本發(fā)明涉及一種基因多態(tài)性的檢測產(chǎn)品以及該產(chǎn)品所用到的引物、探針、檢測體系，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

單核苷酸多態(tài)性(snps)是人類和動物的基因組中普遍存在的一種分子標(biāo)記，通常是特定位點(diǎn)存在兩個等位基因,研究表明，基因多態(tài)性與某些基因組dna的修復(fù)功能有關(guān)，分子水平的疾病診斷可對腫瘤個體化治療和預(yù)后判斷提供指導(dǎo)。

切除修復(fù)交叉互補(bǔ)基團(tuán)1(ercc1)是核苷酸切除修復(fù)途徑(ner)的關(guān)鍵酶，而核苷酸切除修復(fù)是人類最重要的dna損傷修復(fù)機(jī)制，可以防止基因突變，主要修復(fù)累積性損傷，可切除幾乎一切導(dǎo)致dna螺旋扭曲的大分子致癌物。研究表明，ercc1基因多態(tài)性可以影響核酸切除修復(fù)過程，并使其功能異常，基因不穩(wěn)定增加，導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。ercc1基因常見的一個單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)是第四外顯子的118c>t多態(tài)性位點(diǎn)，該密碼子c→t的產(chǎn)生的變異雖然屬于同義突變，但是能夠影響ercc`蛋白水平的表達(dá)，即t等位基因的腫瘤患者的mrna水平更高。臨床上通過檢測ercc1的基因多態(tài)性，有助于幫助腫瘤患者預(yù)測鉑類藥物化療的預(yù)后，指導(dǎo)用藥和個性化治療。目前主要測采用一代測序、flp、等位基因特異的寡核苷酸雜交、等位基因特異的pcr和基因芯片等技術(shù)，但是操作過程繁瑣，需要更換反應(yīng)管而易發(fā)生污染，多需要電泳和多步后處理，影響檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。或儀器設(shè)備昂貴，難以大規(guī)模推廣應(yīng)用。

傳統(tǒng)的巢式pcr反應(yīng)由于有2次pcr擴(kuò)增，不但耗時、開管操作極易造成交叉污染導(dǎo)致假陽性及結(jié)果的不準(zhǔn)確性，而檢測結(jié)果需要電泳及凝膠成像系統(tǒng)才能看到結(jié)果，從而降低了擴(kuò)增多個靶點(diǎn)的可能性，從pcr到檢測結(jié)果出來大約需要5h，主要應(yīng)用于分子生物學(xué)領(lǐng)域和醫(yī)學(xué)檢測研究中。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種能在樣本初始模板量低的條件下準(zhǔn)確檢測出樣本基因ercc1的c118t多態(tài)位點(diǎn)的基因型的ercc1基因多態(tài)性檢測試劑盒，以及該試劑盒所用的檢測體系。

本發(fā)明為解決上述技術(shù)問題提出的一種技術(shù)方案是：一種ercc1基因多態(tài)性檢測體系，包括檢測引物對、檢測探針和肽核酸，

所述檢測引物對包括檢測ercc1基因c118t多態(tài)性位點(diǎn)外側(cè)的核苷酸序列如seqidno.1所示的外側(cè)上游引物、檢測ercc1基因c118t多態(tài)性位點(diǎn)外側(cè)的核苷酸序列如seqidno.2所示的外側(cè)下游引物、檢測ercc1基因c118t多態(tài)性位點(diǎn)內(nèi)側(cè)的核苷酸序列如seqidno.3所示的內(nèi)側(cè)上游引物、檢測ercc1基因c118t多態(tài)性位點(diǎn)內(nèi)側(cè)的核苷酸序列如seqidno.4所示的內(nèi)側(cè)下游引物；所述外側(cè)上下游引物引入脫氧次黃嘌呤；

