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多功能轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子CTCF的DNA結(jié)合位點(diǎn)CTCF_13的應(yīng)用的制作方法

文檔序號:11230155閱讀:748來源:國知局

本發(fā)明公開了一種多功能轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子ctcf的dna結(jié)合位點(diǎn)ctcf_13的應(yīng)用。



背景技術(shù):

結(jié)直腸癌是世界上發(fā)病率和死亡率最高的癌癥之一,其是由結(jié)腸上皮細(xì)胞中不斷積累的遺傳學(xué)和表觀遺傳學(xué)改變所導(dǎo)致的;每年大概有1235108人被確診為結(jié)直腸癌,每年死亡人數(shù)大概為609051人;世界衛(wèi)生組織估計到2030年,結(jié)直腸癌的確診病例將會新增77%,死亡病例將會新增80%,隨著經(jīng)濟(jì)的快速發(fā)展,結(jié)直腸癌在中國的發(fā)病率和死亡人數(shù)正在逐年上升,結(jié)直腸癌的防治形勢非常嚴(yán)峻。

目前大多數(shù)結(jié)直腸癌是從腺瘤發(fā)展而來的,而且從腺瘤轉(zhuǎn)變?yōu)閻盒阅[瘤的時間大約是10-15年,也就是說在轉(zhuǎn)變?yōu)閻盒阅[瘤之前,我們有10-15年的時間來發(fā)現(xiàn)并切除腺瘤從而阻止其惡變。目前,最有效的降低結(jié)直腸癌發(fā)病率和死亡率的方法就是結(jié)直腸癌的早期診斷;因為在結(jié)直腸癌早期,病人并沒有明顯的臨床癥狀,這就導(dǎo)致很多病人在被確診的時候,已經(jīng)處于結(jié)直腸癌的晚期了,但是在發(fā)病初期就對病人進(jìn)行治療才是最有效的;通過早期診斷可以在發(fā)生癌變前就發(fā)現(xiàn)結(jié)直腸的病變或者在癌變的早期就發(fā)現(xiàn)病情,然后盡可能早的對病人進(jìn)行有效而系統(tǒng)的治療,從而有效的降低結(jié)直腸癌的發(fā)病率和死亡率;早期診斷主要針對的是大量的無癥狀人群,所以一個理想的早期診斷技術(shù)應(yīng)該是操作簡單、成本較低、對病人無創(chuàng)傷以及特異性和敏感性都較高的檢測方法。當(dāng)前臨床上應(yīng)用的最準(zhǔn)確的結(jié)直腸癌早期診斷方法是結(jié)腸鏡檢查,其缺點(diǎn)是檢查費(fèi)用較高、操作程序較復(fù)雜以及病人比較排斥,并不適合在普通人群中大規(guī)模推廣應(yīng)用。另一個臨床上常用的方法是糞便隱血檢查,該方法雖然費(fèi)用較低,操作起來也比較簡單,但是它最大的缺點(diǎn)就是敏感性和特異性不高。

表觀遺傳學(xué)分析發(fā)現(xiàn)所有的結(jié)直腸癌都有幾百到幾千個基因發(fā)生了異常的dna甲基化,其中一部分基因的異常甲基化與結(jié)直腸癌的發(fā)病是密切相關(guān)的;目前,基于血液的結(jié)直腸癌早期診斷方法最有效的就是以sept9基因啟動子區(qū)的dna甲基化作為生物標(biāo)記,用該方法對結(jié)直腸癌進(jìn)行早期診斷,可以得到90%的敏感度和88%的特異性,但是該方法對于腺瘤的敏感度和特異性都很低;另外用該方法對50歲以上的無臨床癥狀人群(7941人)進(jìn)行早期結(jié)直腸癌篩查的研究結(jié)果顯示,雖然特異性能夠達(dá)到91.5%,但是對于ⅰ-ⅳ結(jié)直腸癌的敏感度分別只有35%、63%、46%和77.4%。對于腺瘤的敏感度更是只有11.2%;基于糞便的結(jié)直腸癌早期診斷方法最成功的應(yīng)該是以4個基因(bmp3,ndrg4,vimentin和tfpi2)啟動子區(qū)的dna甲基化作為生物標(biāo)記,并同時檢測糞便dna中kras基因的突變和糞便中血紅蛋白的含量,該方法在特異性為90%的前提下,對于結(jié)直腸癌的敏感度為85%,對大于1cm的腺瘤的敏感度為54%;無論是基于血液的方法還是基于糞便的方法,目前都還沒有一個特別理想的診斷技術(shù)適合在臨床上廣泛推廣應(yīng)用。

