shù)增加和/或種子數(shù)增加和/或產(chǎn)量提高的轉(zhuǎn)基因植物的方法。

本發(fā)明提供的培育根長(zhǎng)變長(zhǎng)和/或分蘗數(shù)增加和/或種子數(shù)增加和/或產(chǎn)量提高的轉(zhuǎn)基因植物的方法包括提高受體植物中g(shù)bp蛋白的含量和/或活性，得到轉(zhuǎn)基因植物的步驟；所述轉(zhuǎn)基因植物的根長(zhǎng)和/或分蘗數(shù)和/或種子數(shù)和/或產(chǎn)量高于受體植物。

上述方法中，所述提高受體植物中g(shù)bp蛋白的表達(dá)量和/或活性的方法為在受體植物中過(guò)表達(dá)gbp蛋白；所述過(guò)表達(dá)的方法為將gbp蛋白的編碼基因?qū)胧荏w植物。

上述方法中，所述gbp蛋白的編碼基因的核苷酸序列是序列1所示的dna分子。

在本發(fā)明的具體實(shí)施例中，所述gbp蛋白的編碼基因是通過(guò)重組載體pmdc32-35s::gbp導(dǎo)入受體植物。所述重組載體pmdc32-35s::gbp為將序列1所示的gbp基因重組到pmdc32載體的attr1(aaacaagtttgtacaaaaaa)和attr2(tttcttgtacaaagtgg)之間，且保持pmdc32載體的其他序列不變后得到的載體。重組載體pmdc32-35s::gbp表達(dá)gbp蛋白。

本發(fā)明的最后一個(gè)目的是提供一種培育根長(zhǎng)變短和/或分蘗數(shù)減少和/或種子數(shù)減少和/或產(chǎn)量降低的植物的方法。

本發(fā)明提供的培育根長(zhǎng)變短和/或分蘗數(shù)減少和/或種子數(shù)減少和/或產(chǎn)量降低的植物的方法包括降低植物中g(shù)bp蛋白的含量和/或活性，從而減小植物的根長(zhǎng)和/或分蘗數(shù)和/或種子數(shù)和/或產(chǎn)量。

上述方法中，所述根長(zhǎng)為主根長(zhǎng)，所述分蘗數(shù)為單株分蘗數(shù)，所述種子數(shù)為單株種子數(shù)。

上述方法中，所述植物為單子葉植物或雙子葉植物，所述單子葉植物具體可為禾本科植物；所述禾本科植物具體可為水稻；所述水稻具體可為gbp突變體或野生型水稻日本晴。

本發(fā)明首先從野生型水稻日本晴中上克隆到gbp基因，然后獲得了gbp基因突變的水稻gbp突變體，并且發(fā)現(xiàn)和野生型日本晴nip相比，gbp突變體根系萎縮，單株分蘗數(shù)、種子數(shù)和產(chǎn)量均有所降低，最后構(gòu)建了超表達(dá)載體pmdc32-35s::gbp，并將超表達(dá)載體pmdc32-35s::gbp轉(zhuǎn)入野生型水稻日本晴中，得到t3代轉(zhuǎn)gbp水稻純合株系。通過(guò)實(shí)驗(yàn)證明：和野生型nip相比，t3代轉(zhuǎn)gbp水稻純合株系oe8、oe10和oe13根系更加發(fā)達(dá)，單株分蘗數(shù)、種子數(shù)和產(chǎn)量均高于野生型nip。證明gbp在水稻根系生長(zhǎng)以及產(chǎn)量生產(chǎn)方面發(fā)揮正向調(diào)節(jié)作用。

