本發(fā)明涉及一種基因多態(tài)性的檢測產(chǎn)品以及該產(chǎn)品所用到的引物、探針、檢測體系，屬于生物
技術(shù)領(lǐng)域：
。
背景技術(shù)：
：基因組dna在某一特定的核苷酸位置上發(fā)生轉(zhuǎn)換、顛換、插入或缺失，并且其在群體中出現(xiàn)的頻率≥1％，稱為單核苷酸多態(tài)性(snp)，基因多態(tài)性與某些基因組dna的修復(fù)功能有關(guān)，多態(tài)性可以顯著影響個(gè)體對藥物的敏感性，分子水平的疾病診斷可對腫瘤個(gè)體化治療和預(yù)后判斷提供指導(dǎo)。氫葉酸還原酶(dhfr)是甲氨蝶呤(mtx)靶標(biāo)酶，dhfr是細(xì)胞內(nèi)葉酸代謝的關(guān)鍵酶，mtx抗腫瘤作用的基本原理是競爭性結(jié)合dhfr，使二氫葉酸不能被還原成四氫葉酸。研究發(fā)現(xiàn)dhfr基因多態(tài)性829位點(diǎn)發(fā)生c>t突變，而后兩者導(dǎo)致了dhfr蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的改變，進(jìn)而影響dhfr與mtx結(jié)合的空間結(jié)構(gòu)，最終引起dhfr和mtx親和力的下降，提高了細(xì)胞的抗藥性，dhfr的c829t單核苷酸多態(tài)性檢測，有助于臨床醫(yī)生制定更具針對性的個(gè)體治療方案，獲得較佳效果的同時(shí)也減輕患者的經(jīng)濟(jì)與身體負(fù)擔(dān)。目前主要測采用一代測序、flp、等位基因特異的寡核苷酸雜交、等位基因特異的pcr和基因芯片等技術(shù)，但是操作過程繁瑣，需要更換反應(yīng)管而易發(fā)生污染，多需要電泳和多步后處理，影響檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。或儀器設(shè)備昂貴，難以大規(guī)模推廣應(yīng)用。傳統(tǒng)的巢式pcr反應(yīng)由于有2次pcr擴(kuò)增，不但耗時(shí)、開管操作極易造成交叉污染導(dǎo)致假陽性及結(jié)果的不準(zhǔn)確性，而檢測結(jié)果需要電泳及凝膠成像系統(tǒng)才能看到結(jié)果，從而降低了擴(kuò)增多個(gè)靶點(diǎn)的可能性，從pcr到檢測結(jié)果出來大約需要5h，主要應(yīng)用于分子生物學(xué)領(lǐng)域和醫(yī)學(xué)檢測研究中。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種能在樣本初始模板量低的條件下準(zhǔn)確檢測出樣本基因dhfr的c829t多態(tài)位點(diǎn)的基因型的dhfr基因多態(tài)性檢測試劑盒，以及該試劑盒所用的檢測體系。本發(fā)明為解決上述技術(shù)問題提出的一種技術(shù)方案是：1、一種dhfr基因多態(tài)性檢測體系，包括檢測引物對、檢測探針和肽核酸，所述檢測引物對包括檢測dhfr基因c829t多態(tài)性位點(diǎn)外側(cè)的核苷酸序列如seqidno.1所示的外側(cè)上游引物、檢測dhfr基因c829t多態(tài)性位點(diǎn)外側(cè)的核苷酸序列如seqidno.2所示的外側(cè)下游引物、檢測dhfr基因c829t多態(tài)性位點(diǎn)內(nèi)側(cè)的核苷酸序列如seqidno.3所示的內(nèi)側(cè)上游引物、檢測dhfr基因c829t多態(tài)性位點(diǎn)內(nèi)側(cè)的核苷酸序列如seqidno.4所示的內(nèi)側(cè)下游引物；所述外側(cè)上下游引物引入脫氧次黃嘌呤；所述檢測探針包括檢測dhfr基因c829t多態(tài)性位點(diǎn)為野生型的核苷酸序列如seqidno.7所示的野生型探針和檢測dhfr基因c829t多態(tài)性位點(diǎn)為純合子的核苷酸序列如seqidno.8所示的純合子探針；所述野生型探針和純合子探針引入脫氧次黃嘌呤和錯(cuò)配堿基；所述肽核酸包括與檢測dhfr基因c829t多態(tài)性位點(diǎn)的內(nèi)側(cè)上游引物部分互補(bǔ)的核苷酸序列如seqidno.5所示的肽核酸和與檢測dhfr基因c829t多態(tài)性位點(diǎn)的內(nèi)側(cè)下游引物部分互補(bǔ)的核苷酸序列如seqidno.6所示的肽核酸。