本發(fā)明屬于高通量基因測序
技術(shù)領(lǐng)域：
。技術(shù)背景相對于經(jīng)典的sanger測序，高通量基因測序又稱二代測序、下一代測序(nextgenerationsequencing,ngs)。相應(yīng)的，sanger測序也叫一代測序。全外顯子組測序和panel測序都屬于靶向基因測序，是二代測序的重要分支技術(shù)，主要目的有二：一是為了節(jié)省測序費(fèi)用，因?yàn)槿怙@子組只占全基因組大小的1％，各種panel所針對的目標(biāo)靶區(qū)域更?。欢菫榱私档蜕镄畔W(xué)數(shù)據(jù)分析的難度，加快分析速度，因而在基礎(chǔ)研究、臨床科研、臨床診斷和新藥研發(fā)等各領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。目前已有的外顯子測序和靶向測序產(chǎn)品主要有4家品牌：安捷倫公司的sureselect和haloplex，羅氏公司的nimblegen，illumina公司的truseq和nextera(基于轉(zhuǎn)座子技術(shù))以及idt公司的全外顯子panel。其中基于轉(zhuǎn)座子的nextera技術(shù)盡管速度快，但是數(shù)據(jù)質(zhì)量稍有瑕疵。其他外顯子測序技術(shù)都包括全基因組文庫構(gòu)建和外顯子區(qū)域片段捕獲富集兩個(gè)環(huán)節(jié)，步驟繁多，耗時(shí)長；由于反應(yīng)和純化的環(huán)節(jié)較多，導(dǎo)致dna的損失比較大，因而對模板基因組dna的量的要求都比較高。對于panel測序，主要有兩種技術(shù)路線：探針雜交測序和多重pcr擴(kuò)增子測序。具體選擇哪種方法合適，取決于所需檢測區(qū)域的大小。如果靶區(qū)域比較小，2千到3千對引物就能覆蓋，通常選擇操作比較簡便的多重pcr擴(kuò)增子測序技術(shù)；否則，選擇流程比較復(fù)雜的探針雜交技術(shù)。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明提供一種基于探針捕獲富集的快速構(gòu)建靶核酸測序文庫的方法和試劑盒，包括兩個(gè)部分：建庫方法和建庫試劑盒。本發(fā)明可以改善目前外顯子測序和基因panel靶向測序檢測方法的數(shù)據(jù)質(zhì)量，降低難度，提高檢驗(yàn)速度，可以實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化，使高通量基因檢驗(yàn)更加快速和準(zhǔn)確。本發(fā)明所采取的技術(shù)方案是：一種基于探針捕獲富集的快速構(gòu)建靶核酸測序文庫的方法，其中方法部分包括以下步驟：1)基因組dna片段化；2)dna末端修補(bǔ)；3)生物素標(biāo)記的探針與熱變性形成的單鏈dna片段進(jìn)行分子雜交；4)親和素磁珠分離探針捕獲的dna片段；5)以探針為引物進(jìn)行引物延伸，合成互補(bǔ)鏈；6)雙鏈dna片段一端連接接頭，另一端不連；7)pcr擴(kuò)增；8)dna片段長度選擇。本發(fā)明還提出了一種基于探針捕獲富集的快速構(gòu)建靶核酸測序文庫的試劑盒，包括以下試劑：1)酶切消化dna片段化試劑，或者超聲波破碎dna片段化試劑；2)dna末端修補(bǔ)試劑；3)探針雜交試劑；4)親和素磁珠分離試劑；5)引物延伸試劑；6)接頭連接試劑；7)pcr試劑；8)磁珠法或者瓊脂糖凝膠切割法dna片段長度選擇試劑。其中方法部分的以下3個(gè)步驟，技術(shù)上存在多種可選項(xiàng)，任選其中一種都能實(shí)現(xiàn)相同的目的：1)所述的1)基因組dna片段化，可以用超聲波破碎法，也可以用酶切消化法；2)所述的3)探針雜交，探針可以是單鏈dna，也可以是單鏈rna；3)所述的8)dna片段長度選擇，方法可以用磁珠法，也可以使用瓊脂糖凝膠電泳切割法。本發(fā)明還提供了基于探針捕獲富集的快速構(gòu)建靶核酸測序文庫試劑盒在全外顯子組測序和基因panel靶向測序中的應(yīng)用，包括下述步驟：1)用所述的1)酶切消化試劑，或者超聲波破碎試劑，對基因組dna進(jìn)行片段化；2)用所述的2)dna末端修補(bǔ)試劑修補(bǔ)dna片段的末端；3)用所述的3)探針雜交試劑后進(jìn)行探針雜交；4)用所述的4)親和素磁珠分離試劑分離探針?biāo)东@的外顯子片段或者靶片段；5)用所述的5)引物延伸試劑進(jìn)行引物延伸；6)用所述的6)接頭連接試劑進(jìn)行單端接頭連接；7)用所述的7)pcr試劑進(jìn)行pcr擴(kuò)增；8)用所述的8)磁珠法或者瓊脂糖凝膠切割法dna片段長度選擇試劑進(jìn)行dna片段長度選擇。9)對富集得到的外顯子或者靶核酸文庫進(jìn)行二代高通量測序；10)對測序結(jié)果進(jìn)行分析，獲得受試者的靶核酸基因變異信息。