附圖說(shuō)明

圖1為水稻gbp基因表達(dá)量下降后根系萎縮，表達(dá)量上調(diào)后根系發(fā)達(dá)。

圖2為水稻gbp基因表達(dá)量下降后分蘗數(shù)降低，表達(dá)量上調(diào)后分蘗數(shù)增加。

圖3為統(tǒng)計(jì)了水稻gbp基因表達(dá)量下降后單株種子數(shù)降低，表達(dá)量上調(diào)后單株種子數(shù)增加。

圖4為統(tǒng)計(jì)了水稻gbp基因表達(dá)量下降后單株分蘗數(shù)降低，表達(dá)量上調(diào)后單株分蘗數(shù)增加。

圖5為野生型日本晴nip和gbp突變體中g(shù)bp基因表達(dá)量檢測(cè)。

圖6為水稻gbp基因表達(dá)量下降后根長(zhǎng)變短，表達(dá)量上調(diào)后根長(zhǎng)變長(zhǎng)。

圖7為水稻gbp基因表達(dá)量下降后主根長(zhǎng)變短，表達(dá)量上調(diào)后主根長(zhǎng)變長(zhǎng)。

具體實(shí)施方式

下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。

下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑得到。

下述實(shí)施例中的定量試驗(yàn)，均設(shè)置三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果取平均值。

實(shí)施例1、水稻gbp基因的克隆

1、rna的提取

提取野生型水稻日本晴葉片的rna。

2、cdna的獲得

以步驟1獲得的rna為模板，反轉(zhuǎn)錄得到cdna。

3、pcr擴(kuò)增

以步驟2獲得的cdna為模板，采用引物5′-caccatggcgacgatgtctcgccgc-3′和5′-aacgttgaaccggaaaagcatg-3′進(jìn)行pcr擴(kuò)增，得到pcr擴(kuò)增產(chǎn)物。

4、測(cè)序

將pcr擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1.5％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)并送交測(cè)序。測(cè)序結(jié)果表明：pcr擴(kuò)增得到大小為1296bp的擴(kuò)增產(chǎn)物，其核苷酸序列如序列表中序列1所示，并將序列1所示的基因命名為gbp基因，gbp基因編碼序列表中序列2所示的蛋白質(zhì)，將序列2所示的氨基酸序列命名為gbp蛋白。

實(shí)施例2、gbp突變體的獲得及其性狀檢測(cè)

一、gbp突變體的獲得

1、gbp突變體的獲得

將突變體種子(購(gòu)買于韓國(guó)水稻基因沉默突變體公司，種子編號(hào)為pfg2b_30061)在30度培養(yǎng)箱中暗培養(yǎng)4天，移到營(yíng)養(yǎng)液中培養(yǎng)10天，然后再移植到大田中，待一個(gè)月后取材提取dna，鑒定純合體，得到突變體植株，將其命名為gbp突變體。

對(duì)gbp突變體進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序結(jié)果表明：gbp突變體和野生型水稻日本晴的基因組序列相比，gbp突變體僅是在序列1所示的gbp基因第275-439位插入一段t-dna序列，其余序列與野生型日本晴全部相同。

2、gbp基因表達(dá)量檢測(cè)

提取野生型日本晴nip和gbp突變體的根的rna，然后反轉(zhuǎn)錄形成cdna。以獲得的cdna為模板，采用引物gbp-f1：5′-gcgcactcggctctgcgttc-3′和gbp-f2：5′-acatcgcacaacctgaaggatggaa-3′進(jìn)行pcr半定量，并以ostubulin-rt-f:tcttccaccctgagcagctc和ostubulin-rt-r:aaccttggagaccagtgcag作為內(nèi)參引物。

結(jié)果如圖5所示。從圖中可以看出，內(nèi)參基因tubulin在野生型日本晴nip和gbp突變體中均能正常轉(zhuǎn)錄表達(dá)，而用引物gbp-f1和gbp-f2均只能在野生型日本晴nip中有擴(kuò)增條帶，gbp突變體中無(wú)擴(kuò)增產(chǎn)物，說(shuō)明由于t-dna插入導(dǎo)致gbp突變體中的gbp基因不能正常轉(zhuǎn)錄表達(dá)。