上述dhfr基因多態(tài)性檢測體系還包括內(nèi)參引物對、內(nèi)參探針、質(zhì)控引物對和質(zhì)控探針；所述內(nèi)參引物上游引物的核苷酸序列如seqidno.9所示，所述內(nèi)參下游引物的核苷酸序列如seqidno.10所示，所述內(nèi)參探針的核苷酸序列如seqidno.11所示；所述質(zhì)控上游引物的核苷酸序列如seqidno.12所示，所述質(zhì)控下游引物的核苷酸序列如seqidno.13所示，所述質(zhì)控探針的核苷酸序列如seqidno.14所示。上述各個(gè)探針的5’端設(shè)有熒光報(bào)告基團(tuán)，所述各個(gè)探針的3’端設(shè)有熒光淬滅基團(tuán)；所述熒光報(bào)告基團(tuán)是fam、hex、rox或cy5，所述熒光淬滅基團(tuán)是bhq1、bhq2或tamra。上述外側(cè)上下游引物在反應(yīng)體系中的最終濃度0.05μm/l，所述內(nèi)側(cè)上下游引物在反應(yīng)體系中的最終濃度0.19μm/l，所述肽核酸在反應(yīng)體系中的最終濃度為1nm/l，所述野生型探針在反應(yīng)體系中的最終濃度為0.19μm/l，所述純合子探針在反應(yīng)體系中的最終濃度為0.19μm/l；所述質(zhì)控引物對在反應(yīng)體系中的最終濃度為0.19μm/l，所述內(nèi)參引物對在反應(yīng)體系中的最終濃度為0.19μm/l，所述內(nèi)參探針在反應(yīng)體系中的最終濃度為0.19μm/l，所述質(zhì)控探針在反應(yīng)體系中的最終濃度為0.19μm/l。上述dhfr基因多態(tài)性檢測體系還包括甲酰胺，反應(yīng)體系中加入甲酰胺的體積是反應(yīng)體系總體積的12％。本發(fā)明為解決上述技術(shù)問題提出的另一種技術(shù)方案是：一種采用上述檢測體系的dhfr基因多態(tài)性檢測產(chǎn)品。本發(fā)明為解決上述技術(shù)問題提出的另一種技術(shù)方案是：一種dhfr基因多態(tài)性檢測試劑盒，包括pcr檢測液、質(zhì)控檢測液、陽性對照和陰性對照；所述pcr檢測液包括檢測引物對、檢測探針和肽核酸；所述檢測引物對包括檢測dhfr基因c829t多態(tài)性位點(diǎn)外側(cè)的核苷酸序列如seqidno.1所示的外側(cè)上游引物、檢測dhfr基因c829t多態(tài)性位點(diǎn)外側(cè)的核苷酸序列如seqidno.2所示的外側(cè)下游引物、檢測dhfr基因c829t多態(tài)性位點(diǎn)內(nèi)側(cè)的核苷酸序列如seqidno.3所示的內(nèi)側(cè)上游引物、檢測dhfr基因c829t多態(tài)性位點(diǎn)內(nèi)側(cè)的核苷酸序列如seqidno.4所示的內(nèi)側(cè)下游引物；所述外側(cè)上下游引物引入脫氧次黃嘌呤；所述檢測探針包括檢測dhfr基因c829t多態(tài)性位點(diǎn)為野生型的核苷酸序列如seqidno.7所示的野生型探針和檢測dhfr基因c829t多態(tài)性位點(diǎn)為純合子的核苷酸序列如seqidno.8所示的純合子探針；所述野生型探針和純合子探針引入脫氧次黃嘌呤和錯(cuò)配堿基；所述肽核酸包括與檢測dhfr基因c829t多態(tài)性位點(diǎn)的內(nèi)側(cè)上游引物部分互補(bǔ)的核苷酸序列如seqidno.5所示的肽核酸和與檢測dhfr基因c829t多態(tài)性位點(diǎn)的內(nèi)側(cè)下游引物部分互補(bǔ)的核苷酸序列如seqidno.6所示的肽核酸；所述質(zhì)控檢測液包括內(nèi)參引物對、內(nèi)參探針、質(zhì)控引物對和質(zhì)控探針；所述內(nèi)參引物上游引物的核苷酸序列如seqidno.9所示，所述內(nèi)參下游引物的核苷酸序列如seqidno.10所示，所述內(nèi)參探針的核苷酸序列如seqidno.11所示；所述質(zhì)控上游引物的核苷酸序列如seqidno.12所示，所述質(zhì)控下游引物的核苷酸序列如seqidno.13所示，所述質(zhì)控探針的核苷酸序列如seqidno.14所示；所述陽性對照液是濃度為野生型質(zhì)粒和純合子質(zhì)粒的混合溶液；所述陰性對照液是濃度為不含dhfr基因野生型、雜合子和純合子的質(zhì)粒溶液。