值得注意的是,此前的研究基本都是將特定基因啟動子區(qū)的dna甲基化作為結(jié)直腸癌早期診斷的生物標(biāo)記,很少有人將關(guān)注的目光放在啟動子區(qū)以外的轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)域?;虻膯幼泳拖瘛伴_關(guān)”,決定基因的活動,控制基因轉(zhuǎn)錄的起始時間和表達(dá)的程度。但是啟動子區(qū)以外的轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)域同樣也會影響基因的轉(zhuǎn)錄,很多情況下也會決定基因轉(zhuǎn)錄的起始時間和表達(dá)的程度,基因啟動子區(qū)以外的轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)域也應(yīng)該受到同樣的關(guān)注。

ctcf是一種廣泛存在于真核生物中的多功能轉(zhuǎn)錄因子,為進(jìn)化上高度保守的多鋅指、dna結(jié)合核蛋白。ctcf通過其鋅指結(jié)構(gòu)的不同組合,可以選擇性識別多種dna序列,并形成不同的ctcf-dna復(fù)合體,發(fā)揮對基因的表達(dá)調(diào)控作用,具有啟動子抑制和激活、基因沉默、增強(qiáng)子阻斷、基因印跡調(diào)控、x染色體失活等多種生物學(xué)功能。ctcf的dna結(jié)合位點(diǎn)在人類基因組是中普遍存在的,大概有5-6萬個,每個位點(diǎn)識別大約34個核苷酸;目前還未見將多功能轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子ctcf的dna結(jié)合位點(diǎn)作為結(jié)直腸腫瘤早期診斷的生物標(biāo)記的報道。



技術(shù)實現(xiàn)要素:

本發(fā)明目的在于提供一種多功能轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子ctcf的dna結(jié)合位點(diǎn)ctcf_13的新用途,即多功能轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子ctcf的dna結(jié)合位點(diǎn)ctcf_13在制備用于結(jié)直腸腫瘤早期診斷、篩查和患病風(fēng)險預(yù)測試劑盒中的應(yīng)用,該結(jié)合位點(diǎn)的核苷酸序列如seqidno:1所示。

本發(fā)明所述檢測試劑盒包括常規(guī)基因組dna提取試劑、甲基化dna的亞硫酸氫鹽處理試劑、進(jìn)行dna甲基化檢測所需的試劑以及引物對,該引物對能夠擴(kuò)增經(jīng)亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化過的甲基化或未甲基化的seqidno:1所示序列并對所擴(kuò)增的序列用dna質(zhì)譜法進(jìn)行后續(xù)的dna甲基化檢測。該結(jié)合位點(diǎn)ctcf_13在結(jié)直腸腫瘤細(xì)胞中表現(xiàn)出高甲基化狀態(tài),而在正常組織中處于低甲基化狀態(tài)。

