本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及來自熱解纖維素菌caldicellulosiruptorsaccharolyticus中的兩種β-木糖苷酶及其在對含木糖基修飾的天然化合物進行生物轉(zhuǎn)化中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

在有機化合物的體外生物轉(zhuǎn)化過程中，大部分生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)需要在有機溶劑中進行(很多有機化合物相較于水，更易溶于有機溶劑)，因此，有機溶劑耐受能力是酶制劑能否工業(yè)化應(yīng)用的重要參數(shù)和限定條件。β-木糖苷酶是能夠從非還原端水解木寡糖等低聚木糖或者是催化水解含木糖苷有機化合物的酶，水解產(chǎn)物主要為木糖。目前，大多數(shù)β-木糖苷酶對有機溶劑的耐受能力不佳，在很大程度上限制了其在工業(yè)過程中的應(yīng)用。

熱穩(wěn)定性是酶制劑在工業(yè)利用過程中的重要參數(shù)之一。當(dāng)前報道的大多數(shù)木糖苷酶的最適反應(yīng)溫度多在45～60℃之間，并且熱穩(wěn)定性參差不齊，嚴重限制了其在造紙和食品等工業(yè)環(huán)境中對木寡糖的降解。因此，熱穩(wěn)定性對β-木糖苷酶的工業(yè)化應(yīng)用尤為重要。

木糖是β-木糖苷酶水解反應(yīng)的終產(chǎn)物。當(dāng)β-木糖苷酶水解低聚木寡糖為木糖時，隨著水解時間的增加，增加的終產(chǎn)物木糖會降低酶促反應(yīng)速率，從而抑制反應(yīng)的持續(xù)進行?，F(xiàn)有的β-木糖苷酶對木糖的耐受能力均較差，因此，具有木糖耐受能力的β-木糖苷酶在降解半纖維素過程中作用巨大。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于是提供一種源自熱解纖維素菌caldicellulosiruptorsaccharolyticus的β-木糖苷酶及其在對含木糖基修飾的天然化合物進行生物轉(zhuǎn)化中的應(yīng)用。

為實現(xiàn)上述目的,本發(fā)明采用技術(shù)方案為:

一種β-1,4-木糖苷酶，β-1,4-木糖苷酶為源自熱解纖維素菌(caldicellulosiruptorsaccharolyticus)的同一個基因簇中β-木糖苷酶csxyl39a、β-木糖苷酶csxyl39b；其中，β-木糖苷酶csxyl39a，是如下(a)或(b)：

(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；

(b)與序列表中序列1所示的氨基酸序列具有至少95％同源性，且具有β-木糖苷酶活性的蛋白質(zhì)；

β-木糖苷酶csxyl39b，是如下(c)或(d)：

(c)由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；

(d)與序列表中序列2所示的氨基酸序列具有至少95％同源性，且具有β-木糖苷酶活性的蛋白質(zhì)。

上述序列表中的序列1由482個氨基酸殘基組成，所述的一個或多個氨基酸殘基的取代和/或缺失/或添加為不超過25個氨基酸殘基的取代和/或缺失/或添加。

上述序列表中的序列2由506個氨基酸殘基組成，所述的一個或多個氨基酸殘基的取代和/或缺失/或添加為不超過25個氨基酸殘基的取代和/或缺失/或添加。

將上述序列1的氨基酸殘基序列組成的蛋白質(zhì)經(jīng)過一個或多個氨基酸殘基的取代和/或缺失/或添加且具有β-木糖苷酶活性的、由序列1衍生的蛋白質(zhì)突變體，可編碼此蛋白質(zhì)突變體的基因序列也在本發(fā)明保護的范圍。

可編碼上述序列2中氨基酸序列的、且具有β-木糖苷酶活性的基因序列也在本發(fā)明保護的范圍。

將序列2的氨基酸殘基序列組成的蛋白質(zhì)經(jīng)過一個或多個氨基酸殘基的取代和/或缺失/或添加且具有β-木糖苷酶活性的、由序列2衍生的蛋白質(zhì)突變體，可編碼此蛋白質(zhì)突變體的基因序列也在本發(fā)明保護的范圍。