3、gbp純合突變體的獲得

采用如下引物：gbp-f1：5′-gcgcactcggctctgcgttc-3′、gbp-f2：5′-acatcgcacaacctgaaggatggaa-3′和gbp-f3：5′-aacgctgatcaattccacag-3′對(duì)gbp突變體進(jìn)行pcr鑒定，得到gbp純合突變體。

若引物gbp-f1和gbp-f2未擴(kuò)增出大小為1425bp的條帶，且引物gbp-f2和gbp-f3擴(kuò)增出大小為498bp的條帶的gbp突變體為gbp純合突變體。

二、gbp突變體的性狀檢測(cè)

分別將步驟一中獲得的gbp純合突變體植株(gbp)和野生型水稻日本晴(nip)種子在30℃黑暗培養(yǎng)箱中萌發(fā)四天，然后移植到營(yíng)養(yǎng)液中，生長(zhǎng)兩周，再將苗種植于水稻大田，六個(gè)月的正常生長(zhǎng)，得到gbp純合突變體植株(gbp)和野生型水稻日本晴(nip)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，結(jié)果取平均值。比較gbp純合突變體植株(gbp)和野生型水稻日本晴(nip)的根系生長(zhǎng)情況，并統(tǒng)計(jì)單株分蘗數(shù)和種子數(shù)。

結(jié)果如圖1、圖2、圖3、圖4、圖6和圖7所示。從圖中可以看出：在正常條件下，和野生型日本晴nip相比，gbp突變體根系萎縮，主根長(zhǎng)變短，單株分蘗數(shù)和種子數(shù)均低于野生型日本晴nip，在產(chǎn)量上有很大程度的降低。表明gbp在水稻根系生長(zhǎng)以及產(chǎn)量生產(chǎn)方面發(fā)揮正向調(diào)節(jié)作用。

實(shí)施例3、轉(zhuǎn)gbp水稻的獲得及其性狀檢測(cè)

一、轉(zhuǎn)gbp水稻的獲得

1、重組載體pmdc32-35s::gbp的構(gòu)建

利用gateway方法將實(shí)施例1中克隆得到的序列1所示的gbp基因連入pentr^tm/sd/d-topo載體(invitrogen，貨號(hào)為1711243)，得到重組載體pentr^tm/sd/d-topo-gbp，并對(duì)其進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證。經(jīng)過(guò)測(cè)序表明：克隆的gbp基因沒有任何點(diǎn)突。

將重組載體pentr^tm/sd/d-topo-gbp、pmdc32載體(biovectorntcc)和重組酶(invitrogen)混勻，于22℃，過(guò)夜反應(yīng)，使序列1所示的gbp基因重組到pmdc32載體的attr1(aaacaagtttgtacaaaaaa)和attr2(tttcttgtacaaagtgg)之間，得到重組載體pmdc32-35s::gbp。重組載體pmdc32-35s::gbp表達(dá)gbp蛋白。

2、重組菌的獲得

將重組載體pmdc32-35s::gbp轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌eha105(biovectorntcc)中，得到重組菌pmdc32-35s::gbp/eha105。

3、轉(zhuǎn)gbp水稻的獲得

(1)用75％乙醇和2.5％次氯酸鈉消毒野生型nip水稻種子，然后均勻的鋪在誘導(dǎo)培養(yǎng)基上28℃避光培養(yǎng)28天，誘導(dǎo)愈傷組織。

(2)將誘導(dǎo)28天的愈傷組織來(lái)回猛搖幾次，從脫離的愈傷組織中挑選光滑、黃色并且較硬的大小在2-3mm的胚性愈傷，之后放在ms培養(yǎng)基上，28℃避光培養(yǎng)7天。