所述引物對序列如seqidno:2和seqidno:3所示。

本申請首次將多功能轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子-ctcf的dna結(jié)合位點(diǎn)作為結(jié)直腸腫瘤早期診斷的生物標(biāo)記。首先,通過分析已發(fā)表的ctcf在人類基因組中的dna結(jié)合位點(diǎn)數(shù)據(jù),并結(jié)合已發(fā)表的人類基因組dna甲基化數(shù)據(jù),我們共篩選出了121個位點(diǎn)的ctcf結(jié)合模式與dna甲基化狀態(tài)存在顯著相關(guān)性,即這些位點(diǎn)dna甲基化程度的高低與ctcf結(jié)合的多少存在負(fù)相關(guān)。這121個ctcf結(jié)合位點(diǎn)就屬于在腫瘤細(xì)胞系中特異性的,并且其結(jié)合模式與dna甲基化狀態(tài)存在顯著相關(guān)性。第二步,通過高分辨率溶解曲線法(hrm)在33個結(jié)直腸腫瘤組織樣本及其對應(yīng)的正常樣本中檢測了這121個位點(diǎn)的dna甲基化水平,從中篩選出了23個甲基化模式具有腫瘤特異性的位點(diǎn)。由于hrm法在檢測dna甲基化應(yīng)用中不能進(jìn)行準(zhǔn)確的定量分析,所以也就不能進(jìn)一步比較所篩選出的23個位點(diǎn)優(yōu)劣,所以后續(xù)的dna甲基化檢測都是用dna質(zhì)譜法完成的;第三步,通過dna質(zhì)譜法在20個結(jié)直腸腫瘤組織樣本及其對應(yīng)的正常樣本中檢測了23個位點(diǎn)的dna甲基化水平,根據(jù)這23個位點(diǎn)在區(qū)分腫瘤組織和正常組織上的表現(xiàn),從中篩選出了10個表現(xiàn)最好的位點(diǎn)通過擴(kuò)大樣本作進(jìn)一步篩選。第四步,通過dna質(zhì)譜法在70個結(jié)直腸腫瘤組織樣本及20個正常樣本中檢測了10個位點(diǎn)的dna甲基化水平,根據(jù)這10個位點(diǎn)在區(qū)分腫瘤組織和正常組織上的表現(xiàn),選擇了5個表現(xiàn)最好的位點(diǎn)在大樣本中進(jìn)行驗證。第五步,通過dna質(zhì)譜法在295個結(jié)直腸腫瘤組織樣本及84個正常樣本中檢測了5個位點(diǎn)的dna甲基化水平,最終篩選并鑒定出了本申請用于結(jié)直腸腫瘤早期診斷分子標(biāo)記的ctcf結(jié)合位點(diǎn)。該位點(diǎn)在結(jié)直腸腫瘤細(xì)胞中表現(xiàn)出高甲基化狀態(tài),而在正常組織中處于低甲基化狀態(tài),提示ctcf結(jié)合位點(diǎn)ctcf_13的dna甲基化是結(jié)直腸腫瘤早期診斷的分子標(biāo)記。

該結(jié)合位點(diǎn)表現(xiàn)出了很高的準(zhǔn)確性。在特異性為95%的前提下,它在檢測腺瘤、ⅰ期結(jié)直腸癌、ⅱ期結(jié)直腸癌、ⅲ期結(jié)直腸癌和所有結(jié)直腸腫瘤中的敏感度分別為79.79%、96.84%、88.06%、87.66%和87.14%。也就是說,ctcf_13檢測ⅰ期結(jié)直腸腫瘤的準(zhǔn)確性最高(特異性為95%的前提下敏感度為96.84%)。而且,在特異性為95%的前提下,它在檢測ⅰ期結(jié)直腸癌、ⅱ期結(jié)直腸癌、ⅲ期結(jié)直腸癌和所有結(jié)直腸腫瘤中的敏感度都大于87%,雖然檢測腺瘤的敏感度最低,但是也達(dá)到了79.79%。說明這個位點(diǎn)對于所有結(jié)直腸腫瘤的早期診斷都具有很高的準(zhǔn)確性。

另外,當(dāng)本申請?zhí)峁┑亩喙δ苻D(zhuǎn)錄調(diào)控因子ctcf的dna結(jié)合位點(diǎn)ctcf_13與另外4個ctcf的dna結(jié)合位點(diǎn)組成一組用于結(jié)直腸腫瘤早期診斷的分子標(biāo)記,并以5個位點(diǎn)中任意2個或2個以上為陽性作為腫瘤陽性的判斷標(biāo)準(zhǔn)時,可以得到最優(yōu)的特異性和敏感度(分別為94.05%和93.54%),特別是對于腺瘤檢測的特異性和敏感度分別達(dá)到94.05%和91.67%。

即本發(fā)明另一目的是將多功能轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子ctcf的dna結(jié)合位點(diǎn)ctcf_13與下述4個ctcf的dna結(jié)合位點(diǎn)中任意一個或幾個應(yīng)用在制備用于結(jié)直腸腫瘤早期診斷試劑盒中;

(1)核苷酸序列如seqidno:4所示的ctcfdna結(jié)合位點(diǎn);

(2)核苷酸序列如seqidno:5所示的ctcfdna結(jié)合位點(diǎn);

(3)核苷酸序列如seqidno:6所示的ctcfdna結(jié)合位點(diǎn);

(4)核苷酸序列如seqidno:7所示的ctcfdna結(jié)合位點(diǎn)。

雖然bmp3和ndrg4是已報道的結(jié)直腸腫瘤早期診斷的分子標(biāo)記中表現(xiàn)最好的,但是我們通過dna質(zhì)譜法在62個結(jié)直腸腫瘤組織樣本及58個正常樣本中檢測了bmp3和ndrg4以及ctcf_13的dna甲基化水平,結(jié)果顯示,在特異性為90%的前提下,ctcf_13的敏感度為81.64%,而bmp3和ndrg4的敏感度分別為48.56%和69.56%。也就是說,本申請?zhí)峁┑慕Y(jié)直腸腫瘤早期診斷的分子標(biāo)記ctcf_13的檢測準(zhǔn)確性要遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于已報道的分子標(biāo)記。