11)本發(fā)明所提供的新型探針捕獲雜交技術(shù)，在操作流程的簡便性方面達(dá)到了擴(kuò)增子測序的水平，集中了二者的長處，既保持了探針雜交的精密度，又達(dá)到了擴(kuò)增子測序的簡便性，而且沒有因此增加額外的缺點(diǎn)。12)與現(xiàn)有的各類靶核酸富集技術(shù)相比，本發(fā)明提供的方法具備以下優(yōu)勢：13)1)數(shù)據(jù)質(zhì)量高，保真性好。由于pcr循環(huán)次數(shù)減少1/3，顯著降低pcr擴(kuò)增引入的人為偏差(bias)。14)2)成功率高，重現(xiàn)性好。技術(shù)路線簡捷明了，反應(yīng)步驟減少，集中了探針雜交捕獲技術(shù)的精密度和擴(kuò)增子測序技術(shù)的簡便性，把探針雜交測序技術(shù)的難度降低到擴(kuò)增子測序的水平。15)3)速度快。文庫構(gòu)建時(shí)間縮短1/3，項(xiàng)目周期縮短。16)4)通用性強(qiáng)。所述方法基于illumina平臺，經(jīng)過適當(dāng)優(yōu)化即可兼容thermofisher高通量測序平臺和自動(dòng)化工作站。附圖說明圖1探針結(jié)構(gòu)示意圖。圖2接頭結(jié)構(gòu)示意圖。圖3快速靶核酸測序文庫構(gòu)建流程圖。具體實(shí)施方式實(shí)施例1cftr基因外顯子區(qū)域富集測序1)基因組dna片段化超聲波破碎和酶切消化兩種方法都可以實(shí)現(xiàn)滿意的基因組dna片段化效果。本實(shí)施案例采用neb公司的nebnextdsdnafragmentase酶切消化方法。1)在0.2mlpcr管中按比例加入下列組分，總體積10μl，稍微渦旋震動(dòng)混勻3sec，無熱蓋37℃孵育35分鐘；2)在pcr管中加入合適體積的磁珠，稍微渦旋混勻，稍微離心，室溫放置5分鐘；3)在磁力架上放置5分鐘；4)在磁力架上，移除管中的上清液，保留5μl溶液，避免觸動(dòng)磁珠沉淀；5)在磁力架上，加入160μl新鮮配制的80％乙醇，靜置30sec，移除160μl洗滌液；6)重復(fù)：在磁力架上，加入160μl新鮮配制的80％乙醇，靜置30sec，移除160μl洗滌液；7)低速離心30sec，在磁力架上小心移除余液，室溫晾干(避免磁珠沉淀開裂)；8)用21μlte重新懸浮磁珠，吹吸5-6次，室溫靜置1分鐘，置于磁力架上5分鐘，將20μl上清液移入新的pcr管中，4℃?zhèn)溆?，也可?20℃保存1周。2.預(yù)先將親和素磁珠m280與生物素標(biāo)記的cg-p3進(jìn)行飽和結(jié)合，形成cg-m280磁珠，在磁力架上靜置5分鐘，移去上清，用te溶液洗滌磁珠沉淀兩次，用te溶液調(diào)整濃度為1μg/μl備用，其中cg-p3:5-tcgtgtagggaaagagtgt-biotin。3.雜交延伸合成下表中的探針序列，其中的4個(gè)n稱之為sid以上探針按照等分子數(shù)混合形成cg-probemixture，最終調(diào)整為0.75fmol/μl按照下列體系配置溶液:純化后的dna片段：20μlcg-probemixture(0.75fmol/μl)：3μlnebuffer2(10x):5μldntp(10mmeach):0.5μl(0.1mmfinal)sterileh2o:18.5μl混合均勻后，95度5分鐘，52度10分鐘，降至37度，加入klenowfragment(3′→5′exo–)(nebm0212):3μl繼續(xù)孵育30分鐘，然后加入10μlcg-m280磁珠，52度10分鐘，置于磁力架上室溫放置5分鐘，te溶液洗滌兩次。4.連接adaptorcg-p1：5-agacgtgtgctcttccgatcddt-3cg-p2-1(其中的6個(gè)n稱之為mid)：gatcggaagagcacacgtctgaactccagtcacnnnnnnatcacgatctcgtatgccgtcttctgcttg-3兩者退火形成cgdaptor，并調(diào)整濃度為1pmol/μl將下列成分加入到含有cg-m280磁珠的pcr管中quickligasereactionbuffer(2x)：10μlquickligase(nebm2200)：1μlcgdaptor(每個(gè)樣本一種cgdaptor):1μlnuclease-freewater：8μl混合均勻后，在25度條件下孵育10分鐘，在磁力架上靜置5分鐘，用te溶液洗滌兩次，用20μl去離子水懸浮磁珠，準(zhǔn)備進(jìn)行pcr擴(kuò)增。5、pcr擴(kuò)增cg-p5:aatgatacggcgaccaccgagatctacactctttccctacacgacg-p7:caagcagaagacggcatacgacg-m280磁珠懸液:20μlcg-p5primer(10μm):2.5μlcg-p7primer(10μm):2.5μlkapahifimix:25μlpcr循環(huán)設(shè)置如下：按照常規(guī)方法進(jìn)行pcr產(chǎn)物純化，并測定產(chǎn)物濃度5.