本發(fā)明涉及微生物菌株篩選
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及一種阿維拉霉素高產(chǎn)菌株的篩選方法。
背景技術(shù)：
：阿維拉霉素(avilamycin)又稱為卑霉素，可通過與腸道內(nèi)異生的革蘭氏陽性菌的核糖體結(jié)合，抑制相關(guān)蛋白的合成，從而維持整體益生菌群的生態(tài)平衡，同時還可通過抑制腸道微生物乳酸的產(chǎn)生，從而減少腸道蠕動，延遲營養(yǎng)物質(zhì)在動物腸道的停留時間，起到促進(jìn)消化與調(diào)節(jié)代謝的作用，從而促進(jìn)動物生長。阿維拉霉素由于其獨(dú)特的結(jié)構(gòu)、安全性高、易降解、基本無殘留、促生長及抗病等特性在動物飼料特別是豬和肉雞飼料當(dāng)中得以廣泛應(yīng)用。綠色產(chǎn)色鏈霉菌(streptomycesviridochromogene)是阿維拉霉素的產(chǎn)生菌。目前，全球阿維拉霉素的生產(chǎn)被美國禮來公司壟斷，其首先開發(fā)并進(jìn)行銷售的10％預(yù)混劑類型,已在世界40多個國家登記上市。并且我國也在本世紀(jì)初將其引入，商品名為“效美素”(maxus)，而且目前禮來已經(jīng)申請到阿維拉霉素20％預(yù)混劑，在飼料行業(yè)限抗的今天，其市場前景非?？春?。2005年前后，國內(nèi)開始有對阿維拉霉素菌株的選育及發(fā)酵條件的研究報道，然而，相關(guān)的研究尚處于初級階段，產(chǎn)素水平較低，而且發(fā)酵中雜質(zhì)成分多，進(jìn)而對后續(xù)分離純化帶來困難，增加生產(chǎn)成本，究其原因，還是菌株的發(fā)酵水平不行。如何獲得高效積累有效成分的優(yōu)良菌株成為開發(fā)改產(chǎn)品的關(guān)鍵技術(shù)瓶頸。artp(atmosphericandroomtemperatureplasma，artp)誘變技術(shù)是指在常溫常壓環(huán)境下通過產(chǎn)生高活性的等離子體射流，致使細(xì)胞受到多樣性的損傷，從而起到基因突變的效果。artp生物育種技術(shù)正以其操作的簡便性、安全無毒性和高效性等特點(diǎn)得到了廣泛認(rèn)可，并且在微生物育種領(lǐng)域的發(fā)揮著重要作用。s.viridochromogene作為一類放線菌，呈菌絲狀生長，并且以孢子繁殖，而且具有細(xì)胞壁，直接誘變處理，往往處理效果不好，而且會由于菌絲分散不均勻，導(dǎo)致誘變處理效果不佳，另外，孢子的特殊結(jié)構(gòu)往往使得其對誘變劑不敏感，會形成很多的假陽性效果。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：為解決上述問題，本發(fā)明提供了一種阿維拉霉素高產(chǎn)菌株的篩選方法。本發(fā)明首先制備綠色產(chǎn)色鏈霉菌原生質(zhì)體，采用artr系統(tǒng)對原生質(zhì)體進(jìn)行誘變，結(jié)合誘變菌株的形態(tài)特征和菌落抑菌生物效價進(jìn)行初篩，然后通過搖瓶復(fù)篩，以阿維拉霉素抑菌效價及阿維拉霉素a組分含量為指標(biāo)進(jìn)行篩選，篩選得到的菌株具有發(fā)酵穩(wěn)定性高，阿維拉霉素產(chǎn)量高，而且有效組分含量高的優(yōu)點(diǎn)。本發(fā)明降低了制備相關(guān)產(chǎn)品的成本，顯示了非常好的工業(yè)化應(yīng)用潛力。