本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和技術(shù)效果如下:

本發(fā)明提供的ctcf結(jié)合位點(diǎn)無論是檢測結(jié)直腸腺瘤還是結(jié)直腸癌的準(zhǔn)確性都要顯著高于已報道的dna甲基化分子標(biāo)記;本申請不僅僅提供了一種更為有效的結(jié)直腸腫瘤早期診斷技術(shù),對于建立其它腫瘤的早期診斷技術(shù)也具有借鑒意義,而且ctcf的dna結(jié)合位點(diǎn)還有可能成為腫瘤治療效果監(jiān)測和預(yù)后效果評估以及腫瘤分子分型(如cimp分型)的生物標(biāo)記??傊?,本研究為尋找更為有效的腫瘤早期診斷、治療效果監(jiān)測、預(yù)后效果評估以及分子分型的分子標(biāo)記提供了新的思路,對腫瘤的預(yù)防和治療都具有重要意義。

附圖說明

圖1是23個具有腫瘤特異性的ctcf結(jié)合位點(diǎn)在40個樣本中的dna質(zhì)譜結(jié)果分層聚類圖;圖中列代表的是樣本,行代表的是ctcf的dna結(jié)合位點(diǎn)。

具體實施方式

下面通過附圖和實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說明,但本發(fā)明保護(hù)范圍不局限于所述內(nèi)容,實施例中方法如無特殊說明均為常規(guī)方法,使用的試劑如無特殊說明均為常規(guī)市售試劑或按常規(guī)方法配制的試劑。

實施例1:多功能轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子ctcf的dna結(jié)合位點(diǎn)的篩選

1、樣本收集

收集昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院2014年4月至2016年8月結(jié)直腸癌患者的新鮮腫瘤組織187例及其對應(yīng)的正常組織(距離腫瘤邊緣6cm以上)84例;在腸鏡室收集了新鮮腺瘤組織108例。所有樣本共計379例,其中正常組織84例,腫瘤組織295例;上述樣本臨床資料情況如表1所示:

表1樣本信息表

。

2、基因組dna提取和亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化

基因組dna的提取使用的是qiagen公司的qiaampdnaminikit(貨號51304)試劑盒,所有操作都是根據(jù)試劑盒的說明書來完成的。亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化使用的是qiagen公司的epitectfastdnabisulfitekit(貨號59826)試劑盒,所有操作都是根據(jù)試劑盒的說明書來完成的。

3、候選ctcf結(jié)合位點(diǎn)的篩選

wang等人通過分析19種人類細(xì)胞系(包括7種腫瘤細(xì)胞系和12種正常細(xì)胞系)中ctcf的chip-seq數(shù)據(jù),共發(fā)現(xiàn)了1236個位點(diǎn)的結(jié)合模式是腫瘤細(xì)胞系特異的,這些特異性的ctcf結(jié)合位點(diǎn)可以將7種腫瘤細(xì)胞系與12種正常細(xì)胞系區(qū)分開。結(jié)合已發(fā)表的13種細(xì)胞系(包括6種腫瘤細(xì)胞系和7種正常細(xì)胞系)中ctcf結(jié)合位點(diǎn)的dna甲基化數(shù)據(jù),我們在這1236個腫瘤細(xì)胞系特異的ctcf結(jié)合位點(diǎn)中共發(fā)現(xiàn)121個位點(diǎn)的ctcf結(jié)合模式與dna甲基化狀態(tài)存在顯著相關(guān)性,即這些位點(diǎn)的dna甲基化程度越高,ctcf的結(jié)合就越少。這121個ctcf結(jié)合位點(diǎn)就屬于在腫瘤細(xì)胞系中特異性的,并且其結(jié)合模式與dna甲基化狀態(tài)存在顯著相關(guān)性的ctcf結(jié)合位點(diǎn)。我們根據(jù)這121個ctcf結(jié)合位點(diǎn)的基因組坐標(biāo)從ucsc數(shù)據(jù)庫中下載了這121個位點(diǎn)的參考序列,然后設(shè)計用hrm法進(jìn)行dna甲基化檢測的pcr引物。