測序與數(shù)據(jù)分析1)我們將pcr產(chǎn)物進(jìn)行二代高通量測序，測定index時(shí)需要進(jìn)行13個(gè)循環(huán)；2)分析時(shí)需要mid和sid標(biāo)簽進(jìn)行分組，以獲得更多的目標(biāo)片段多樣性3)數(shù)據(jù)比對分析如下圖所示：samplegenemeandepth5x20x50x100xduplicateratemappingrateontargetratecg-lib74cftr1178.2699.96％98.65％97.06％94.43％24.85％99.85％30.31％cg-lib71cftr1410.64100.00％99.43％98.08％94.57％31.41％99.82％29.61％cg-lib77cftr1112.88100.00％99.35％98.23％94.91％25.78％99.84％30.52％cg-lib73cftr1286.42100.00％99.75％98.80％95.95％37.89％99.89％30.75％cg-lib70cftr1206.9199.93％99.26％98.44％96.28％30.23％99.88％30.71％cg-lib64cftr709.25100.00％99.87％98.42％97.06％33.33％99.85％30.17％cg-lib42cftr1371.36100.00％99.47％98.17％97.21％38.08％99.88％36.08％cg-lib69cftr1511.62100.00％99.87％98.78％98.00％34.56％99.89％31.58％cg-lib41cftr1454.99100.00％100.00％99.33％98.43％25.86％99.84％30.51％cg-lib65cftr897.0199.87％99.76％99.59％98.53％28.20％99.85％30.97％cg-lib40cftr1481.97100.00％100.00％100.00％99.15％25.32％99.83％30.68％cg-lib43cftr2476.68100.00％100.00％99.90％99.42％39.19％99.79％30.57％cg-lib39cftr1568.28100.00％100.00％99.73％99.45％26.39％99.80％30.78％cg-lib38cftr1718.91100.00％100.00％99.74％99.69％26.53％99.79％30.24％總共14個(gè)測序文庫，平均深度為1384.66x，其中50x深度下平均覆蓋率為98.88％，100x深度下平均覆蓋率為97.36％，說明我們能很好的獲得cftr的基因信息。綜上，本發(fā)明利用探針進(jìn)行目標(biāo)區(qū)域捕獲富集的快速構(gòu)建第二代高通量測序文庫的方法，稱之為accuraseq，可用于全外顯子組測序或特定區(qū)域序列的靶向測序，本發(fā)明步驟包括：1)用于捕獲和富集靶核酸的dna或rna探針的設(shè)計(jì)方法，從5’端到3’端，探針包括生物素標(biāo)記、擴(kuò)增引物、測序引物、靶核酸雜交探針共4個(gè)區(qū)域(如附圖1所示)；2)靶核酸的大規(guī)模捕獲與富集方法；3)用于構(gòu)建靶核酸高通量測序文庫的試劑盒；4)檢測靶核酸的方法。本發(fā)明的應(yīng)用包括以下步驟：1)用超聲波破碎法或者酶切消化法對基因組dna進(jìn)行片段化；2)用酶學(xué)方法修補(bǔ)雙鏈dna片段的末端；3)探針與dna片段進(jìn)行分子雜交；4)用親和素磁珠分離、純化探針捕獲的dna片段；5)以探針為引物進(jìn)行引物延伸，合成互補(bǔ)鏈；6)用酶學(xué)方法在雙鏈dna片段的一端連上接頭，另一端不連，雙鏈接頭包括pcr擴(kuò)增引物、標(biāo)簽序列(barcode)、測序引物、3’端單鏈突出一個(gè)堿基t共4種元件(如附圖2所示)；7)pcr擴(kuò)增；8)對pcr產(chǎn)物進(jìn)行dna片段長度選擇，得到終文庫(如附圖3所示)。與現(xiàn)有的各類靶核酸富集技術(shù)相比，本發(fā)明提供的方法具備以下優(yōu)勢：1)保真性好，提高數(shù)據(jù)質(zhì)量：pcr循環(huán)次數(shù)減少1/3，顯著降低pcr擴(kuò)增引入的偏差(bias)；2)重現(xiàn)性好，提高檢驗(yàn)成功率：流程簡明快捷，反應(yīng)步驟減少，既保持了探針雜交捕獲技術(shù)的精密度，又擁有了擴(kuò)增子測序技術(shù)的簡便性；3)速度快，縮短項(xiàng)目時(shí)間：文庫構(gòu)建所需時(shí)間縮短1/3；4)通用性強(qiáng)，兼容各類高通量基因測序平臺：所述方法基于illumina平臺，經(jīng)過適當(dāng)優(yōu)化即可兼容thermofisher平臺和自動(dòng)化工作站。當(dāng)前第1頁12