本發(fā)明通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：一種阿維拉霉素高產(chǎn)菌株的篩選方法，包括以下步驟：s1.取活化培養(yǎng)好的綠色產(chǎn)色鏈霉菌斜面一支，作為出發(fā)菌株，加入4～6ml無菌生理鹽水洗脫，制備孢子懸液，并按4％～6％的接種量轉(zhuǎn)入含5％甘氨酸的裝有50ml種子培養(yǎng)基的250ml帶擋板三角搖瓶，27～29℃，210～230rpm繼續(xù)培養(yǎng)24h，培養(yǎng)結(jié)束后，將菌液5000～7000rpm，4℃離心5～10min，磷酸高滲緩沖液清洗兩次，棄去上清，得到原生質(zhì)體制備的出發(fā)菌絲體；s2.以smm溶液作為滲透壓穩(wěn)定劑，在步驟s1制備的出發(fā)菌絲體管中加入終濃度為9mgml-1～15mgml-1溶壁酶5ml，30℃條件下分別酶解45min～75min，溫育結(jié)束后，采用無菌脫脂棉過濾除去未酶解的菌絲，收集濾液，4℃，2000rpm離心10min，棄上清，然后再用smm溶液洗滌離心兩次，最后用3ml的smm溶液重懸細(xì)胞，得到原生質(zhì)體懸液；s3.將步驟s2原生質(zhì)體懸液置于無菌的試管中，進(jìn)行artp誘變：預(yù)設(shè)以氦氣作為工作載氣，設(shè)定功率為115w，通氣量為10lmin-1，等離子發(fā)射源與樣品之間的距離為1～3mm，處理30～50s；s4.將步驟s3artp誘變處理后的原生質(zhì)體涂布于再生平板并置于28℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)3天，選擇菌落大小、形狀、外觀形態(tài)發(fā)生變化的單菌落轉(zhuǎn)接至另外的固體平板，27～29℃繼續(xù)恒溫培養(yǎng)2天，培養(yǎng)結(jié)束后采用滅過菌的的打孔器將單個菌落打下，并置于無菌濕潤的無菌小盤中繼續(xù)培養(yǎng)3天，至菌絲長滿培養(yǎng)基表面；然后取菌落小塊置于含有1％的檢菌的瓊脂平板上，37℃培養(yǎng)24h后觀察并測定瓊脂塊抑菌圈大小，同挑選抑菌圈比出發(fā)菌株大的菌株；s5.將步驟s4篩選獲得的菌落從斜面接種至種子搖瓶，然后再轉(zhuǎn)接發(fā)酵搖瓶，27～29℃，210～230rpm，振蕩培養(yǎng)72h，收集發(fā)酵液；取10ml發(fā)酵液至10ml離心管中，6000×g離心10min，棄上清，甲醇重懸后轉(zhuǎn)移至100ml容量瓶中，40khz頻率超聲40min，冷卻，甲醇定容，0.45μm過濾膜過濾，進(jìn)行生物抑菌效價檢測，同時采用hplc法檢測阿維拉霉素a的含量，挑選出抑菌效價高，阿維拉霉素a的產(chǎn)量高的菌株。優(yōu)選地，步驟s1中所述種子培養(yǎng)基配方及濃度為：可溶性淀粉20.0g/l，豆粕提取粉8.0g/l，大豆蛋白胨5.0g/l，d-木糖7.5g/l，caco30.5g/l，feso40.01g/l，mgso40.5g/l，mncl20.5g/l，naoh調(diào)節(jié)ph7.2-7.5。優(yōu)選地，步驟s1中所述磷酸高滲緩沖液由0.1mol/lph6.0磷酸緩沖液中加入終濃度為0.8mol/l甘露醇制備而成。優(yōu)選地，步驟s2中所述smm緩沖液由以下成分及含量組成：0.5mol/l蔗糖、20mol/lmgc12、0.02mol/l順丁烯二酸鈉鹽，naoh調(diào)ph6.5。優(yōu)選地，步驟s2中加入12mgml-1溶壁酶5ml，30℃條件下酶解60min。