4、高分辨率溶解曲線法(hrm)進(jìn)行dna甲基化分析

本實施例首先用hrm法在66個樣本(33個腫瘤組織樣本及其對應(yīng)的正常組織樣本,其中33個腫瘤組織包括6個腺瘤,9個i期腫瘤,10個ii期腫瘤和8個iii期腫瘤)中對121個ctcf結(jié)合位點(diǎn)的dna甲基化狀態(tài)進(jìn)行分析,以期找出dna甲基化狀態(tài)在腫瘤組織中具有特異性的ctcf結(jié)合位點(diǎn),也就是那些dna甲基化狀態(tài)能夠?qū)⒄=M織和腫瘤組織區(qū)分開的位點(diǎn)。首先,我們下載了所篩選出的121個ctcf結(jié)合位點(diǎn)的基因組序列(每個結(jié)合位點(diǎn)是135bp),同時根據(jù)在線的ctcf結(jié)合位點(diǎn)數(shù)據(jù)庫ctcfbsdb2.0(http://insμlatordb.uthsc.edu/)預(yù)測每條序列上ctcf最可能的結(jié)合位置,然后根據(jù)預(yù)測出的ctcf結(jié)合位置設(shè)計出每個ctcf結(jié)合位點(diǎn)的hrm引物,hrm引物的擴(kuò)增區(qū)域必須包含ctcf的結(jié)合位置。pcr擴(kuò)增和hrm分析所使用的儀器是abisteponeplusreal-timepcr系統(tǒng)(appliedbiosystems,usa)。所使用的試劑是abi公司的meltdoctor?hrmmastermix(appliedbiosystems,usa);所有操作都是根據(jù)生產(chǎn)商的使用說明來完成;hrmpcr反應(yīng)體系和擴(kuò)增程序如表2和表3所示:

表2hrmpcr擴(kuò)增反應(yīng)體系

;

表3hrmpcr擴(kuò)增和分析程序

;

每次實驗都會用已知甲基化比例的標(biāo)準(zhǔn)品(epitectcontroldna,qiagen公司)做一個標(biāo)準(zhǔn)曲線來判斷腫瘤樣本和正常樣本的甲基化水平;所得到的hrm數(shù)據(jù)使用abi公司的high-resolutionmeltingsoftware(appliedbiosystems,usa)軟件進(jìn)行分析。

所檢測的121個ctcf結(jié)合位點(diǎn)中,共發(fā)現(xiàn)23個位點(diǎn)的dna甲基化狀態(tài)具有較好的腫瘤特異性(見表4,表中n代表不具有腫瘤特異性,空格代表具有腫瘤特異性),其中16個位點(diǎn)的甲基化模式為腫瘤組織中的甲基化水平顯著高于正常組織(表4,t>n),7個位點(diǎn)的甲基化模式為腫瘤組織中的甲基化水平顯著低于正常組織(表4,t<n),23個位點(diǎn)在33個腫瘤患者中的腫瘤特異性為64%-94%。

表4hrm篩選結(jié)果統(tǒng)計表

5、dna質(zhì)譜進(jìn)行dna甲基化分析

為了進(jìn)一步驗證由hrm法所篩選出來的23個ctcf結(jié)合位點(diǎn)在腫瘤組織中的特異性,并準(zhǔn)確定量每個ctcf結(jié)合位點(diǎn)中不同cpg位點(diǎn)的甲基化比例以及每個cpg位點(diǎn)在腫瘤組織和正常組織中dna甲基化水平的具體差異,從而找出最適合作為結(jié)直腸腫瘤早期診斷的ctcf結(jié)合位點(diǎn),我們首先在40個樣本中(20個腫瘤組織樣本及其對應(yīng)的正常組織樣本,其中20個腫瘤組織包括7個腺瘤、6個ⅰ期腫瘤和7個ⅱ期腫瘤)用sequenommassarrayepityper平臺的dna質(zhì)譜方法檢測了由hrm方法所篩選出的23個在腫瘤組織中具有特異性的ctcf結(jié)合位點(diǎn)的dna甲基化水平。所用的引物是用sequenom公司的在線引物設(shè)計軟件sequenomepidesigner所設(shè)計的,每條反向引物都包含t7rna聚合酶的啟動子序列。質(zhì)譜dna甲基化檢測采用的是堿基特異的剪切和質(zhì)譜分析相結(jié)合來檢測包含一個或者多個cpg位點(diǎn)的dna片段的甲基化水平。

具體操作步驟簡述如下:

步驟1、使用亞硫酸氫鹽,將樣本dna中沒有甲基化的c全部轉(zhuǎn)化為u(相當(dāng)于dna中的t);

步驟2、使用特殊設(shè)計的一對引物擴(kuò)增經(jīng)亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化過的dna樣本,得到帶有t7rna聚合酶啟動子序列的擴(kuò)增產(chǎn)物;

步驟3、在體外轉(zhuǎn)錄體系中,利用t7rna聚合酶,將擴(kuò)增產(chǎn)物轉(zhuǎn)錄為rna片斷;

步驟4、在步驟3的體系中,利用rnasea能夠特異性識別并切割rna中u3’端的特性,將rna片斷切割成攜帶有cpg位點(diǎn)的小片斷(cpg單元);

步驟5、使用sequenommassarrayepityper平臺的飛行質(zhì)譜分析系統(tǒng)檢測步驟4的產(chǎn)物;由于同一片斷中,只有cpg和cpa之間16da的分子量差別,即質(zhì)譜圖中兩者峰的差距;所得到的甲基化質(zhì)譜數(shù)據(jù)使用sequenom公司的typer4.0軟件進(jìn)行分析,從而得到目標(biāo)dna片段中每個cpg單元的甲基化百分比。對于包含多個cpg單元的ctcf結(jié)合位點(diǎn),我們將選擇統(tǒng)計分析中auc值最高的cpg單元的甲基化百分比作為該位點(diǎn)的甲基化百分比。

為了保證數(shù)據(jù)的可靠性,所有數(shù)據(jù)都經(jīng)過了嚴(yán)格的質(zhì)控選擇。簡單地說,如果一個cpg分析單元有大于30%的樣本沒有被成功檢測,這個cpg分析單元的數(shù)據(jù)將會被排除。如果一個樣本的一個ctcf結(jié)合位點(diǎn)中有大于30%的cpg位點(diǎn)沒有被成功檢測,這個樣本的在該ctcf結(jié)合位點(diǎn)的數(shù)據(jù)也將會被排除。

dna質(zhì)譜的檢測結(jié)果顯示,在23個ctcf結(jié)合位點(diǎn)中,其中16個位點(diǎn)的甲基化模式為腫瘤組織中的甲基化水平顯著高于正常組織,7個位點(diǎn)的甲基化模式為腫瘤組織中的甲基化水平顯著低于正常組織,這個結(jié)果與hrm檢測結(jié)果一致,進(jìn)一步驗證了用hrm法檢測dna甲基化的可靠性。

為了判斷這23個腫瘤特異性的ctcf結(jié)合位點(diǎn)能否將腫瘤組織和正常組織區(qū)分開,本研究用這23個位點(diǎn)在40個樣本中的甲基化百分比做了分層聚類分析(圖1)。從圖中可以看出,40個樣本通過分層聚類聚為了兩枝:n和t。n枝包含22個樣本,其中20個為正常組織(91%),2個為腫瘤組織(9%);t枝包含18個樣本,全部都是腫瘤組織(100%);也就是說根據(jù)這23個ctcf結(jié)合位點(diǎn)的甲基化狀態(tài)可以很好的將腫瘤組織和正常組織區(qū)分開。

為了區(qū)分這23個ctcf結(jié)合位點(diǎn)在區(qū)分腫瘤組織和正常組織中的表現(xiàn),進(jìn)一步篩選出最適合作為結(jié)直腸腫瘤早期診斷分子標(biāo)記的位點(diǎn),我們分析了每個位點(diǎn)在區(qū)分腫瘤組織和正常組織上的貢獻(xiàn)(表5)。由下表可以看出,23個位點(diǎn)中,有19個位點(diǎn)的auc>0.8,說明這些位點(diǎn)在區(qū)分腫瘤組織和正常組織中的表現(xiàn)都很好。綜合考慮這23個位點(diǎn)的auc值,以及它們的甲基化百分比在腫瘤組織和正常組織之間的差異大小,我們從中選擇了10個位點(diǎn)在后續(xù)實驗中作進(jìn)一步篩選(下表中用粗體標(biāo)出的位點(diǎn))。