(3)刮取已活化3天的步驟2中獲得的重組菌pmdc32-35s::gbp/eha105，放入nbco液體培養(yǎng)基中，打散混勻，調(diào)od600至0.125。再將胚性愈傷放入上述nbco培養(yǎng)基中，靜止15-20分鐘，倒去菌液吸干均勻的鋪在已加濾紙的nbco共培養(yǎng)基中。于22℃避光培養(yǎng)3天。

(4)共培養(yǎng)愈傷用滅菌水洗三次，后用植物羧芐為500mg/l的滅菌水浸泡15分鐘，吸干放入選擇培養(yǎng)基中。

(5)挑取新長(zhǎng)出的愈傷放入預(yù)分化培養(yǎng)基中，暗培養(yǎng)一周

(6)將(5)中暗培養(yǎng)的愈傷放入分化培養(yǎng)基，光照培養(yǎng)直到產(chǎn)生葉綠素；

(7)將產(chǎn)生葉綠素的陽(yáng)性愈傷轉(zhuǎn)移到生根壯苗培養(yǎng)基中，28℃光照培養(yǎng)，直到長(zhǎng)成陽(yáng)性幼苗；

(8)將陽(yáng)性幼苗移植到大田，收到的種子即為t1代；

(9)將t1代的種子用潮霉素篩選，將有抗性的小苗移植到水稻田，然后單株收種子即為t2代；

(10)將單株收到的t2代的種子分別用潮霉素篩選，查看種子萌發(fā)比例，全部萌發(fā)的即為轉(zhuǎn)基因純和株系。然后將全部萌發(fā)的t2代的苗轉(zhuǎn)移到大田，收種子即為t3代轉(zhuǎn)gbp水稻純合株系。

4、pcr鑒定

用引物gbp-f1：5′-gcgcactcggctctgcgttc-3′和gbp-f2：5′-acatcgcacaacctgaaggatggaa-3′對(duì)t3代轉(zhuǎn)gbp水稻純合株系進(jìn)行pcr半定量鑒定。結(jié)果如圖5所示。t3代轉(zhuǎn)gbp水稻純合株系oe8、oe10和oe13中均高表達(dá)gbp基因。

二、轉(zhuǎn)gbp水稻的性狀檢測(cè)

分別將步驟一中獲得的陽(yáng)性t3代轉(zhuǎn)gbp水稻純合株系oe8、oe10和oe13及野生型水稻日本晴(nip)種子在30℃黑暗培養(yǎng)箱中萌發(fā)四天，然后移植到營(yíng)養(yǎng)液中，生長(zhǎng)兩周，再將苗種植于水稻田，六個(gè)月的正常生長(zhǎng)，每個(gè)不同品種的水稻取10株進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，結(jié)果取平均值。比較t3代轉(zhuǎn)gbp水稻純合株系和野生型水稻日本晴(nip)的根系生長(zhǎng)情況，并統(tǒng)計(jì)單株分蘗數(shù)和種子數(shù)。

結(jié)果如圖1、圖2、圖3、圖4、圖6和圖7所示。從圖中可以看出：在正常條件下，和野生型日本晴nip相比，t3代轉(zhuǎn)gbp水稻純合株系oe8、oe10和oe13根系更加發(fā)達(dá)，主根長(zhǎng)變長(zhǎng)，單株分蘗數(shù)和種子數(shù)均高于野生型日本晴nip，在產(chǎn)量上有很大程度的提高。上述結(jié)果表明，gbp在水稻根系生長(zhǎng)以及產(chǎn)量生產(chǎn)方面發(fā)揮正向調(diào)節(jié)作用。

序列表

<110>河北師范大學(xué)