上述pcr檢測液和質(zhì)控檢測液中還包括pcr緩沖液、2.5mm的dntps和5u/μl的taqdna聚合酶；所述pcr緩沖液包括100mm的tris-hcl、15mm的kcl和15mm的mgcl2，用于配置所述pcr緩沖液的tris-hcl緩沖液的ph值為8.3；所述dntps包括datp、dgtp、dctp和dttp。上述外側(cè)上下游引物在反應(yīng)體系中的最終濃度0.05μm/l，所述內(nèi)側(cè)上下游引物在反應(yīng)體系中的最終濃度0.19μm/l，所述肽核酸在反應(yīng)體系中的最終濃度為1nm/l，所述野生型探針在反應(yīng)體系中的最終濃度為0.19μm/l，所述純合子探針在反應(yīng)體系中的最終濃度為0.19μm/l；所述質(zhì)控引物對在反應(yīng)體系中的最終濃度為0.19μm/l，所述內(nèi)參引物對在反應(yīng)體系中的最終濃度為0.19μm/l，所述內(nèi)參探針在反應(yīng)體系中的最終濃度為0.190μm/l，所述質(zhì)控探針在反應(yīng)體系中的最終濃度為0.19μm/l。上述dhfr基因多態(tài)性檢測試劑盒，還包括甲酰胺，反應(yīng)體系中加入甲酰胺的體積是反應(yīng)體系總體積的12％。本發(fā)明具有積極的效果：(1)本發(fā)明的dhfr基因多態(tài)性檢測體系及其試劑盒，采用特異引物探針組合，采用改進(jìn)后的巢氏pcr，增加了檢測的敏感性和可靠性，閉管操作降低污染，具有高的靈敏度，靈敏度可達(dá)到0.5％～1％，與常規(guī)pcr的濃度相比，辦發(fā)明容易地檢測出非常低濃度樣本的dhfr(c829t)位點(diǎn)的基因型，可以為甲氨蝶呤藥物的臨床用藥提供指導(dǎo)。(2)本發(fā)明的保留了原有的熒光定量的高敏感性和特異性的基礎(chǔ)上，極大地縮短了實(shí)驗(yàn)時(shí)間，提高檢測效率，節(jié)約樣本，并且本發(fā)明的基因多態(tài)性檢測試劑盒，采用金標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行對照實(shí)驗(yàn)，基因型符合率≥99％，分子分型準(zhǔn)確度高。(3)本發(fā)明設(shè)計(jì)了內(nèi)參和質(zhì)控對檢測的整個(gè)檢測過程監(jiān)控，確保樣本可檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性與可靠性。附圖說明圖1采用實(shí)施例的試劑盒檢測陽性對照擴(kuò)增曲線。圖2采用實(shí)施例的試劑盒檢測野生樣本擴(kuò)增曲線。圖3采用實(shí)施例的試劑盒檢測純合樣本擴(kuò)增曲線。圖4采用實(shí)施例的試劑盒檢測雜合樣本擴(kuò)增曲線。具體實(shí)施方式下面通過實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行具體的描述，有必要在此指出的是以下實(shí)施例只用于對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步說明，不能理解為對本發(fā)明保護(hù)范圍的限制，該領(lǐng)域的技術(shù)人員可以根據(jù)上述本