表523個ctcf結(jié)合位點(diǎn)的檢測準(zhǔn)確性比較

。

實施例2:擴(kuò)大樣本量對10個位點(diǎn)做進(jìn)一步篩選

為了提高所篩選出的分子標(biāo)記在檢測結(jié)直腸腺瘤上的特異性和敏感度,我們又增加了50個結(jié)直腸腺瘤樣本對實施例1所篩選出的10個ctcf結(jié)合位點(diǎn)做進(jìn)一步篩選;加上實施例1中40個樣本的質(zhì)譜數(shù)據(jù),這一步篩選總共包含90個樣本,其中20個為正常對照、57個為腺瘤、6個為ⅰ期腫瘤和7個為ⅱ期腫瘤。表6顯示了這10個ctcf結(jié)合位點(diǎn)在區(qū)分腫瘤組織和正常組織中的表現(xiàn)。從表6可以看出,這10個ctcf結(jié)合位點(diǎn)都具有很強(qiáng)的區(qū)分腫瘤組織和正常組織的能力(auc≥0.85)。在特異性為95%的前提下,它們的敏感度在44.64%-88.89%之間。我們的目標(biāo)是建立一種在保證檢測準(zhǔn)確性的前提下包含盡可能少的分子標(biāo)記的結(jié)直腸腫瘤早期診斷技術(shù),因為只有這樣才能保證檢測的經(jīng)濟(jì)性和準(zhǔn)確性。

因此,根據(jù)這10個位點(diǎn)在區(qū)分腫瘤組織和正常組織中的表現(xiàn)(表6中的auc值),我們選擇了5個區(qū)分能力最強(qiáng)的ctcf結(jié)合位點(diǎn)作為最優(yōu)的分子標(biāo)記(表6中粗體表示的位點(diǎn)),下一步我們將在大樣本中驗證這5個分子標(biāo)記在對結(jié)直腸腫瘤進(jìn)行早期診斷中的準(zhǔn)確性。這5個位點(diǎn)中,有4個位點(diǎn)的甲基化模式為腫瘤組織中的甲基化水平顯著高于正常組織。每個位點(diǎn)都具有很強(qiáng)的區(qū)分腫瘤組織和正常組織的能力(auc≥0.916),在特異性為95%的前提下,它們的敏感度在73.08%-88.89%之間。其中,ctcf_13是本申請要保護(hù)的結(jié)合位點(diǎn),其核苷酸序列如seqidno:1所示。

表610個ctcf結(jié)合位點(diǎn)的檢測準(zhǔn)確性比較

。

實施例3:在大樣本中驗證本申請的ctcf結(jié)合位點(diǎn)ctcf_13的檢測準(zhǔn)確性

為了驗證本申請要保護(hù)的結(jié)合位點(diǎn)ctcf_13的檢測準(zhǔn)確性,我們選取了379例結(jié)直腸樣本(表1),其中正常樣本84例,腫瘤樣本295例(腺瘤108例,ⅰ期腫瘤39例,ⅱ期腫瘤101例和ⅲ期腫瘤47例),繼續(xù)用dna質(zhì)譜法檢測了該結(jié)合位點(diǎn)在379例結(jié)直腸樣本中的dna甲基化水平,檢測方法同實施例1中“dna質(zhì)譜進(jìn)行dna甲基化分析”內(nèi)容相同,采用如seqidno:2和seqidno:3所示的引物對。

根據(jù)dna質(zhì)譜檢測結(jié)果,我們分別統(tǒng)計分析了ctcf_13在檢測腺瘤、ⅰ期腫瘤、ⅱ期腫瘤、ⅲ期腫瘤和所有腫瘤的auc值和特異性為95%時的敏感度。結(jié)果顯示,無論是檢測腺瘤、ⅰ期腫瘤、ⅱ期腫瘤、ⅲ期腫瘤還是所有腫瘤,ctcf_13都具有很強(qiáng)的區(qū)分腫瘤組織和正常組織的能力(auc值分別為0.93、1、0.97、0.98和0.95),而且所有分析都具有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(p<0.0001)。在特異性為95%的前提下,ctcf_13檢測腺瘤、ⅰ期腫瘤、ⅱ期腫瘤、ⅲ期腫瘤和所有腫瘤的敏感度分別為79.79%、96.84%、88.06%、87.66%和87.14%。也就是說,ctcf_13檢測ⅰ期結(jié)直腸腫瘤的準(zhǔn)確性最高(特異性為95%的前提下敏感度為96.84%)。而且,在特異性為95%的前提下,它在檢測ⅰ期結(jié)直腸癌、ⅱ期結(jié)直腸癌、ⅲ期結(jié)直腸癌和所有結(jié)直腸腫瘤中的敏感度都大于87%,雖然檢測腺瘤的敏感度最低,但是也達(dá)到了79.79%。說明這個位點(diǎn)對于所有結(jié)直腸腫瘤的早期診斷都具有很高的準(zhǔn)確性。