<120>gbp蛋白及其編碼基因在調(diào)控植物產(chǎn)量中的應(yīng)用

<160>2

<210>1

<211>1296bp

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>1

atggcgacgatgtctcgccgcgcactcggctctgcgttcgcgggattcacgcggacacca60

gctatgactccgacggccaccttgccttcctcgtgcgcgtccccggcgcgtctcctgcgg120

tggcgccggagcgcgggtgtaggcgcccggcggttcgcgtccggccgcaacgcgcggatt180

agcatgagcctccgcgccggcatcgtcggcctgcccaacgtcggcaagtccacactcttc240

aatgccattgttgaaaatgggaaggcacaagctgcaaactttcccttctgcaccataaac300

cccaacgttggtgttgtggctatcccagatgctcgcttgcatgtgctctcaaaattaagc360

aagtctaaggagacaatcccaacatccatagagcttgtggatattgcaggtctcgtcaaa420

ggagcaagcaaaggagagggactaggaaaccaatttctttcgaacatccgtgaggttgat480

tccatccttcaggttgtgcgatgttttgaagatgatgatattgttcatgtgagtgggaaa540

gttgatcccaaatcagatattgatgtaattaatctggagcttatattttctgatcttgac600

cagatagagaaaagactggataagcttaaaaagagcaaaactaaagaccagcaagtaaag660

gtcaaggaacaagcagagaggactggattggaaaaaattcagactgtacttatggatgga720

aaacctgctagatctgttgatttggctgaccatgagaaagaagctatccaacatctttgt780

ctactaactatgaaacctgtcatttatgttgccaacgtaactgaatctgatcttgctgaa840

cctggtaacaaccctcatgtcaaagaggtagccaaactagcaacagacttggaatctggc900

atggttacaatatcagctcaggttgaggctgaacttgctgaactgccattagaagagaga960

gtcgaatatctaaaatcccttggtgttactgaaagtggactaggaaatttggtaaaggca1020

acatatgaccttctgggattgaggacttatttcacaactggagataaggaaacaaaagct1080

tggactattcttgcaggcatgactgcacctcaagcagcaggagttattcacagtgacttt1140

cagaaaggcttcattagagctgaaactgtatcatatgatgattttgtcgcggcgggttct1200

cttggagttgcaagggagaagggattgttgaggttggaagggaaggattacatcgtgcag1260

gaaggcgatgtcatgcttttccggttcaacgtttga1296

<210>2

<211>431

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>2

metalathrmetserargargalaleuglyseralaphealaglyphe

151015

thrargthrproalametthrprothralathrleuprosersercys

202530

alaserproalaargleuleuargtrpargargseralaglyvalgly

354045

alaargargphealaserglyargasnalaargilesermetserleu

505560

argalaglyilevalglyleuproasnvalglylysserthrleuphe

65707580

asnalailevalgluasnglylysalaglnalaalaasnpheprophe

859095

cysthrileasnproasnvalglyvalvalalaileproaspalaarg

100105110

leuhisvalleuserlysleuserlysserlysgluthrileprothr

115120125

serilegluleuvalaspilealaglyleuvallysglyalaserlys

130135140

glygluglyleuglyasnglnpheleuserasnilearggluvalasp

145150155160

serileleuglnvalvalargcysphegluaspaspaspilevalhis

165170175

valserglylysvalaspprolysseraspileaspvalileasnleu

180185190

gluleuilepheseraspleuaspglnileglulysargleuasplys

195200205

leulyslysserlysthrlysaspglnglnvallysvallysglugln

210215220

alagluargthrglyleuglulysileglnthrvalleumetaspgly

225230235240

lysproalaargservalaspleualaasphisglulysglualaile

245250255

glnhisleucysleuleuthrmetlysprovaliletyrvalalaasn

260265270

valthrgluseraspleualagluproglyasnasnprohisvallys

275280285

gluvalalalysleualathraspleugluserglymetvalthrile

290295300

seralaglnvalglualagluleualagluleuproleuglugluarg

305310315320

valglutyrleulysserleuglyvalthrgluserglyleuglyasn

325330335

leuvallysalathrtyraspleuleuglyleuargthrtyrphethr

340345350

thrglyasplysgluthrlysalatrpthrileleualaglymetthr

355360365

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