所述檢測探針包括檢測ercc1基因c118t多態(tài)性位點(diǎn)為野生型的核苷酸序列如seqidno.7所示的野生型探針和檢測ercc1基因c118t多態(tài)性位點(diǎn)為純合子的核苷酸序列如seqidno.8所示的純合子探針；所述野生型探針和純合子探針引入脫氧次黃嘌呤和錯配堿基；所述肽核酸包括與檢測ercc1基因c118t多態(tài)性位點(diǎn)的內(nèi)側(cè)上游引物部分互補(bǔ)的核苷酸序列如seqidno.5所示的肽核酸和與檢測ercc1基因c118t多態(tài)性位點(diǎn)的內(nèi)側(cè)下游引物部分互補(bǔ)的核苷酸序列如seqidno.6所示的肽核酸。

上述ercc1基因多態(tài)性檢測體系還包括內(nèi)參引物對、內(nèi)參探針、質(zhì)控引物對和質(zhì)控探針；

所述內(nèi)參引物上游引物的核苷酸序列如seqidno.9所示，所述內(nèi)參下游引物的核苷酸序列如seqidno.10所示，所述內(nèi)參探針的核苷酸序列如seqidno.11所示；

所述質(zhì)控上游引物的核苷酸序列如seqidno.12所示，所述質(zhì)控下游引物的核苷酸序列如seqidno.13所示，所述質(zhì)控探針的核苷酸序列如seqidno.14所示。

上述各個探針的5’端設(shè)有熒光報告基團(tuán)，所述各個探針的3’端設(shè)有熒光淬滅基團(tuán)；所述熒光報告基團(tuán)是fam、hex、rox或cy5，所述熒光淬滅基團(tuán)是bhq1、bhq2或tamra。

上述外側(cè)上下游引物在反應(yīng)體系中的最終濃度0.05μm/l，所述內(nèi)側(cè)上下游引物在反應(yīng)體系中的最終濃度0.19μm/l，所述肽核酸在反應(yīng)體系中的最終濃度為1nm/l，所述野生型探針在反應(yīng)體系中的最終濃度為0.19μm/l，所述純合子探針在反應(yīng)體系中的最終濃度為0.19μm/l；

所述質(zhì)控引物對在反應(yīng)體系中的最終濃度為0.19μm/l，所述內(nèi)參引物對在反應(yīng)體系中的最終濃度為0.19μm/l，所述內(nèi)參探針在反應(yīng)體系中的最終濃度為0.19μm/l，所述質(zhì)控探針在反應(yīng)體系中的最終濃度為0.19μm/l。

上述ercc1基因多態(tài)性檢測體系還包括甲酰胺，反應(yīng)體系中加入甲酰胺的體積是反應(yīng)體系總體積的12％。

本發(fā)明為解決上述技術(shù)問題提出的另一種技術(shù)方案是：一種采用上述檢測體系的ercc1基因多態(tài)性檢測產(chǎn)品。

本發(fā)明為解決上述技術(shù)問題提出的另一種技術(shù)方案是：一種ercc1基因多態(tài)性檢測試劑盒，包括pcr檢測液、質(zhì)控檢測液、陽性對照和陰性對照；

所述pcr檢測液包括檢測引物對、檢測探針和肽核酸；

所述檢測引物對包括檢測ercc1基因c118t多態(tài)性位點(diǎn)外側(cè)的核苷酸序列如seqidno.1所示的外側(cè)上游引物、檢測ercc1基因c118t多態(tài)性位點(diǎn)外側(cè)的核苷酸序列如seqidno.2所示的外側(cè)下游引物、檢測ercc1基因c118t多態(tài)性位點(diǎn)內(nèi)側(cè)的核苷酸序列如seqidno.3所示的內(nèi)側(cè)上游引物、檢測ercc1基因c118t多態(tài)性位點(diǎn)內(nèi)側(cè)的核苷酸序列如seqidno.4所示的內(nèi)側(cè)下游引物；所述外側(cè)上下游引物引入脫氧次黃嘌呤；