一種構(gòu)建β-1,4-木糖苷酶的引物，所述構(gòu)建β-1,4-木糖苷酶csxyl39a引物為

正向引物1(csxyl39a)5’-atgaaaataactattaattatggaaagagacttg-3’；

反向引物1(csxyl39a)5’-ctaaccattcttaattgtaacagccacaac-3’；

所述構(gòu)建β-1,4-木糖苷酶csxyl39a引物為

正向引物2(csxyl39b)5’-atgacgaatataaagattgagaaaggcaag-3’

反向引物2(csxyl39b)5’-ctaataacctggtattttactatcgtcaag-3’。

一種β-1,4-木糖苷酶的應(yīng)用，所述β-1,4-木糖苷酶在催化含木糖基修飾的天然藥物中的應(yīng)用；

所述β-1,4-木糖苷酶具有熱穩(wěn)定性；

或，所述β-1,4-木糖苷酶在溶劑內(nèi)具有耐受性。

4.權(quán)利要求3所述β-1,4-木糖苷酶的應(yīng)用，其特征在于：所述β-1,4-木糖苷酶csxyl39a在有機溶劑水溶液存在下作為催化含木糖基修飾的天然藥物的催化酶中的應(yīng)用；

β-1,4-木糖苷酶csxyl39a在有機溶劑水溶液存在下作為熱穩(wěn)定性酶中的應(yīng)用；

或，所述β-木糖苷酶csxyl39a作為固定化酶中的應(yīng)用。

進一步的說，所述β-1,4-木糖苷酶csxyl39a在終濃度為10-40％的有機溶劑水中催化水解含木糖基的天然化合物中的應(yīng)用；

所述β-1,4-木糖苷酶csxyl39b在高濃度(300毫摩爾/升)的木糖和葡萄糖溶液中具有耐受性。

所述β-1,4-木糖苷酶csxyl39b與內(nèi)切型木聚糖酶混合在木聚糖水解中作為水解酶的應(yīng)用。

更進一步的說，

序列1所示的β-木糖苷酶csxyl39a，具有下述應(yīng)用方向：

(1)β-木糖苷酶csxyl39a在含有甲醇、乙醇、異丙醇、正丁醇、乙二醇、丙酮、乙腈、四氫呋喃、二甲醚、dmso、dmf、dma、乙酸乙酯等各種有機溶劑的水溶液中，能夠維持很高的木糖苷酶水解活性(例如，在20％上述有機溶劑：80％水的體系中，csxyl39a對底物對硝基苯酚木糖苷、三七皂苷r1、r2、人參皂苷ra1、ra2、紫衫醇前體物7-xylosyl-10-deacetylpaclitaxel等的水解活性都可維持在90％以上)；

(2)體系內(nèi)適當(dāng)終濃度(10-40％)的上述各種有機溶劑水溶液可以提高csxyl39a的酶催化效率；

(3)體系內(nèi)適當(dāng)終濃度(10-40％)的上述各種有機溶劑可以提高csxyl39a的酶熱穩(wěn)定性；

(4)β-木糖苷酶csxyl39a能適用于多種酶固定化技術(shù)(例如，大孔類吸附載體、交聯(lián)類雙功能團載體、包埋類凝膠聚合物載體等)。固定化處理后，csxyl39a的熱穩(wěn)定性無明顯變化；

(5)固定化后的β-木糖苷酶csxyl39a對適當(dāng)濃度的(10％-60％)有機溶劑水溶液耐受能力有顯著提高(例如，利用大孔樹脂載體對csxyl39a固定化處理后，在40％丙酮與60％水的混合溶液中，固定化的csxyl39a的水解活性可提高至原來的380％)。

序列2的β-木糖苷酶csxyl39b，具有下述應(yīng)用方向：

(1)含有序列2的β-木糖苷酶csxyl39b具有耐受高濃度木糖和葡萄糖的特性；例如：在500毫摩爾/升濃度的木糖或葡萄糖存在的情況下，以“對硝基苯酚木糖苷”為底物，csxyl39b可保持90％以上的水解活性；