優(yōu)選地，步驟s3中artp誘變處理時間為40s。優(yōu)選地，步驟s3再生平板中所用再生培養(yǎng)基為：可溶性淀粉20.0g/l，mgso40.35g/l，kno31.2g/l，k2hpo40.25g/l，kh2po40.55g/l，feso40.01g/l，nacl0.5g/l，瓊脂粉20.0g/l和110g/l的蔗糖，naoh調(diào)節(jié)ph7.2-7.5。優(yōu)選地，步驟s4中所用檢菌為藤黃微球菌。優(yōu)選地，步驟s5中發(fā)酵所用培養(yǎng)基為：可溶性淀粉20.0g/l，豆粕提取粉8.0g/l，大豆蛋白胨5.0g/l，d-木糖7.5g/l，l-纈氨酸3.0g/l，caco30.5g/l，feso40.01g/l，mgso40.5g/l，mncl20.5g/l，naoh調(diào)節(jié)ph7.2-7.5。本發(fā)明以活化斜面孢子懸液接種的搖瓶種子培養(yǎng)24h后獲得的菌體作為出發(fā)菌絲體，采用高效溶壁酶為去壁酶，最佳酶濃度為12mgml-1，最佳酶解時間為60min，所得的原生質(zhì)體數(shù)不僅較多，而且質(zhì)量最好，再生率最高。為獲得更多的細(xì)胞損傷，最大限度的獲得突變菌株庫，以制備的s.viridochromogeneavl4原生質(zhì)體為研究對象，采用artp誘變系統(tǒng)對其進(jìn)行誘變處理，在綜合考慮致死率及菌落數(shù)的條件下，選擇最佳的處理時間40s，并結(jié)合誘變菌株的形態(tài)特征和菌落抑菌生物效價進(jìn)行初篩，獲得生物抑菌效價顯著提高的正突變株，然后通過搖瓶復(fù)篩，以阿維拉霉素抑菌效價及有效成分——阿維拉霉素a組分含量為指標(biāo)，獲得抑菌效價最高，且阿維拉霉素a組分含量最高的菌株。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)：(1)篩選得到的突變株搖瓶發(fā)酵條件下，阿維拉霉素抑菌效價較出發(fā)菌株提高19.3％，其中阿維拉霉素a組分含量提高6.4％，而且斜面轉(zhuǎn)接五代，搖瓶檢測生物抑菌效價，體現(xiàn)了較好的遺傳穩(wěn)定性；(2)對突變株進(jìn)行50l罐的發(fā)酵驗(yàn)證，其阿維拉霉素抑菌效價最高達(dá)4500uml-1，較原始出發(fā)菌株avl4提高27.4％，而且展現(xiàn)了非常好的耐受惡劣環(huán)境的發(fā)酵特性；(3)本研究通過原生質(zhì)體選育獲得的菌株體現(xiàn)了非常優(yōu)良的性能，發(fā)酵穩(wěn)定，發(fā)酵得到的阿維拉霉素產(chǎn)量高，而且有效組分含量高，降低了制備相關(guān)產(chǎn)品的成本，顯示了非常好的工業(yè)化應(yīng)用潛力。說明書附圖圖1：突變株s251的50l罐發(fā)酵曲線；圖2：突變株s251發(fā)酵液中阿維拉霉素hplc分析圖譜。具體實(shí)施方式下面將結(jié)合說明書附圖和實(shí)施例進(jìn)一步的詳細(xì)說明本發(fā)明。需要指出的是，以下說明僅僅是對本發(fā)明要求保護(hù)的技術(shù)方案的舉例說明，并非對這些技術(shù)方案的任何限制。本發(fā)明的保護(hù)范圍以所附權(quán)利要求書記載的內(nèi)容為準(zhǔn)。綠色產(chǎn)色鏈霉菌avl4(streptomycinviridochromogeneavl4)，搖瓶發(fā)酵效價為610uml-1，50l罐最高效價達(dá)3860uml-1，本公司研究院保存。