所述檢測探針包括檢測ercc1基因c118t多態(tài)性位點(diǎn)為野生型的核苷酸序列如seqidno.7所示的野生型探針和檢測ercc1基因c118t多態(tài)性位點(diǎn)為純合子的核苷酸序列如seqidno.8所示的純合子探針；所述野生型探針和純合子探針引入脫氧次黃嘌呤和錯配堿基；

所述肽核酸包括與檢測ercc1基因c118t多態(tài)性位點(diǎn)的內(nèi)側(cè)上游引物部分互補(bǔ)的核苷酸序列如seqidno.5所示的肽核酸和與檢測ercc1基因c118t多態(tài)性位點(diǎn)的內(nèi)側(cè)下游引物部分互補(bǔ)的核苷酸序列如seqidno.6所示的肽核酸；

所述質(zhì)控檢測液包括內(nèi)參引物對、內(nèi)參探針、質(zhì)控引物對和質(zhì)控探針；

所述內(nèi)參引物上游引物的核苷酸序列如seqidno.9所示，所述內(nèi)參下游引物的核苷酸序列如seqidno.10所示，所述內(nèi)參探針的核苷酸序列如seqidno.11所示；

所述質(zhì)控上游引物的核苷酸序列如seqidno.12所示，所述質(zhì)控下游引物的核苷酸序列如seqidno.13所示，所述質(zhì)控探針的核苷酸序列如seqidno.14所示；

所述陽性對照液是濃度為野生型質(zhì)粒和純合子質(zhì)粒的混合溶液；

所述陰性對照液是濃度為不含ercc1基因野生型、雜合子和純合子的質(zhì)粒溶液。

上述pcr檢測液和質(zhì)控檢測液中還包括pcr緩沖液、2.5mm的dntps和5u/μl的taqdna聚合酶；所述pcr緩沖液包括100mm的tris-hcl、15mm的kcl和15mm的mgcl2，用于配置所述pcr緩沖液的tris-hcl緩沖液的ph值為8.3；所述dntps包括datp、dgtp、dctp和dttp。

上述外側(cè)上下游引物在反應(yīng)體系中的最終濃度0.05μm/l，所述內(nèi)側(cè)上下游引物在反應(yīng)體系中的最終濃度0.19μm/l，所述肽核酸在反應(yīng)體系中的最終濃度為1nm/l，所述野生型探針在反應(yīng)體系中的最終濃度為0.19μm/l，所述純合子探針在反應(yīng)體系中的最終濃度為0.19μm/l；

所述質(zhì)控引物對在反應(yīng)體系中的最終濃度為0.19μm/l，所述內(nèi)參引物對在反應(yīng)體系中的最終濃度為0.19μm/l，所述內(nèi)參探針在反應(yīng)體系中的最終濃度為0.19μm/l，所述質(zhì)控探針在反應(yīng)體系中的最終濃度為0.19μm/l。

上述ercc1基因多態(tài)性檢測試劑盒還包括甲酰胺，反應(yīng)體系中加入甲酰胺的體積是反應(yīng)體系總體積的12％。

本發(fā)明具有積極的效果：

(1)本發(fā)明的ercc1基因多態(tài)性檢測體系及其試劑盒，采用特異引物探針組合，采用改進(jìn)后的巢氏pcr，增加了檢測的敏感性和可靠性，閉管操作降低污染，具有高的靈敏度，靈敏度可達(dá)到0.5％～1％，與常規(guī)pcr的濃度相比，辦發(fā)明容易地檢測出非常低濃度樣本的ercc1c118t位點(diǎn)的基因型。可以為鉑類藥物的臨床用藥提供指導(dǎo)。

(2)本發(fā)明的保留了原有的熒光定量的高敏感性和特異性的基礎(chǔ)上，極大地縮短了實驗時間，提高檢測效率，節(jié)約樣本，并且本發(fā)明的基因多態(tài)性檢測試劑盒，采用金標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行對照實驗，基因型符合率≥99％，分子分型準(zhǔn)確度高。