(2)含有序列2的β-木糖苷酶csxyl39b具有良好的熱穩(wěn)定性特性；例如：以“對硝基苯酚木糖苷”為底物，在80℃下的半衰期超過9小時，60℃的半衰期則超過80小時。

一種對含木糖基天然化合物水解的方法，將含木糖基天然化合物與所述β-1,4-木糖苷酶csxyl39a和/或csxyl39b在含終濃度為10％-40％有機溶劑的反應(yīng)體系內(nèi)反應(yīng)即得到水解產(chǎn)物。

所述反應(yīng)體系為：在ph為4.5-6的緩沖液下40℃-70℃之間反應(yīng)。

所述含木糖基天然化合物為三七皂苷r1、r2、人參皂苷ra1、ra2、紫衫醇前體物7-xylosyl-10-deacetylpaclitaxel，其水解產(chǎn)物分別為人參皂苷rg1、rh1、rb2、rc、紫杉醇前體物10-deacetylpaclitaxel。

所述緩沖液為ph為4.5-6的任意緩沖液，例如磷酸緩沖液或檸檬酸緩沖液。

本發(fā)明所具有的優(yōu)點：

本發(fā)明中，β-木糖苷酶csxyl39a具有獨特的有機溶劑耐受性，在多種有機溶劑存在條件下，可直接對底物進行水解，省略對底物進行有機溶劑去除的步驟，降低工藝成本。而β-木糖苷酶csxyl39b對產(chǎn)物的反饋抑制有耐受能力，以及有較好的熱穩(wěn)定性，與內(nèi)切性木聚糖酶有較好的協(xié)同能力，可用于木質(zhì)纖維素的降解。

附圖說明

圖1為本發(fā)明實施例提供的β-木糖苷酶csxyl39a在重組大腸桿菌中表達的蛋白質(zhì)電泳圖。

圖2為本發(fā)明實施例提供的β-木糖苷酶csxyl39b在重組大腸桿菌中表達的蛋白質(zhì)電泳圖。

圖3為本發(fā)明實施例提供的兩種重組木糖苷酶對不同底物的水解酶活圖。

圖4為本發(fā)明實施例提供的csxyl39a在不同濃度下的各種有機溶劑水溶液中的水解活性圖。

圖5為本發(fā)明實施例提供的csxyl39a在各種有機溶劑水溶液中的穩(wěn)定性圖。

圖6為本發(fā)明實施例提供的csxyl39a在固定化前后，在不同濃度的有機溶劑水溶液中的相對酶活變化圖。

圖7為本發(fā)明實施例提供的csxyl39a水解三七皂苷r1產(chǎn)生人參皂苷rg1的hplc分析圖。

圖8為本發(fā)明實施例提供的csxyl39b對木糖和葡萄糖耐受性影響圖。

圖9為本發(fā)明實施例提供的csxyl39b與木聚糖酶協(xié)同效應(yīng)分析圖。

具體實施方式

下列實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。

下列實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。

實施例1、β-木糖苷酶csxyl39a和csxyl39b及其氨基酸序列的獲得

提取熱解纖維素菌(caldicellulosiruptorsaccharolyticus)(atcc43494/dsm8903)的基因組dna，并以此作為模板，以正向引物1和反向引物1(參見表1)進行pcr擴增，獲得β-木糖苷酶csxyl39a的基因序列，如序列3所示。以正向引物2和反向引物2(參見表1)進行pcr擴增，獲得β-木糖苷酶csxyl39b的基因序列，如序列4所示。

兩者的pcr的擴增體系及條件相同，具體為：50微升pcr擴增體系中包括1微升基因組dna(15納克/微升)、25微升2×easypfusupermix、1微升的引物(10微摩爾)以及22微升的滅菌超純水。pcr反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性5分鐘；94℃變性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸3.5分鐘，30個循環(huán)；最后72℃延伸5分鐘。