檢菌：藤黃微球菌(micrococcusluteuscicc10209)，購自中國工業(yè)微生物菌種保藏中心。實(shí)施例1培養(yǎng)基及緩沖液的制備方法斜面及固體平板培養(yǎng)基(gl-1)：可溶性淀粉20.0，mgso40.35，kno31.2，k2hpo40.25，kh2po40.55，feso40.01，nacl0.5g/l，瓊脂粉20.0，naoh調(diào)節(jié)ph7.2-7.5，121℃滅菌20min，備用。種子培養(yǎng)基(gl-1)：可溶性淀粉20.0，豆粕提取粉8.0，大豆蛋白胨5.0，d-木糖7.5，caco30.5，feso40.01，mgso40.5，mncl20.5，naoh調(diào)節(jié)ph7.2-7.5，121℃滅菌25min，備用。發(fā)酵培養(yǎng)基(gl-1)：可溶性淀粉20.0，豆粕提取粉8.0，大豆蛋白胨5.0，d-木糖7.5，l-纈氨酸3.0，caco30.5，feso40.01，mgso40.5，mncl20.5，naoh調(diào)節(jié)ph7.2-7.5，121℃滅菌25min，備用。再生培養(yǎng)基(gl-1)：可溶性淀粉20.0，mgso40.35，kno31.2，k2hpo40.25，kh2po40.55，feso40.01，nacl0.5，瓊脂粉20.0和110的蔗糖，naoh調(diào)節(jié)ph7.2-7.5。檢菌液體培養(yǎng)基(gl-1)：蛋白胨5.0g，牛肉浸取物3.0g，nacl5.0g，naoh調(diào)節(jié)ph至7.0，121℃滅菌20min，備用。其中在液體培養(yǎng)基基礎(chǔ)上添加15.0gl-1的瓊脂粉即為固體培養(yǎng)基。磷酸鹽高滲緩沖液：0.1mol/lph6.0磷酸緩沖液.的基礎(chǔ)上加入終濃度為0.8mol/l甘露醇制備而成。smm緩沖液：0.5mol/l蔗糖、20mol/lmgc12、0.02mol/l順丁烯二酸鈉鹽，naoh調(diào)ph6.5，115℃min滅菌18min，備用。實(shí)施例2一種阿維拉霉素高產(chǎn)菌株的篩選方法所述阿維拉霉素高產(chǎn)菌株的篩選方法，包括以下步驟：s1.取活化培養(yǎng)好的綠色產(chǎn)色鏈霉菌種avl4斜面一支，作為出發(fā)菌株，加入5ml無菌生理鹽水洗脫，制備孢子懸液，并按5％的接種量轉(zhuǎn)入含5％甘氨酸的裝有50ml種子培養(yǎng)基的250ml帶擋板三角搖瓶，28℃，220rpm繼續(xù)培養(yǎng)24h，培養(yǎng)結(jié)束后，將菌液6000rpm，4℃離心10min，磷酸高滲緩沖液清洗兩次，棄去上清，得到原生質(zhì)體制備的出發(fā)菌絲體；s2.以smm溶液作為滲透壓穩(wěn)定劑，在步驟s1制備的出發(fā)菌絲體管中加入終濃度為12mgml-1溶壁酶5ml，30℃條件下分別酶解60min，溫育結(jié)束后，采用無菌脫脂棉過濾除去未酶解的菌絲，收集濾液，4℃，2000rpm離心10min，棄上清，然后再用smm溶液洗滌離心兩次，最后用3ml的smm溶液重懸細(xì)胞，得到原生質(zhì)體懸液；s3.將步驟s2原生質(zhì)體懸液置于無菌的試管中，進(jìn)行artp誘變：預(yù)設(shè)以氦氣作為工作載氣，設(shè)定功率為115w，通氣量為10lmin-1，等離子發(fā)射源與樣品之間的距離為2mm，處理40s；s4.