發(fā)明內(nèi)容對本發(fā)明作出一些非本質(zhì)的改進(jìn)和調(diào)整。下述實(shí)施例中，若非特意表明，所用的試劑均為分析純，所用試劑均可從商業(yè)渠道獲得。文中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件如j.薩姆布魯克等編著的科學(xué)出版社2002年出版的《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》一書中所述的條件，或按照制造商所建議的條件。除非另行定義，文中所使用的所有專業(yè)與科學(xué)用語與本領(lǐng)域熟練人員所熟悉的意義相同。此外，任何與所記載內(nèi)容相似或均等的方法及材料皆可應(yīng)用于本發(fā)明中。實(shí)施例一、試劑盒的組成。本實(shí)施例的dhfr(c829t)基因多態(tài)性檢測試劑盒包括：pcr檢測液、質(zhì)控檢測液、陽性對照、陰性對照，具體成分如表1所示。表1試劑盒組成表上述表1中試劑盒各組分的說明如下：pcr檢測液由10×pcr緩沖液、dntps、熱啟動(dòng)酶、引物對、探針和肽核酸混合液配制而成。10×pcr緩沖液包括100mm的tris-hcl、500mm的kcl和15mm的mgcl2，用于配置pcr緩沖液的tris-hcl緩沖液的ph值為8.3。dntps包括datp、dgtp、dctp和dttp，在反應(yīng)體系中終濃度為0.2mm。熱啟動(dòng)酶是使用濃度為5u/μl的taqdna聚合酶，在反應(yīng)體系中終濃度0.05u/μl。10×pcr緩沖液、dntps和熱啟動(dòng)酶均來自takara(貨號：r007a)。引物探針肽核酸混合液包括檢測dhfr(c829t)的外側(cè)上游引物、檢測dhfr(c829t)的外側(cè)下游引物、檢測dhfr(c829t)的內(nèi)側(cè)上游引物、檢測dhfr(c829t)的內(nèi)側(cè)下游引物、針對dhfr(c829t)的內(nèi)側(cè)上游引物的肽核酸、針對dhfr(c829t)的內(nèi)側(cè)下游引物的肽核酸、檢測dhfr(c829t)的野生型探針、檢測dhfr(c829t)的純合子探針，序列見表2，均由上海百力格生物技術(shù)有限公司合成。外側(cè)引物在反應(yīng)體系中的最終濃度為0.05μm/l，內(nèi)側(cè)引物在反應(yīng)體系中的最終濃度為0.19μm/l，肽核酸在反應(yīng)體系最終的濃度為1nm/l，檢測dhfr(c829t)野生型探針和檢測dhfr(c829t)純合子探針在最終反應(yīng)體系中的最終濃度為0.19μm/l。為了減少非特異性擴(kuò)增，提高檢測的特異性和靈敏度，在本發(fā)明的檢測反應(yīng)體系中加入12％甲酰胺試劑。質(zhì)控液由10×pcr緩沖液、dntps、熱啟動(dòng)酶、引物對和探針混合液配制而成。10×pcr緩沖液包括100mm的tris-hcl、500mm的kcl和15mm的mgcl2，用于配置pcr緩沖液的tris-hcl緩沖液的ph值為8.3。dntps包括datp、dgtp、dctp和dttp，在反應(yīng)體系中終濃度為0.2mm。熱啟動(dòng)酶是使用濃度為5u/μl的taqdna聚合酶，在反應(yīng)體系中終濃度0.05u/μl。10×pcr緩沖液、dntps和熱啟動(dòng)酶均來自takara(貨號：r007a)。引物探針混合液包括檢測內(nèi)參上游引物、檢測內(nèi)參的下游引物、檢測內(nèi)參的探針、檢測質(zhì)控上游引物、檢測質(zhì)控下游引物、檢測質(zhì)控的探針，序列見表2，引物、探針及肽核酸均由上海生工生物工程有限公司合成。內(nèi)參引物和探針在反應(yīng)體系的最終濃度為0.19μm/l，質(zhì)控引物和探針在反應(yīng)體系的最終濃度為0.19μm/l。為了減少非特異性擴(kuò)增，提高檢測的特異性和靈敏度，在本發(fā)明的質(zhì)控反應(yīng)體系中加入12％甲酰胺試劑。陽性對照液是濃度為10ng/μl的野生型質(zhì)粒和10ng/μl的純合子質(zhì)粒的混合溶液。陰性對照液是濃度為10ng/μl不含dhfr基因野生型、雜合子和純合子的質(zhì)粒溶液。野生型質(zhì)粒的獲取為野生型質(zhì)粒常規(guī)構(gòu)建步驟：設(shè)計(jì)位于突變位點(diǎn)兩側(cè)的引物，擴(kuò)增含對應(yīng)位點(diǎn)的野生型產(chǎn)物，構(gòu)建入質(zhì)粒，挑選并測序驗(yàn)證。