本發(fā)明涉及細胞免疫治療領域，更特別地，涉及一種靶向表達cd33表面抗原的細胞的嵌合抗原受體及其編碼序列和表達載體。

背景技術：

cd33是一個白細胞分化抗原,具有364個氨基酸的跨膜糖蛋白，與唾液酸粘附素家族的成員具有序列同源性，該家族包括髓鞘相關糖蛋白和cd22，以及唾液酸粘附素本身。它可被骨髓祖細胞、單核細胞、巨噬細胞、粒細胞前體等細胞表達。盡管cd33的特殊功能還不清楚，但其與唾液酸粘附素的同源性提示其在凝集素家族的碳水化合物結合特性中的作用，這種作用隨后被證實。臨床研究顯示，cd33可在超過80％的急性骨髓性白血病(aml)病例中呈陽性表達。由于cd33的選擇性表達，結合細胞毒類藥物的免疫偶聯物，能特異識別和結合cd33的單克隆抗體，已經被建議用于選擇性靶向aml細胞。

細胞免疫治療是一種正在興起的治療腫瘤或惡性疾病的方法，其通過分子生物學技術構建嵌合抗原受體(chimericantigenreceptor，car)的表達載體，并將該表達載體導入到從人體分離的免疫細胞中，使其細胞表面表達car后，將其回輸至人體。表達car的免疫細胞能夠特異性識別靶細胞，并對其進行殺傷。

在這種治療方法中，car的作用至關重要。嵌合抗原受體包括單鏈抗體結構域、跨膜結構域、胞內信號結構域。其中，單鏈抗體結構域將免疫細胞靶向目標細胞，胞內信號結構域釋放胞內信號，啟動免疫細胞的殺傷活性。

技術實現要素：

為解決以上問題，本發(fā)明提供了一種靶向表達cd33表面抗原的細胞的嵌合抗原受體，其特征在于，包含cd33結合結構域、跨膜結構域和細胞內信號結構域，所述cd33結合結構域的氨基酸序列如seqidno:1所示。

優(yōu)選地，所述跨膜結構域為cd8，其氨基酸序列序列如seqidno:2所示。

優(yōu)選地，所述細胞內信號結構域由cd28、4-1bb和cd3組成，其氨基酸序列如seqidno:3所示。

本發(fā)明還提供了一種編碼上述嵌合抗原受體的核酸，其序列如seqidno:4所示。

本發(fā)明還提供了一種表達上述嵌合抗原受體的重組表達載體，其包括嵌合抗原受體表達框和復制系統(tǒng)，所述嵌合抗原受體表達框由可在t細胞中表達的啟動子和位于所述啟動子下游的編碼所述嵌合抗原受體的核酸組成。

優(yōu)選地，所述啟動子為巨細胞病毒啟動子、sv40啟動子、ef1alpha啟動子或rsv啟動子。

優(yōu)選地，所述重組表達載體通過將所述編碼嵌合抗原受體的核酸插入慢病毒表達載體中的cmv啟動子得到。

通過將本發(fā)明的嵌合抗原受體表達于t細胞中可使得到cart細胞能夠有效并且特異性地靶向表達cd33表面抗原的惡性細胞，從而為治療一些表達cd33表面抗原的惡性疾病，例如aml等，提供更高效并且副作用和不良反應更少的方法。

附圖說明

圖1為實施例中編碼cd33嵌合抗原受體的dna片段的示意圖；

圖2為cart細胞、gart細胞和t細胞對高表達cd33的aml細胞的殺傷活性統(tǒng)計圖；

圖3為cart細胞、gart細胞和t細胞對不表達cd33的人成纖維細胞bj的殺傷活性統(tǒng)計圖。

具體實施方式

以下結合實例對本發(fā)明的原理和特征進行描述，所舉實例只用于解釋本發(fā)明，并非用于限定本發(fā)明的范圍。

1.cd33scfv嵌合抗原受體表達質粒的構建

通過人工合成seqidno:4所示的長度為1605bp的dna片段，其中，第1-801位的核苷酸編碼cd33scfv，第802-936位的核苷酸編碼cd8鉸鏈區(qū)，第937-1140位的核苷酸編碼cd28，第1141-1266位的核苷酸編碼41bb，第1267-1605位的核苷酸編碼cd3(圖1)。后面三個區(qū)域構成胞內信號區(qū)。