將步驟s3artp誘變處理后的原生質(zhì)體涂布于再生平板并置于28℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)3天，選擇菌落大小、形狀、外觀形態(tài)發(fā)生變化的單菌落轉(zhuǎn)接至另外的固體平板，28℃繼續(xù)恒溫培養(yǎng)2天，培養(yǎng)結(jié)束后采用滅過菌的的打孔器將單個菌落打下，并置于無菌濕潤的無菌小盤中繼續(xù)培養(yǎng)3天，至菌絲長滿培養(yǎng)基表面；然后取菌落小塊置于含有1％的檢菌的瓊脂平板上，37℃培養(yǎng)24h后觀察并測定瓊脂塊抑菌圈大小，挑選抑菌圈比出發(fā)菌株大的菌株；s5.將步驟s4篩選獲得的菌落從斜面接種至種子搖瓶，然后再轉(zhuǎn)接發(fā)酵搖瓶，28℃，220rpm，振蕩培養(yǎng)72h，收集發(fā)酵液；取10ml發(fā)酵液至10ml離心管中，6000×g離心10min，棄上清，甲醇重懸后轉(zhuǎn)移至100ml容量瓶中，40khz頻率超聲40min，冷卻，甲醇定容，0.45μm過濾膜過濾，進(jìn)行生物抑菌效價檢測，同時采用hplc法檢測阿維拉霉素a的含量，挑選出抑菌效價高，阿維拉霉素a的產(chǎn)量高的菌株。所用培養(yǎng)基及緩沖液均按實(shí)施例1方法制得。實(shí)施例3一種阿維拉霉素高產(chǎn)菌株的篩選方法所述阿維拉霉素高產(chǎn)菌株的篩選方法，包括以下步驟：s1.取活化培養(yǎng)好的綠色產(chǎn)色鏈霉菌avl4斜面一支，作為出發(fā)菌株，加入4ml無菌生理鹽水洗脫，制備孢子懸液，并按4％的接種量轉(zhuǎn)入含5％甘氨酸的裝有50ml種子培養(yǎng)基的250ml帶擋板三角搖瓶，27℃，210rpm繼續(xù)培養(yǎng)24h，培養(yǎng)結(jié)束后，將菌液5000rpm，4℃離心5min，磷酸高滲緩沖液清洗兩次，棄去上清，得到原生質(zhì)體制備的出發(fā)菌絲體；s2.以smm溶液作為滲透壓穩(wěn)定劑，在步驟s1制備的出發(fā)菌絲體管中加入終濃度為9mgml-1溶壁酶5ml，30℃條件下分別酶解45min，溫育結(jié)束后，采用無菌脫脂棉過濾除去未酶解的菌絲，收集濾液，4℃，2000rpm離心10min，棄上清，然后再用smm溶液洗滌離心兩次，最后用3ml的smm溶液重懸細(xì)胞，得到原生質(zhì)體懸液；s3.將步驟s2原生質(zhì)體懸液置于無菌的試管中，進(jìn)行artp誘變：預(yù)設(shè)以氦氣作為工作載氣，設(shè)定功率為115w，通氣量為10lmin-1，等離子發(fā)射源與樣品之間的距離為2mm，處理30s；s4.將步驟s3artp誘變處理后的原生質(zhì)體涂布于再生平板并置于28℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)3天，選擇菌落大小、形狀、外觀形態(tài)發(fā)生變化的單菌落轉(zhuǎn)接至另外的固體平板，27℃繼續(xù)恒溫培養(yǎng)2天，培養(yǎng)結(jié)束后采用滅過菌的的打孔器將單個菌落打下，并置于無菌濕潤的無菌小盤中繼續(xù)培養(yǎng)3天，至菌絲長滿培養(yǎng)基表面；然后取菌落小塊置于含有1％的檢菌的瓊脂平板上，37℃培養(yǎng)24h后觀察并測定瓊脂塊抑菌圈大小，挑選抑菌圈比出發(fā)菌株大的菌株；s5.將步驟s4篩選獲得的菌落從斜面接種至種子搖瓶，然后再轉(zhuǎn)接發(fā)酵搖瓶，27℃，210rpm，振蕩培養(yǎng)72h，收集發(fā)酵液；取10ml發(fā)酵液至10ml離心管中，6000×g離心10min，棄上清，甲醇重懸后轉(zhuǎn)移至100ml容量瓶中，40khz頻率超聲40min，冷卻，甲醇定容，0.45μm過濾膜過濾，進(jìn)行生物抑菌效價檢測，同時采用hplc法檢測阿維拉霉素a的含量，挑選出抑菌效價高，阿維拉霉素a的產(chǎn)量高的菌株。