純合子質(zhì)粒的獲取為純合子質(zhì)粒常規(guī)構(gòu)建步驟：設(shè)計(jì)一條覆蓋相應(yīng)多態(tài)性位點(diǎn)并將等位堿基引入到引物序列中的特異引物，與相對應(yīng)的上游或下游野生型引物配對，擴(kuò)增含相應(yīng)位點(diǎn)的目的片段產(chǎn)物，構(gòu)建入質(zhì)粒，挑選并測序驗(yàn)證。上游引物、下游引物、探針和肽核酸的核苷酸序列如表2所示。表2引物、探針、肽核酸序列表引物探針名稱seqno.核苷酸序列(5’-3’)dhfr外側(cè)上游引物1tgatgtccaggaggagaaaggdhfr外側(cè)下游引物2ctggatatacacgtaggaagcdhfr內(nèi)側(cè)上游引物3actaagtgcttctccaagacdhfr內(nèi)側(cè)下游引物4acaatgtcaaggactggcdhfr內(nèi)側(cè)上游肽核酸5tgcttctccaagacdhfr內(nèi)側(cè)下游肽核酸6caatgtcaaggactdhfr野生型探針7actgagtccccagcacctactacdhfr純合子探針8ctgagtccccagcacctcctat內(nèi)參上游引物9tgtaggagggacttagagaag內(nèi)參下游引物10accctttagggagaaaacgct內(nèi)參探針11cctgccctttgagtttgatgat質(zhì)控上游引物12ctttgtcacccaggctagtg質(zhì)控下游引物13cacgatggtgtgtgcctataa質(zhì)控探針14cactgtctcactgtagcctcdhfr外側(cè)引物是針對dhfr(c829t)多態(tài)性位點(diǎn)兩側(cè)產(chǎn)物長度約300-500bp的引物，dhfr內(nèi)側(cè)引物是針對dhfr(c829t)多態(tài)性位點(diǎn)兩側(cè)產(chǎn)物長度約90-150bp的引物，為了使外側(cè)引物先于內(nèi)側(cè)引物與dna模板結(jié)合，外側(cè)引物引入脫氧次黃嘌呤，dhfr內(nèi)側(cè)肽核酸是針對dhfr(c829t)多態(tài)性位點(diǎn)內(nèi)側(cè)的上游引物和內(nèi)側(cè)下游引物設(shè)計(jì)的dna類似物，肽核酸部分序列與內(nèi)側(cè)引物重合，能夠先于內(nèi)側(cè)上游引物與dna模板結(jié)合，從而在反應(yīng)初始階段抑制了內(nèi)側(cè)引物的擴(kuò)增，dhfr野生型探針和dhfr純合子探針是針對dhfr(c829t)多態(tài)性位點(diǎn)設(shè)計(jì)的特異性探針，探針的5’端標(biāo)記有熒光信號基團(tuán)，熒光信號基團(tuán)有fam、hex、rox、cy5等，探針的3’端標(biāo)記有熒光淬滅基團(tuán)，熒光淬滅基團(tuán)包括bhq1、bhq2、tamra等，由于野生型探針和純合子探針序列只相差一個(gè)堿基，特異性較低，本發(fā)明將脫氧次黃嘌呤引入到檢測多態(tài)性檢測特異性探針中，并在探針的3’端引入1個(gè)錯(cuò)配堿基，在一定程度上提高探針的特異性。本實(shí)施例的野生型探針的熒光信號基團(tuán)是fam，純合子探針的熒光信號基團(tuán)是hex。內(nèi)參引物探針是區(qū)別于dhfr的gapdh基因，通過檢測內(nèi)參基因的擴(kuò)增，可分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果有效性。質(zhì)控基因的引物設(shè)計(jì)是排除dhfr基因外側(cè)引物以外的dhfr基因其他位置保守區(qū)域，質(zhì)控引物探針不享受突變檢測位點(diǎn)引物和引物結(jié)合位點(diǎn)，在保守區(qū)域不同區(qū)段設(shè)計(jì)引物探針，質(zhì)控序列擴(kuò)增在本發(fā)明中作用除了可校正諸如dna含量、標(biāo)本內(nèi)pcr聚合酶抑制物，不同反應(yīng)管間擴(kuò)增效率的差異，還用于通過比較基因型和質(zhì)控的擴(kuò)增情況確定樣本基因型。