(3)本發(fā)明設(shè)計了內(nèi)參和質(zhì)控對檢測的整個檢測過程監(jiān)控，確保樣本可檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性與可靠性。

附圖說明

圖1采用實施例的試劑盒檢測陽性對照擴(kuò)增曲線。

圖2采用實施例的試劑盒檢測野生樣本擴(kuò)增曲線。

圖3采用實施例的試劑盒檢測純合樣本擴(kuò)增曲線。

圖4采用實施例的試劑盒檢測雜合樣本擴(kuò)增曲線。

具體實施方式

下面通過實施例對本發(fā)明進(jìn)行具體的描述，有必要在此指出的是以下實施例只用于對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步說明，不能理解為對本發(fā)明保護(hù)范圍的限制，該領(lǐng)域的技術(shù)人員可以根據(jù)上述本發(fā)明內(nèi)容對本發(fā)明作出一些非本質(zhì)的改進(jìn)和調(diào)整。下述實施例中，若非特意表明，所用的試劑均為分析純，所用試劑均可從商業(yè)渠道獲得。文中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件如j.薩姆布魯克等編著的科學(xué)出版社2002年出版的《分子克隆實驗指南》一書中所述的條件，或按照制造商所建議的條件。除非另行定義，文中所使用的所有專業(yè)與科學(xué)用語與本領(lǐng)域熟練人員所熟悉的意義相同。此外，任何與所記載內(nèi)容相似或均等的方法及材料皆可應(yīng)用于本發(fā)明中。

實施例

一、試劑盒的組成。

本實施例的ercc1基因多態(tài)性檢測試劑盒包括：pcr檢測液、質(zhì)控檢測液、陽性對照和陰性對照，具體成分如表1所示。

表1試劑盒組成表

上述表1中試劑盒各組分的說明如下：

pcr檢測液由10×pcr緩沖液、dntps、熱啟動酶、引物探針肽核酸混合液配制而成。10×pcr緩沖液包括100mm的tris-hcl、500mm的kcl和15mm的mgcl2，用于配置pcr緩沖液的tris-hcl緩沖液的ph值為8.3。dntps包括datp、dgtp、dctp和dttp，在反應(yīng)體系中終濃度為0.2mm。熱啟動酶是使用濃度為5u/μl的taqdna聚合酶，在反應(yīng)體系中終濃度0.05u/μl。10×pcr緩沖液、dntps和熱啟動酶均來自takara(貨號：r007a)。

引物探針肽核酸混合液包括檢測ercc1基因的c118t位點(diǎn)的外側(cè)上游引物、檢測ercc1基因的c118t位點(diǎn)的外側(cè)下游引物、檢測ercc1基因的c118t位點(diǎn)的內(nèi)側(cè)上游引物、檢測ercc1基因的c118t位點(diǎn)的內(nèi)側(cè)下游引物、針對ercc1基因的c118t位點(diǎn)的內(nèi)側(cè)上游引物的肽核酸、針對ercc1基因的c118t位點(diǎn)的內(nèi)側(cè)下游引物的肽核酸、檢測ercc1基因的c118t位點(diǎn)的野生型探針、檢測ercc1基因的c118t位點(diǎn)的純合子探針，其核苷酸序列見表2，均由上海百力格生物技術(shù)有限公司合成。

外側(cè)引物在反應(yīng)體系中的最終濃度為0.05μm/l，內(nèi)側(cè)引物在反應(yīng)體系中的最終濃度為0.19μm/l，肽核酸在反應(yīng)體系最終的濃度為1nm/l，檢測ercc1基因的c118t位點(diǎn)的野生型探針和檢測ercc1基因的c118t位點(diǎn)的純合子探針在最終反應(yīng)體系中的最終濃度為0.19μm/l。為了減少非特異性擴(kuò)增，提高檢測的特異性和靈敏度，本實施例的檢測反應(yīng)體系中還加入12％甲酰胺試劑。