所用培養(yǎng)基及緩沖液均按實(shí)施例1方法制得。實(shí)驗(yàn)例4一種阿維拉霉素高產(chǎn)菌株的篩選方法所述阿維拉霉素高產(chǎn)菌株的篩選方法，包括以下步驟：s1.取活化培養(yǎng)好的綠色產(chǎn)色鏈霉菌avl4斜面一支，作為出發(fā)菌株，加入4～6ml無菌生理鹽水洗脫，制備孢子懸液，并按6％的接種量轉(zhuǎn)入含5％甘氨酸的裝有50ml種子培養(yǎng)基的250ml帶擋板三角搖瓶，29℃，230rpm繼續(xù)培養(yǎng)24h，培養(yǎng)結(jié)束后，將菌液7000rpm，4℃離心10min，磷酸高滲緩沖液清洗兩次，棄去上清，得到原生質(zhì)體制備的出發(fā)菌絲體；s2.以smm溶液作為滲透壓穩(wěn)定劑，在步驟s1制備的出發(fā)菌絲體管中加入終濃度為15mgml-1溶壁酶5ml，30℃條件下分別酶解75min，溫育結(jié)束后，采用無菌脫脂棉過濾除去未酶解的菌絲，收集濾液，4℃，2000rpm離心10min，去上清，然后再用smm溶液洗滌離心兩次，最后用3ml的smm溶液重懸細(xì)胞，得到原生質(zhì)體懸液；s3.將步驟s2原生質(zhì)體懸液置于無菌的試管中，進(jìn)行artp誘變：預(yù)設(shè)以氦氣作為工作載氣，設(shè)定功率為115w，通氣量為10lmin-1，等離子發(fā)射源與樣品之間的距離為2mm，處理50s；s4.將步驟s3artp誘變處理后的原生質(zhì)體涂布于再生平板并置于28℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)3天，選擇菌落大小、形狀、外觀形態(tài)發(fā)生變化的單菌落轉(zhuǎn)接至另外的固體平板，29℃繼續(xù)恒溫培養(yǎng)2天，培養(yǎng)結(jié)束后采用滅過菌的的打孔器將單個菌落打下，并置于無菌濕潤的無菌小盤中繼續(xù)培養(yǎng)3天，至菌絲長滿培養(yǎng)基表面；然后取菌落小塊置于含有1％的檢菌的瓊脂平板上，37℃培養(yǎng)24h后觀察并測定瓊脂塊抑菌圈大小，挑選抑菌圈比出發(fā)菌株大的菌株；s5.將步驟s4篩選獲得的菌落從斜面接種至種子搖瓶，然后再轉(zhuǎn)接發(fā)酵搖瓶，29℃，230rpm，振蕩培養(yǎng)72h，收集發(fā)酵液；取10ml發(fā)酵液至10ml離心管中，6000×g離心10min，棄上清，甲醇重懸后轉(zhuǎn)移至100ml容量瓶中，40khz頻率超聲40min，冷卻，甲醇定容，0.45μm過濾膜過濾，進(jìn)行生物抑菌效價檢測，同時采用hplc法檢測阿維拉霉素a的含量，挑選出抑菌效價高，阿維拉霉素a的產(chǎn)量高的菌株。所用培養(yǎng)基及緩沖液均按實(shí)施例1方法制得。對比例1一種阿維拉霉素高產(chǎn)菌株的篩選方法所述阿維拉霉素高產(chǎn)菌株的篩選方法與實(shí)施例2的區(qū)別在于步驟s2中加入終濃度為6mgml-1溶壁酶，其它步驟均與實(shí)施例2類似。對比例2一種阿維拉霉素高產(chǎn)菌株的篩選方法所述阿維拉霉素高產(chǎn)菌株的篩選方法與實(shí)施例2的區(qū)別在于步驟s2中酶解時間為90min，其它步驟均與實(shí)施例2類似。試驗(yàn)例1不同制備方法對原生質(zhì)體形成與再生的影響1.