二、試劑盒的使用方法。本實(shí)施例的dhfr(c829t)基因多態(tài)性檢測試劑盒的具體檢測步驟如下：1、樣本dna提取。采用試劑盒(axygenmultisourcegenomicdnaminiprepkit)提取樣本血液樣本dna，或者采用康為世紀(jì)生物科技有限公司的口腔拭子基因組dna提取試劑盒(貨號：cw0530s)抽提口腔黏膜樣本dna，具體的操作參見試劑盒產(chǎn)品說明書。2、樣本dna質(zhì)量檢測。獲得樣本dna后，通過thermo-fisher核酸蛋白定量儀(nanodrop2000)測定濃度和純度，控制樣本質(zhì)量，最終加入反應(yīng)體系中的樣本。od260/od280的比值在1.8～2.0之間的可獲得最優(yōu)反應(yīng)結(jié)果，濃度稀釋為5～20ng/μl。3、pcr反應(yīng)。采用本實(shí)施例的dhfr(c829t)基因多態(tài)性檢測試劑盒試進(jìn)行檢測，反應(yīng)體系的體積為10μl，試劑盒各組分的使用濃度及在反應(yīng)體系中的終濃度詳見表1。(反應(yīng)體系的體積還可以是20μl，在配制時(shí)將10μl反應(yīng)體系中的組分翻倍即可)。1)配制10μl的質(zhì)控pcr反應(yīng)體系和10μl的檢測pcr反應(yīng)體系：質(zhì)控pcr反應(yīng)體系：取9μl的質(zhì)控檢測液和1μl樣本dna。檢測pcr反應(yīng)體系：別取9μl的檢測試劑和1μl模板(如果是dna樣本，濃度5～20ng/μl)，并設(shè)置重復(fù)。反應(yīng)體系中的模板分別指對應(yīng)的樣本dna，陽性對照，陰性對照，空白對照，空白對照液為超純水。2)pcr反應(yīng)程序。各反應(yīng)體系在abi實(shí)時(shí)熒光定量pcr擴(kuò)增儀(stepone)上進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光pcr反應(yīng)，最優(yōu)反應(yīng)程序如表3所示。表3pcr反應(yīng)程序表優(yōu)選地，pcr擴(kuò)增的條件為：預(yù)變性階段的條件95℃，10min；循環(huán)1，10個(gè)循環(huán)，條件為95℃15s，退火溫度55℃，時(shí)間為10秒，延伸溫度72℃，時(shí)間30秒；循環(huán)2，30個(gè)循環(huán)，條件為94℃15s，退火溫度60℃，時(shí)間為10秒；循環(huán)3條件為4℃保溫。本發(fā)明為了防止循環(huán)段2較長的片段的非特異性擴(kuò)增，不設(shè)置延伸程序。4、pcr結(jié)果判定。1)試劑盒有效性的判定。陽性對照：陽性對照fam和hex信號通道所有的擴(kuò)增曲線有明顯的指數(shù)增長期，且ct值均陽性≤25。陰性對照：陰性對照fam、hex信號通道所有的擴(kuò)增曲線無明顯的指數(shù)增長期，或ct值均陰性≥40。空白對照：空白對照陰性對照fam、hex信號通道所有的擴(kuò)增曲線無明顯的指數(shù)增長期。2)檢測樣本有效性的判定。根據(jù)內(nèi)參fam通道和質(zhì)控hex通道的ct值進(jìn)行判定：內(nèi)參gapdh的fam信號通道擴(kuò)增曲線呈s型，但ct<18，或者ct>32，檢測結(jié)果無效；內(nèi)參gapdh的fam信號通道擴(kuò)增曲線不呈s型，但且18≤ct≤32之間，樣本檢測結(jié)果無效；內(nèi)參gapdh的fam信號通道擴(kuò)增曲線呈s型，并且18≤ct≤32之間，樣本有效。質(zhì)控dhfr的hex信號通道擴(kuò)增曲線呈s型，且ct＜20，則樣本基因組加入過量，建議稀釋后重新檢測；質(zhì)控dhfr的hex信號通道擴(kuò)增曲線呈s型，20≤ct≤30，樣本加入量適中，適合進(jìn)行結(jié)果判定；質(zhì)控dhfr的hex信號通道擴(kuò)增曲線呈s型，ct＞30,則樣本基因組加入量低，不能穩(wěn)定的進(jìn)行突變結(jié)果判定。