將上述dna片段插入慢病毒表達載體plvx-ires-puro的cmv啟動子下游，得到cd33scfv嵌合抗原受體表達質粒。

2.cd33scfv嵌合抗原受體表達質粒轉染t細胞

1)慢病毒的包裝制備

將cd33scfv嵌合抗原受體表達質粒和輔助質粒pspax2、pmd2.g以4:3:1的比例用lipo2000轉染試劑(invitrogen)轉染，具體方法見lipo2000轉染試劑說明書。轉染48小時后，將含有病毒的細胞培養(yǎng)上清吸入ep管中，4℃2000g離心10min，轉移上清至新ep管中，0.45μm濾器過濾后-80℃保存.

2)t細胞的制備

取10ml健康人的新鮮血液，用淋巴細胞分離液(mediatech)分離外周血單核細胞，具體方法見說明書。用含有300iu/ml的il-2、50ng/ml的okt-3和5％人ab血清(invitrogen)的aim-v培養(yǎng)基(invitrogen)誘導培養(yǎng)48h，得到t細胞。

3)慢病毒感染t細胞及感染后t細胞的擴增培養(yǎng)

從-80℃取出2ml病毒液，加入終濃度為8μg/ml的聚凝胺(購自sigma公司)，用該病毒液重懸1×10⁶個上述誘導培養(yǎng)的t細胞。將細胞懸液加入24孔板的1個孔中，1000g，32℃，離心1h。37℃，5％co2培養(yǎng)箱內培養(yǎng)8h后，1000g，32℃，再次離心1h。吸棄1.4ml培養(yǎng)上清，加入1.4ml新鮮的含有300iu/ml的il-2、50ng/ml的okt-3和5％人ab血清的aim-v培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)。每2-3天檢測一次細胞密度，當細胞密度達到2×10⁶個/ml時，吸取1ml細胞懸液，加入另一個孔中，分別向兩個孔中加入1ml新鮮的含有300iu/ml的il-2和5％人ab血清的aim-v培養(yǎng)基，繼續(xù)擴大培養(yǎng)。如此反復，直至細胞擴增至足夠的用量。

檢驗cd33scfv嵌合抗原受體在t細胞中有效表達后，即獲得針對cd33的cart細胞。

3.cart細胞的對cd33陽性的惡性細胞的特異性殺傷活性

分別取5×10⁴個aml細胞(高表達cd33)和人成纖維細胞bj接種于96孔板，過夜培養(yǎng)后，分別向兩種細胞培養(yǎng)孔中按效應細胞(e)：靶細胞(t)＝10:1和3:1的比例加入car-t細胞、對照病毒修飾的t細胞(gfp-t)和未加修飾的t細胞(t)。孵育5h后，按照ldh細胞毒性分析試劑盒(caymanchemical)說明書進行操作，檢測cart細胞對aml細胞的特異殺傷活性。結果顯示cart細胞組與gfp-t組和t細胞組相比，在效靶比為10:1和3:1的情況下，對高表達cd33的aml細胞都具有更強的殺傷作用，且這種差異具有顯著性(p<0.05)(圖2)；對不表達cd33的人成纖維細胞bj的殺傷作用無顯著性差異(p>0.05)(圖3)。因此cart細胞對高表達cd33的aml細胞具有特異殺傷活性。

序列表

<110>武漢波睿達生物科技有限公司

<120>一種靶向表達cd33表面抗原的細胞的嵌合抗原受體

<130>1

<160>4

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<212>prt

<213>人工序列

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