質(zhì)控液由10×pcr緩沖液、dntps、熱啟動酶、引物對和探針混合液配制而成。10×pcr緩沖液包括100mm的tris-hcl、500mm的kcl和15mm的mgcl2，用于配置pcr緩沖液的tris-hcl緩沖液的ph值為8.3。dntps包括datp、dgtp、dctp和dttp，在反應(yīng)體系中終濃度為0.2mm。熱啟動酶是使用濃度為5u/μl的taqdna聚合酶，在反應(yīng)體系中終濃度0.05u/μl。10×pcr緩沖液、dntps和熱啟動酶均來自takara(貨號：r007a)。

質(zhì)控引物探針混合液包括內(nèi)參上游引物、內(nèi)參下游引物、內(nèi)參探針、質(zhì)控上游引物、質(zhì)控下游引物、質(zhì)控探針，其核苷酸序列見表2，均由上海生工生物工程有限公司合成。內(nèi)參引物和探針在反應(yīng)體系的最終濃度為0.19μm/l，質(zhì)控引物和探針在反應(yīng)體系的最終濃度為0.19μm/l。為了減少非特異性擴(kuò)增，提高檢測的特異性和靈敏度，本實施例的質(zhì)控反應(yīng)體系中加入12％甲酰胺試劑。

陽性對照液是濃度為10ng/μl的野生型質(zhì)粒和10ng/μl的純合子質(zhì)粒的混合溶液。

陰性對照液是濃度為10ng/μl不含ercc1基因野生型、雜合子和純合子的質(zhì)粒溶液。

野生型質(zhì)粒的獲取為野生型質(zhì)粒常規(guī)構(gòu)建步驟：設(shè)計位于突變位點(diǎn)兩側(cè)的引物，擴(kuò)增含對應(yīng)位點(diǎn)的野生型產(chǎn)物，構(gòu)建入質(zhì)粒，挑選并測序驗證。

純合子質(zhì)粒的獲取為純合子質(zhì)粒常規(guī)構(gòu)建步驟：設(shè)計一條覆蓋相應(yīng)多態(tài)性位點(diǎn)并將等位堿基引入到引物序列中的特異引物，與相對應(yīng)的上游或下游野生型引物配對，擴(kuò)增含相應(yīng)位點(diǎn)的目的片段產(chǎn)物，構(gòu)建入質(zhì)粒，挑選并測序驗證。

上述引物、探針和肽核酸的核苷酸序列如表2所示。

表2引物、探針、肽核酸序列表

ercc1外側(cè)引物是針對ercc1基因的c118t多態(tài)性位點(diǎn)兩側(cè)產(chǎn)物長度約300-500bp的引物，ercc1內(nèi)側(cè)引物是針對ercc1基因的c118t多態(tài)性位點(diǎn)兩側(cè)產(chǎn)物長度約90-150bp的引物，為了使外側(cè)引物先于內(nèi)側(cè)引物與dna模板結(jié)合，外側(cè)引物引入脫氧次黃嘌呤，ercc1內(nèi)側(cè)肽核酸是針對ercc1基因的c118t多態(tài)性位點(diǎn)內(nèi)側(cè)的上游引物和內(nèi)側(cè)下游引物設(shè)計的dna類似物，肽核酸部分序列與內(nèi)側(cè)引物重合，能夠先于內(nèi)側(cè)上游引物與dna模板結(jié)合，從而在反應(yīng)初始階段抑制了內(nèi)側(cè)引物的擴(kuò)增，ercc1野生型探針和ercc1純合子探針是針對ercc1基因的c118t多態(tài)性位點(diǎn)設(shè)計的特異性探針，探針的5’端標(biāo)記有熒光信號基團(tuán)，熒光信號基團(tuán)有fam、hex、rox、cy5等，探針的3’端標(biāo)記有熒光淬滅基團(tuán)，熒光淬滅基團(tuán)包括bhq1、bhq2、tamra等，由于野生型探針和純合子探針序列只相差一個堿基，特異性較低，本發(fā)明將脫氧次黃嘌呤引入到檢測多態(tài)性檢測特異性探針中，并在探針的3’端引入1個錯配堿基，在一定程度上提高探針的特異性。內(nèi)參引物探針是區(qū)別于ercc1的gapdh基因，針對gapdh基因保守區(qū)域，通過檢測內(nèi)參基因的擴(kuò)增，可分析實驗結(jié)果有效性。