3)多態(tài)性結(jié)果的判定。通過以上步驟，確定檢測樣本和實(shí)驗(yàn)結(jié)果均有效的前提下，再對樣本的結(jié)果進(jìn)行判定。野生基因型檢測是檢測反應(yīng)液中fam信號通道的擴(kuò)增情況，純合基因型檢測是檢測反應(yīng)液中hex信號通道的擴(kuò)增情況。按照以下步驟對樣本檢測結(jié)果進(jìn)行判讀，確定樣本基因型。a.若檢測液中有fam信號通道的擴(kuò)增曲線有明顯的指數(shù)增長期，hex信號通道的擴(kuò)增曲線無明顯的指數(shù)增長期，且20≤ct≤35，則檢測樣本為野生型。b.若檢測液中有hex信號通道的擴(kuò)增曲線有明顯的指數(shù)增長期，fam信號通道的擴(kuò)增曲線無明顯的指數(shù)增長期，且20≤ct≤35，則檢測樣本為純合型。c.若檢測液中有fam和hex信號通道的擴(kuò)增曲線均有明顯的指數(shù)增長期，且|ct(檢測fam)-ct(檢測hex)|≤5，則檢測樣本為雜合型。d.若檢測液中有fam和hex信號通道的擴(kuò)增曲線均有明顯的指數(shù)增長期，|ct(檢測fam)-ct(檢測hex)|>5，則將檢測的較小的ct值與質(zhì)控ct比較，兩者之間的差記做△△ct，若△△ct＝|ct(檢測fam/hex)-ct(質(zhì)控hex)|≤8，則為ct值較小檢測結(jié)果基因型，若△△ct＝|ct(檢測fam/hex)-ct(質(zhì)控hex)|>8,重新檢測。顯然，上述實(shí)施例僅僅是為清楚地說明本發(fā)明所作的舉例，而并非是對本發(fā)明的實(shí)施方式的限定。對于所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在上述說明的基礎(chǔ)上還可以做出其它不同形式的變化或變動(dòng)。這里無需也無法對所有的實(shí)施方式予以窮舉。而這些屬于本發(fā)明的精神所引伸出的顯而易見的變化或變動(dòng)仍處于本發(fā)明的保護(hù)范圍之中。sequencelisting<110>上海賽安生物醫(yī)藥科技股份有限公司<120>dhfr基因多態(tài)性檢測體系及其試劑盒<130>無<160>14<170>patentinversion3.3<210>1<211>21<212>dna<213>人工合成<400>1tgatgtccaggaggagaaagg21<210>2<211>21<212>dna<213>人工合成<400>2ctggatatacacgtaggaagc21<210>3<211>20<212>dna<213>人工合成<400>3actaagtgcttctccaagac20<210>4<211>18<212>dna<213>人工合成<400>4acaatgtcaaggactggc18<210>5<211>14<212>dna<213>人工合成<400>5tgcttctccaagac14<210>6<211>14<212>dna<213>人工合成<400>6caatgtcaaggact14<210>7<211>23<212>dna<213>人工合成<400>7actgagtccccagcacctactac23<210>8<211>22<212>dna<213>人工合成<400>8ctgagtccccagcacctcctat22<210>9<211>21<212>dna<213>人工合成<400>9tgtaggagggacttagagaag21<210>10<211>21<212>dna<213>人工合成<400>10accctttagggagaaaacgct21<210>11<211>22<212>dna<213>人工合成<400>11cctgccctttgagtttgatgat22<210>12<211>20<212>dna<213>人工合成<400>12ctttgtcacccaggctagtg20<210>13<211>21<212>dna<213>人工合成<400>13cacgatggtgtgtgcctataa21<210>14<211>20<212>dna<213>人工合成<400>14cactgtctcactgtagcctc20當(dāng)前第1頁12