試驗(yàn)材料：按實(shí)施例2～4及對比例1～2方法中s2步驟制備得到的原生質(zhì)體懸液。2.試驗(yàn)方法：將上述不同原生質(zhì)體懸液進(jìn)行梯度稀釋后涂布于再生培養(yǎng)基平板上，28℃培養(yǎng)4天，進(jìn)行原生質(zhì)體的再生，計算菌落數(shù)a。另外，進(jìn)行原生質(zhì)體再生的水處理對照實(shí)驗(yàn)，即在原生質(zhì)體懸液中加入9倍無菌水，并在搖床上28℃、50rpm溫育20min。而后梯度稀釋后涂布于再生培養(yǎng)基平板上，同樣28℃培養(yǎng)4天，計算菌落數(shù)b。原生質(zhì)體再生率＝(a-b)/(c-b)×100％，其中c為出發(fā)菌絲體直接用無菌生理鹽水稀釋相同倍數(shù)后在出發(fā)菌株固體培養(yǎng)基的菌落數(shù)。3.試驗(yàn)結(jié)果：試驗(yàn)結(jié)果如表1所示。表1不同制備方法對原生質(zhì)體的影響實(shí)施例1實(shí)施例2實(shí)施例3對比例1對比例2再生率(％)36.222.629.619.516.3原生質(zhì)體數(shù)/×108ml-11.61.11.51.751.86酶濃度過大或酶解時間過長，往往對細(xì)菌的細(xì)胞壁形成過度的水解作用，不僅細(xì)胞壁被酶解，細(xì)胞膜也受到一定程度的損傷，導(dǎo)致原生質(zhì)體的形成量增加了，但再生率卻大大降低，不利于細(xì)胞再生。酶濃度過低或酶解時間不足，酶對菌絲體的有效作用降低，導(dǎo)致酶解不徹底，難以形成原生質(zhì)體。由表1可知，采用單一溶壁酶完全能夠滿足綠色產(chǎn)色鏈霉菌avl4原生質(zhì)體制備的需要，采用12mgml-1的溶壁酶，30℃酶解反應(yīng)60min制備的原生質(zhì)體效果最好，再生率最佳。試驗(yàn)例2阿維拉霉素生物抑菌效價的測定方法和hplc分析1.試驗(yàn)材料：按實(shí)施例2篩選方法初步篩選得到的菌株抑菌圈直徑大于對照菌株的突變株s91、s215。2.試驗(yàn)方法：采用管碟法檢測發(fā)酵液抑菌效價，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線以及樣品的抑菌圈直徑計算樣品的抑菌生物效價。其中，抑菌圈直徑(mm)＝測量直徑-孔徑。取預(yù)處理的樣品20μl，甲醇稀釋5倍后，直接進(jìn)行hplc分析3.試驗(yàn)結(jié)果：試驗(yàn)結(jié)果如表2所示。表2阿拉霉素生物效價由表2可知，管碟法測得的突變菌株s91和s215抑菌圈直徑分別為15.6mm和16.1mm，阿維拉霉素生物效價為705.1uml-1和727.7uml-1，較原始出發(fā)菌株分別提高15.6％和19.3％。中變株s91的阿維拉霉素a含量為521.4μgml-1，占組分含量約73.9％，較原始出發(fā)菌株a的占比含量下降2.9％。菌株s251的阿維拉霉素a含量為589.4μgml-1，占組分含量81％，較原始出發(fā)菌株a含量提高6.4％。試驗(yàn)例3突變株穩(wěn)定性驗(yàn)證1.試驗(yàn)材料：按實(shí)施例2篩選方法篩選得到的s215菌株。2.試驗(yàn)方法：采用斜面?zhèn)鞔姆绞?，連續(xù)轉(zhuǎn)接五代，每一代斜面菌株都進(jìn)行搖瓶發(fā)酵驗(yàn)證抑菌生物效價，每代菌株進(jìn)行三個平行樣。3.試驗(yàn)結(jié)果：試驗(yàn)結(jié)果如表3所示。