獲得的兩個基因序列通過dna序列翻譯，得到了csxyl39a和csxyl39b的氨基酸序列，如序列1和序列2所示。

將上述所得pcr產(chǎn)物分別與載體peasy-blunte1(購自北京全式金生物技術(shù)有限公司)連接，連接產(chǎn)物分別直接轉(zhuǎn)化入大腸桿菌trans1-t1中進行質(zhì)粒擴增。通過質(zhì)粒的dna測序，確認構(gòu)建正確的質(zhì)粒，再分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌bl21(de3)進行原核表達。通過蛋白質(zhì)純化和sds-page的檢驗，分別得到β-木糖苷酶csxyl39a(參見圖1)和csxyl39b(參見圖2)。

表1根據(jù)熱解纖維素菌屬saccharolyticus基因組中csxyl39a和csxyl39b的序列合成下列引物：

實施例2、β-木糖苷酶水解活性的測定：

以對硝基苯酚木糖苷p-nitrophenyl-β-d-xylopyranoside(pnp-x)為底物測定酶活力。在100微升檸檬酸鈉緩沖液(ph5.0)中，依次加入80微升的pnp-x(10毫摩爾/升)，20微升不同濃度的上述實施例1獲得的β-木糖苷酶csxyl39a或csxyl39b，在水浴鍋(75℃)中孵育5分鐘后，再加入100微升2摩爾/升的碳酸鈉溶液終止反應(yīng)。反應(yīng)液隨后放入分光光度計中，在405納米處測定吸收值(參見圖3)。以每分鐘水解底物，中釋放出1毫摩爾的對硝基苯酚，定義為1個酶活單位。

測定結(jié)果：酶的水解活性結(jié)果如圖3顯示，β-木糖苷酶csxyl39a和csxyl39b對pnp-x的比酶活分別為180個酶活單位/毫克和40酶活單位/毫克。

實施例3、有機溶劑對β-木糖苷酶csxyl39a的水解活性的影響：

以對硝基苯酚木糖苷pnp-x為底物測定β-木糖苷酶的水解活性。水解反應(yīng)體系中分別加入使體系內(nèi)終濃度為不同含量的有機溶劑(機溶劑為甲醇、乙醇、異丙醇、正丁醇、丙酮或乙腈)，反應(yīng)體系是在100微升檸檬酸鈉緩沖液(ph5.0)中，加入80微升10毫摩爾/升的pnp-x，后加入20微升經(jīng)上述有機溶劑混合的csxyl39a酶，在水浴鍋(75℃)中進行孵育(5分鐘)，隨后加入100微升的碳酸鈉溶液(2摩爾/升)終止反應(yīng)。反應(yīng)液隨后放入分光光度計中，在405納米處測定吸收值(參見圖4)。以每分鐘從底物中水解釋放1毫摩爾的對硝基苯酚，定義為1個酶活力單位。含有機溶劑的β-木糖苷酶的酶活/不含有機溶劑的csxyl39a酶活×100％＝相對酶活％。

測試結(jié)果：β-木糖苷酶csxyl39a在不同有機溶劑中的相對剩余酶活，如圖4所示，在20％的有機溶劑(除正丁醇之外)水溶液中，csxyl39a的相對酶活均高于95％以上。其中，在20％的丙酮水溶液中，csxyl39a的酶活是陰性對照的大約2倍；而在40％的丙酮水溶液中，依然能保持高于陰性對照的活性。本實驗的結(jié)論是：在一定的濃度條件下，大多數(shù)有機溶劑能夠提高csxyl39a的酶活。

實施例4、有機溶劑提高β-木糖苷酶csxyl39a穩(wěn)定性(相對殘余酶活)的測試：

在反應(yīng)體系中，分別加入至體系內(nèi)終濃度達到20％的不同的有機溶劑(甲醇、乙醇、異丙醇、正丁醇、丙酮、乙腈)在60℃下進行孵育，在不同的時間節(jié)點，取出等量的反應(yīng)液，以對硝基苯酚木糖苷pnp-x為底物測定殘余的酶活力。