實施例4:本申請的ctcf結(jié)合位點(diǎn)ctcf_13與其他ctcf結(jié)合位點(diǎn)聯(lián)合使用的檢測準(zhǔn)確性

為了確定通過實施例1和實施例2所篩選出的5個最優(yōu)ctcf結(jié)合位點(diǎn)聯(lián)合使用是否能夠提高檢測準(zhǔn)確性,我們同時在大樣本中用dna質(zhì)譜法檢測了ctcf_33、ctcf_55、ctcf_94和ctcf_113的dna甲基化水平。所用的樣本和檢測方法同實施例3。

我們分別將5個位點(diǎn)中任意1個或1個以上、任意2個或2個以上、任意3個或3個以上、任意4個或4個以上或者全部5個位點(diǎn)為陽性作為腫瘤陽性的判斷標(biāo)準(zhǔn),并分別分析了它們檢測腺瘤、ⅰ期腫瘤、ⅱ期腫瘤、ⅲ期腫瘤和所有腫瘤的特異性和敏感度,最終發(fā)現(xiàn)當(dāng)以5個位點(diǎn)中任意2個或2個以上為陽性作為腫瘤陽性的判斷標(biāo)準(zhǔn)時,可以顯著提高檢測準(zhǔn)確性(表7)。在特異性為94.05%時,檢測腺瘤、ⅰ期腫瘤、ⅱ期腫瘤、ⅲ期腫瘤和所有腫瘤的敏感度分別為91.67%、97.44%、94.06%、93.62%和93.54%。

表7ctcf_13與其他4個ctcf結(jié)合位點(diǎn)聯(lián)合使用的檢測準(zhǔn)確性

實施例5:本申請的ctcf結(jié)合位點(diǎn)ctcf_13與已報道的分子標(biāo)記的檢測準(zhǔn)確性比較

為了比較本申請的ctcf結(jié)合位點(diǎn)ctcf_13與已報道的最優(yōu)分子標(biāo)記bmp3和ndrg4的檢測準(zhǔn)確性,本實施例在120例樣本中檢測了ctcf_13以及bmp3和ndrg4的啟動子區(qū)dna甲基化水平。這120例樣本包括58個正常組織、46個腺瘤、4個i期腫瘤、8個ii期腫瘤和4個iii期腫瘤。根據(jù)檢測結(jié)果,我們分別計算出ctcf_13、bmp3和ndrg4的auc以及特異性為90%時的敏感度(表8)。由表8可以看出,本申請的ctcf結(jié)合位點(diǎn)ctcf_13在特異性為90%時的敏感度為81.64%,而bmp3和ndrg4在特異性為90%時的敏感度分別為48.56%和69.56%。也就是說,本申請的ctcf結(jié)合位點(diǎn)ctcf_13在檢測中國人群結(jié)直腸腫瘤上的準(zhǔn)確性要顯著高于已報道的最優(yōu)分子標(biāo)記bmp3和ndrg4;

表8ctcf結(jié)合位點(diǎn)ctcf_13與已報道最優(yōu)分子標(biāo)記的準(zhǔn)確性比較

序列表

<110>昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院

<120>多功能轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子ctcf的dna結(jié)合位點(diǎn)ctcf_13的應(yīng)用

<160>7

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>180

<212>dna

<213>人

<400>1

gattgtccttgagatgggactgcaatagaaatccgggcagcccgaagaggcacccagcgc60

tccagccaccagctgggccgcccgggagtccctggctctagaccagccgcgaggaggcgc120

cgcgagagagctggtccctgcccgcggccggaggagggctagagcccctgggccagcccc180

<210>2

<211>35

<212>dna

<213>人工序列

<400>2

aggaagagaggattgtttttgagatgggattgtaa35

<210>3

<211>56

<212>dna

<213>人工序列

<400>3

cagtaatacgactcactatagggagaaggctaaaactaacccaaaaactctaaccc56

<210>4

<211>156

<212>dna

<213>人

<400>4

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<210>5

<211>232

<212>dna

<213>人

<400>5

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<210>6

<211>227

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<213>人

<400>6

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<210>7

<211>296

<212>dna

<213>人

<400>7

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gctccccgggctgccacccacgcccgcggccggggccgagccagccacgcagggcagccg240

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