表3突變株s251的斜面?zhèn)鞔鷮ι镆志r的影響由表3可知，突變株s251傳代過程中生物抑菌效價變化幅度在3％以內(nèi)，而且從傳代的形態(tài)特征來看，菌落形態(tài)、顏色、豐度及顯微形態(tài)都沒有變化，體現(xiàn)了較好的遺傳穩(wěn)定性。試驗(yàn)例450l罐發(fā)酵驗(yàn)證1.試驗(yàn)材料：按實(shí)施例2篩選方法篩選得到的s215菌株。2.試驗(yàn)方法：以搖瓶種作為一級種子，采用三級發(fā)酵工藝，進(jìn)行50l補(bǔ)料分批式發(fā)酵，一級搖瓶種至二級種子罐，移種量控制為5％，二級種子罐至發(fā)酵罐，移種量控制為20％，周期為240h。發(fā)酵罐控制參數(shù)：溫度28℃，通氣量1:1，罐壓0.05mpa，初始攪拌150rpm，流加20％氨水控制ph在7.0-7.2，流加500gl-1葡萄糖溶液控制發(fā)酵過程中葡萄糖濃度在3.0-8.0gl-1通過控制攪拌和補(bǔ)料維持發(fā)酵過程溶氧(do)在20-40％，流加豆油控制發(fā)酵過程中的泡沫，發(fā)酵每隔8小時取樣測定生物量(菌絲體濕重占取樣體積的比例)，發(fā)酵48h后開始檢測阿維拉霉素生物效價，繪制發(fā)酵曲線。3.試驗(yàn)結(jié)果：如圖1所示。由圖1可知，發(fā)酵的前32h，菌體處于適應(yīng)期，菌株的生物量變化都不大，此時以初級代謝為主。發(fā)酵32h之后，變株s251較原始對照菌株avl4的生長速率明顯要快，雖然兩者的最高生物量差不多，都為65％左右，但s251菌株在發(fā)酵80h就達(dá)到了最高生物量，而對照菌株avl4需要96h。80h至發(fā)酵結(jié)束，菌株s251都未出現(xiàn)大幅度的生物量下降，說明s251菌絲體的在發(fā)酵體系的動態(tài)平衡中維持穩(wěn)定的周期長，而此時主要進(jìn)行次級代謝，有利于目標(biāo)產(chǎn)物的合成與積累，而對照菌株avl4在發(fā)酵216h后，生物量出現(xiàn)明顯下降，說明avl4菌株在發(fā)酵環(huán)境開始惡化之后，大部分菌絲體自溶，發(fā)酵體系中平衡被打破，次級代謝能力下降，目標(biāo)產(chǎn)物合成減弱，發(fā)酵不可維持了。整個發(fā)酵過程菌株的生長狀態(tài)都體現(xiàn)了s251菌株較強(qiáng)的菌絲生長優(yōu)勢及發(fā)酵后期的耐惡劣環(huán)境的能力，這對于進(jìn)一步的工業(yè)化放大生產(chǎn)非常有利。從整個發(fā)酵過程中的抑菌效價的增長情況來看，阿維拉霉素的生物合成不但與菌絲體的生長密切相關(guān)，而且在菌株進(jìn)入穩(wěn)定期之后，次級代謝更加活躍。菌株s251阿維拉霉素效價最高在232h，達(dá)到4500uml-1，較對照菌株avl4提高27.4％，體現(xiàn)非常好的產(chǎn)素水平。不僅如此，對照菌株avl4在生物量下降之后，抑菌效價也顯著降低，這可能是菌株在發(fā)酵后期，無效成分大量合成，有效成分比例下降，導(dǎo)致抑菌效價降低，而變株s251未出現(xiàn)此類現(xiàn)象，更進(jìn)一步說明變株s251較好的發(fā)酵環(huán)境耐受性。綜上所述，本發(fā)明通過原生質(zhì)體選育獲得的菌株體現(xiàn)了非常優(yōu)良的性能，發(fā)酵穩(wěn)定，發(fā)酵得到的阿維拉霉素產(chǎn)量高，而且有效組分含量高，降低了制備相關(guān)產(chǎn)品的成本，顯示了非常好的工業(yè)化應(yīng)用潛力。當(dāng)前第1頁12