本實施例的野生型探針的熒光信號基團(tuán)是fam，純合子探針的熒光信號基團(tuán)是hex。

質(zhì)控基因的引物設(shè)計是排除ercc1基因外側(cè)引物以外的ercc1基因其他位置保守區(qū)域，質(zhì)控引物探針不享受突變檢測位點(diǎn)引物和引物結(jié)合位點(diǎn)，在保守區(qū)域不同區(qū)段設(shè)計引物探針，質(zhì)控序列擴(kuò)增在本發(fā)明中作用除了可校正諸如dna含量、標(biāo)本內(nèi)pcr聚合酶抑制物，不同反應(yīng)管間擴(kuò)增效率的差異，還用于通過比較基因型和質(zhì)控的擴(kuò)增情況確定樣本基因型。

二、試劑盒的使用方法。

本實施例的ercc1基因多態(tài)性檢測試劑盒的具體檢測步驟如下：

1、樣本dna提取。

采用試劑盒(axygenmultisourcegenomicdnaminiprepkit)提取樣本血液樣本dna，或者采用康為世紀(jì)生物科技有限公司的口腔拭子基因組dna提取試劑盒(貨號：cw0530s)抽提口腔黏膜樣本dna，具體的操作參見試劑盒產(chǎn)品說明書。

2、樣本dna質(zhì)量檢測。

獲得樣本dna后，通過thermo-fisher核酸蛋白定量儀(nanodrop2000)測定濃度和純度，控制樣本質(zhì)量，最終加入反應(yīng)體系中的樣本。od260/od280的比值在1.8～2.0之間的可獲得最優(yōu)反應(yīng)結(jié)果，濃度稀釋為5～20ng/μl。

3、pcr反應(yīng)。

采用本實施例的ercc1(c118t)基因多態(tài)性檢測試劑盒試進(jìn)行檢測，反應(yīng)體系的體積為10μl，試劑盒各組分的使用濃度及在反應(yīng)體系中的終濃度詳見表1。(反應(yīng)體系的體積還可以是20μl，在配制時將10μl反應(yīng)體系中的組分翻倍即可)。

1)配制10μl的質(zhì)控pcr反應(yīng)體系和10μl的檢測pcr反應(yīng)體系：

質(zhì)控pcr反應(yīng)體系：取9μl的質(zhì)控檢測液和1μl樣本dna。檢測pcr反應(yīng)體系：別取9μl的檢測試劑和1μl模板(如果是dna樣本，濃度5～20ng/μl)，并設(shè)置重復(fù)。

反應(yīng)體系中的模板分別指對應(yīng)的樣本dna，陽性對照，陰性對照，空白對照，空白對照液為超純水。

2)pcr反應(yīng)程序。

各反應(yīng)體系在abi實時熒光定量pcr擴(kuò)增儀(stepone)上進(jìn)行實時熒光pcr反應(yīng)，最優(yōu)反應(yīng)程序如表3所示。

表3pcr反應(yīng)程序表

優(yōu)選地，pcr擴(kuò)增的條件為：預(yù)變性階段的條件95℃，10min；循環(huán)1，10個循環(huán)，條件為95℃15s，退火溫度55℃，時間為10秒，延伸溫度72℃，時間30秒；循環(huán)2，30個循環(huán)，條件為94℃15s，退火溫度60℃，時間為10秒；循環(huán)3條件為4℃保溫。本發(fā)明為了防止循環(huán)段2較長的片段的非特異性擴(kuò)增，不設(shè)置延伸程序。