另，在100微升檸檬酸鈉緩沖液(ph5.0)中，加入80微升10毫摩爾每升的pnp-x，隨后加入20微升在不同時間節(jié)點獲得的csxyl39a溶液，在水浴鍋(75℃)中孵育5分鐘后，加入100微升碳酸鈉溶液(2摩爾/升)終止反應(yīng)。其中，不同時間節(jié)點獲得的csxyl39a溶液為將csxyl39a與至體系內(nèi)終濃度為20％不同的有機溶劑(甲醇、乙醇、異丙醇、正丁醇、丙酮、乙腈)在60℃下進行孵育，在不同的時間點上(如圖4所示)取出等量的反應(yīng)液，待用。

反應(yīng)液隨后放入分光光度計中，在405納米處測定吸收值(參見圖5)。以每分鐘從底物中水解釋放1毫摩爾的對硝基苯酚，定義為1個酶活力單位。殘余的酶活/反應(yīng)體系中的初始酶活×100％＝相對殘余酶活％。

測定結(jié)果：β-木糖苷酶csxyl39a在有機溶劑水溶液中的相對殘余酶活如圖5所示，20％的上述有機溶劑水溶液(除正丁醇外)能夠增加csxyl39a在50℃下的酶活半衰期約5-20個小時。因此，大多數(shù)有機溶劑可以增加β-木糖苷酶csxyl39a的穩(wěn)定性。

實施例5、β-木糖苷酶csxyl39a的固定化

酶的固定可采用多種方式，如大孔類吸附載體、交聯(lián)類雙功能團試劑、包埋類凝膠聚合物等，現(xiàn)對csxyl39a進行固定化，并以大孔樹脂對β-木糖苷酶csxyl39a進行固定化為例分析：準確稱量0.5克大孔樹脂，用ph為5.5的檸檬酸緩沖液洗三次后置于3.5毫升ph為5.5的檸檬酸緩沖液中，加入150微升csxyl39a(3毫克/毫升)后，于20℃振蕩過夜，進行β-木糖苷酶的固定化。在固定化前后，分別取出上清液進行酶活測定，測定方法同實施例2。

測試結(jié)果：通過固定化前后，上清液的酶活比較計算固定化效率，利用公式(固定化前上清液酶活-固定化后上清液酶活)/固定化前上清液酶活×100％＝固定化效率。最終獲得固定化效率大于99％。

實施例6、固定化對csxyl39a有機溶劑耐受能力的影響：

100微升50毫摩爾的檸檬酸緩沖液(ph5.5)，80微升的pnp-x(10毫摩爾/升)，每次加入等量的上述實施例5經(jīng)酶固定化后的樹脂，于80℃水浴反應(yīng)5分鐘，加入100微升2摩爾/升的碳酸鈉溶液終止反應(yīng)。過濾后取上清液放入分光光度計中，在405納米處測吸收值。在反應(yīng)體系中分別加入不同含量的有機溶劑使其終濃度達到40％或60％(甲醇或丙酮)測定固定化后有機溶劑對csxyl39a相對酶活影響，繪制固定化前后相對酶活變化柱狀圖。

測試結(jié)果：結(jié)果如圖6所示，固定化進一步提升了csxyl39a對有機溶劑的耐受性。例如，在40％的丙酮存在下，固定化csxyl39a的水解活性是未固定化csxyl39a的380％。對于其他兩種固定化方法(交聯(lián)類雙功能團試劑、包埋類凝膠聚合物)，結(jié)果同上述相近，不同方法對csxyl39a進行固定化后都能明顯提升其對不同有機溶劑的耐受性。

實施例7、利用上述獲得β-木糖苷酶csxyl39a在水解三七皂苷r1、r2、人參皂苷ra1、ra2、紫衫醇前體物7-xylosyl-10-deacetylpaclitaxel等等天然含木糖基化合物制得人參皂苷rg1、rh1、rb2、rc、紫衫醇前體物10-deacetylpaclitaxel等脫木糖基產(chǎn)物的應(yīng)用。

反應(yīng)體系包括，140微升的50毫摩爾/升的檸檬酸緩沖液，40微升的三七皂苷r1(10毫摩爾/升)(或是由三七皂苷r2、人參皂苷ra1或人參皂苷ra2進行替換)，20微升的10納摩爾/升csxyl39a酶和終濃度達到40％的甲醇(甲醇或丙酮等)，在80℃反應(yīng)20分鐘后，加甲醇稀釋后進行產(chǎn)物hplc分析。

測試結(jié)果：結(jié)果如圖7顯示，csxyl39a均能夠與三七皂苷r1反應(yīng)生成人參皂苷rg1，通過hplc檢測酶活發(fā)現(xiàn)csxyl39a對三七皂苷r1比酶活為967單位/毫克。對于上述其它三種含木糖基皂苷類化合物，結(jié)果同上述實施例7相近，產(chǎn)物均能去掉皂苷上的木糖基，轉(zhuǎn)化率在90％以上。

實施例8、β-木糖苷酶csxyl39b對木糖和葡萄糖耐受能力的測試：

在csxyl39b的酶反應(yīng)體系中，分別加入不同含量的木糖或葡萄糖，以對硝基苯酚木糖苷pnp-x為底物測定酶活力，具體為：在總體積100微升的含不同濃度木糖或葡萄糖的檸檬酸鈉緩沖液(ph5.0)中，加入80微升的pnp-x(10毫摩爾/升)，后加入20微升csxyl39b，在水浴鍋(75℃)中孵育5分鐘后，加入100微升2摩爾/升的碳酸鈉溶液終止反應(yīng)。反應(yīng)液隨后放入分光光度計中，在405納米處測定吸收值。以每分鐘從底物中水解釋放1毫摩爾的對硝基苯酚，定義為1個酶活力單位。含有木糖或葡萄糖的殘余酶活/不含木糖或葡萄糖的初始酶活×100％＝相對殘余酶活％。

測定結(jié)果：β-木糖苷酶csxyl39b在含有木糖或葡萄糖的水溶液中的相對殘余酶活如圖8所示，在500毫摩爾濃度的木糖和葡萄糖水溶液中，csxyl39b的相對殘余酶活依然能夠保持在90％以上。因此，β-木糖苷酶csxyl39b對中終產(chǎn)物木糖和葡萄糖有很好的耐受能力。

實施例9、β-木糖苷酶csxyl39b與木聚糖酶協(xié)同效應(yīng)分析：

以1％的源自櫸木的木聚糖(溶于50毫摩爾/升的檸檬酸緩沖液，ph為5.5)為底物，用β-木糖苷酶csxyl39b、β-木糖苷酶csxyl39b與來自caldicellulosiruptorsp.f32的木聚糖酶xyna(糖苷水解酶11家族)或β-木糖苷酶csxyl39b與來自caldicellulosiruptorsp.f32的木聚糖酶xynb(糖苷水解酶10家族)在70℃進行反應(yīng)12小時，隨后產(chǎn)物煮沸15分鐘使酶失活，進行離子色譜分析得到結(jié)果。測定結(jié)果：結(jié)果如圖9顯示，csxyl39b能夠與兩種木聚糖酶發(fā)生協(xié)同效應(yīng)，促進木聚糖底物的水解。

序列1.

mkitinygkrlgkinkfwakcvgschattalredwrkqlkkcrdelgfeyirfhgwlnddmsvcfrnddgllsfsffnidsiidflleigmkpfielsfmpealasgtktvfhykgnitppksyeewgqlieelarhlisrygknevrewffevwnepnlkdffwagtmeeyfklykyaafaikkvdselrvggpataidawipelkdfctkngvpidfisthqyptdlafstssnmeeamakakrgelaervkkaleeayplpvyytewnnspsprdpyhdipydaafivktiidiidlplgcysywtftdifeecgqsslpfhggfgllnihgipkpsyrafqildklngerieiefedksptidciavqnereiilvisnhnvplspidtenikvvlkgiencrevfverideynanpkrvwlemgspaylnreqieelikaselkkekvswgivnnneitfdlsvlphsvvavtikng

序列2.

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序列3.

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sequencelisting

<110>中國科學(xué)院青島生物能源與過程研究所

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