4、pcr結(jié)果判定。

1)試劑盒有效性的判定。

陽性對照：陽性對照fam和hex信號通道所有的擴(kuò)增曲線有明顯的指數(shù)增長期，且ct值均陽性≤25。

陰性對照：陰性對照fam、hex信號通道所有的擴(kuò)增曲線無明顯的指數(shù)增長期，或ct值均陰性≥40。

空白對照：空白對照陰性對照fam、hex信號通道所有的擴(kuò)增曲線無明顯的指數(shù)增長期。

2)檢測樣本有效性的判定。

根據(jù)內(nèi)參fam通道和質(zhì)控hex通道的ct值進(jìn)行判定：

內(nèi)參gapdh的fam信號通道擴(kuò)增曲線呈s型，但ct<18，或者ct>32，檢測結(jié)果無效；

內(nèi)參gapdh的fam信號通道擴(kuò)增曲線不呈s型，但且18≤ct≤32之間，樣本檢測結(jié)果無效；

內(nèi)參gapdh的fam信號通道擴(kuò)增曲線呈s型，并且18≤ct≤32之間，樣本有效。

質(zhì)控ercc1的hex信號通道擴(kuò)增曲線呈s型，且ct＜20，則樣本基因組加入過量，建議稀釋后重新檢測；

質(zhì)控ercc1的hex信號通道擴(kuò)增曲線呈s型，20≤ct≤30，樣本加入量適中，適合進(jìn)行結(jié)果判定；

質(zhì)控ercc1的hex信號通道擴(kuò)增曲線呈s型，ct＞30,則樣本基因組加入量低，不能穩(wěn)定的進(jìn)行突變結(jié)果判定。

3)多態(tài)性結(jié)果的判定。

通過以上步驟，確定檢測樣本和實驗結(jié)果均有效的前提下，再對樣本的結(jié)果進(jìn)行判定。野生基因型檢測是檢測反應(yīng)液中fam信號通道的擴(kuò)增情況，純合基因型檢測是檢測反應(yīng)液中hex信號通道的擴(kuò)增情況。按照以下步驟對樣本檢測結(jié)果進(jìn)行判讀，確定樣本基因型。

a.若檢測液中有fam信號通道的擴(kuò)增曲線有明顯的指數(shù)增長期，hex信號通道的擴(kuò)增曲線無明顯的指數(shù)增長期，且20≤ct≤35，則檢測樣本為野生型。

b.若檢測液中有hex信號通道的擴(kuò)增曲線有明顯的指數(shù)增長期，fam信號通道的擴(kuò)增曲線無明顯的指數(shù)增長期，且20≤ct≤35，則檢測樣本為純合型。

c.若檢測液中有fam和hex信號通道的擴(kuò)增曲線均有明顯的指數(shù)增長期，且|ct(檢測fam)-ct(檢測hex)|≤5，則檢測樣本為雜合型。

d.若檢測液中有fam和hex信號通道的擴(kuò)增曲線均有明顯的指數(shù)增長期，|ct(檢測fam)-ct(檢測hex)|>5，則將檢測的較小的ct值與質(zhì)控ct比較，兩者之間的差記做△△ct，若△△ct＝|ct(檢測fam/hex)-ct(質(zhì)控hex)|≤8，則為ct值較小檢測結(jié)果基因型，若△△ct＝|ct(檢測fam/hex)-ct(質(zhì)控hex)|>8,重新檢測。

顯然，上述實施例僅僅是為清楚地說明本發(fā)明所作的舉例，而并非是對本發(fā)明的實施方式的限定。對于所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在上述說明的基礎(chǔ)上還可以做出其它不同形式的變化或變動。這里無需也無法對所有的實施方式予以窮舉。而這些屬于本發(fā)明的精神所引伸出的顯而易見的變化或變動仍處于本發(fā)明的保護(hù)范圍之中。

sequencelisting

<110>上海賽安生物醫(yī)藥科技股份有限公司

<120>ercc1基因多態(tài)性檢測體系及其試劑盒

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