本申請是申請日為2013年10月25日的申請?zhí)枮?01380061624.8(pct申請?zhí)枺簆ct/us2013/066832)、發(fā)明名稱為“小容積反應器中二氧化碳水平和ph的控制”的分案申請。相關申請本申請要求于2012年10月26日提交的標題為“controlofcarbondioxidelevelsandphinsmallvolumereactors”的美國臨時專利申請序列no.61/719,027、于2013年8月23日提交的標題為“controlofcarbondioxidelevelsandphinsmallvolumereactors”的美國臨時專利申請序列no.61/869,111以及于2013年10月23日提交的標題為“controlofcarbondioxidelevelsandphinsmallvolumereactors”的歐洲申請no.13306462.6的優(yōu)先權，其每一篇均通過引用整體并入本文用于所有目的。本發(fā)明總體上描述了用于控制小容積反應器中二氧化碳水平和ph的系統(tǒng)和方法。
背景技術：
：目前，人們對開發(fā)用于使細胞生長例如用于生物制藥的小容積生物反應器抱有很大興趣?？刂拼祟惙磻髦械亩趸妓胶蚿h可能具有挑戰(zhàn)性。對小規(guī)模生物反應器而言，即使少量的酸、堿和/或二氧化碳也可以導致二氧化碳水平和/或ph發(fā)生大的相對變化，從而可對生物反應器運行產生不利影響。因此，需要用于控制此類反應器中的二氧化碳水平和ph的改進的系統(tǒng)和方法。技術實現要素：本發(fā)明總體上描述了小容積反應器中二氧化碳水平和ph的控制及相關系統(tǒng)和方法。在某些實施方案中，描述了生物反應器(例如被配置成培養(yǎng)一種或更多種類型生物細胞的反應器)內的液體生長培養(yǎng)基中二氧化碳水平和ph的控制。在一些情況下，本發(fā)明的主題涉及：相關產品、特定問題的替代方案和/或一種或更多種系統(tǒng)和/或制品的多種不同用途。在一方面中，提供了生物反應器系統(tǒng)。在某些實施方案中，所述生物反應器系統(tǒng)包含：反應器腔室，其容積等于或小于約50毫升并且包含含有緩沖劑和至少一種生物細胞的液體生長培養(yǎng)基和在所述液體生長培養(yǎng)基上方的含有二氧化碳的氣體頂部空間(gaseousheadspace)；連接二氧化碳氣體源與所述氣體頂部空間的第一入口；以及連接堿性液體源與所述液體生長培養(yǎng)基的第二入口。在一些實施方案中，所述生物反應器包含反應器腔室，其容積等于或小于約50毫升并且包含含有緩沖劑和至少一種生物細胞的液體生長培養(yǎng)基和在所述液體生長培養(yǎng)基上方的含有二氧化碳的氣體頂部空間；連接二氧化碳氣體源與所述氣體頂部空間的第一入口；以及所述反應器腔室中的傳感器，其被配置成測定所述液體生長培養(yǎng)基中的二氧化碳濃度和/或ph。根據某些實施方案，描述了運行生物反應器的方法。在一些實施方案中，所述方法包括：提供反應器腔室，其容積等于或小于約50毫升并且包含含有至少一種生物細胞的液體培養(yǎng)基和在所述液體生長培養(yǎng)基上方的含有二氧化碳的氣體頂部空間；以及運行所述反應器，使得所述頂部空間與所述液體培養(yǎng)基的主體之間的二氧化碳kla為至少約0.1小時-1并小于約15小時-1。在某些實施方案中，所述方法包括提供容積等于或小于約50毫升的反應器腔室。在一些實施方案中，所述反應器腔室包含含有至少一種生物細胞的液體培養(yǎng)基和在所述液體培養(yǎng)基上方的含有二氧化碳的氣體頂部空間。在一些實施方案中，所述方法包括向氣體頂部空間輸送含有二氧化碳的氣體并向液體生長培養(yǎng)基輸送堿性液體。當結合附圖考慮時，根據以下對本發(fā)明的多個非限制性實施方案的詳細描述，本發(fā)明的其他優(yōu)點和新穎特征將變得明顯。在本說明書和通過引用并入的文件存在矛盾和/或不一致的公開內容的情況下，應以本說明書為準。附圖說明將參照附圖以示例的方式描述本發(fā)明的非限制性實施方案，所述附圖是示意性的且并不意在按比例繪制。在附圖中，所示的每個相同或基本相同的部件通常用單一附圖標記表示。出于清楚的目的，沒有將每幅附圖中的每個部件都進行標記，并且在不需要示出就能夠使本領域的普通技術人員理解本發(fā)明的情況下，也沒有示出本發(fā)明每個實施方案的每個部件。在附圖中：圖1是根據一組實施方案的反應器系統(tǒng)的截面示意圖；圖2a至2c是根據某些實施方案的反應器腔室及其運行模式的截面示意圖；圖3是根據一些實施方案的包含多個串聯布置的反應器腔室的反應器系統(tǒng)的底視截面示意圖；圖4是根據某些實施方案的反應器系統(tǒng)的截面示意圖；圖5是用于根據一組實施方案的反應器系統(tǒng)的氣體歧管的截面示意圖；圖6是用于根據一些實施方案的反應器系統(tǒng)的氣體歧管的截面示意圖；圖7是根據某些實施方案的反應器系統(tǒng)的照片；圖8是根據一組實施方案的相位差相對于頻率的圖；圖9是根據一些實施方案的相位差相對于調制頻率的圖；圖10是根據某些實施方案的二氧化碳的校準圖；圖11是根據一組實施方案的使用氧傳感器獲得的氣體傳輸圖；圖12是根據一組實施方案的使用二氧化碳傳感器獲得的氣體傳輸圖；以及圖13是根據一組實施方案的示例性反應器系統(tǒng)的ph相對于其氣體混合物中二氧化碳的百分數的圖。具體實施方式本發(fā)明總體上提供了控制小容積反應器腔室中溶解的二氧化碳(co2)濃度水平和/或ph的策略及相關制品、系統(tǒng)和方法。在某些實施方案中，反應器腔室可被配置成包含至少一種生物細胞。例如，所述反應器腔室可以是生物反應器，例如微生物反應器。反應器腔室中的細胞可懸于液體培養(yǎng)基中，例如本領域普通技術人員已知的任何常用的細胞生長培養(yǎng)基。細胞生長培養(yǎng)基可包含例如必需氨基酸和/或輔因子。在一些實施方案中，反應器腔室包含在液體生長培養(yǎng)基上方的氣體頂部空間。某些實施方案涉及相對小的反應器中ph和co2水平的控制，所述相對小的反應器包括容積小于約50毫升的反應器。在某些實施方案中，反應器腔室的長寬比(aspectratio)小于約10(或小于約8，例如為約5至約8)，如通過用該反應器腔室的最大截面尺寸除以該反應器腔室的最小截面尺寸所測量的。出乎意料地發(fā)現，在這樣的小反應器中可控制ph和溶解co2水平，同時實現與在較大規(guī)模反應器中觀察到的性能類似的性能(包括氧和co2傳質速率)。在某些實施方案中，液體生長培養(yǎng)基包含緩沖劑如碳酸氫鹽緩沖液以使液體生長培養(yǎng)基中的co2和ph水平保持相對恒定。在某些實施方案中，可增加氣體頂部空間中的co2分壓，這可導致液體培養(yǎng)基的ph降低以及液體培養(yǎng)基中溶解co2的水平增加。在某些實施方案中，可降低氣體頂部空間中的co2分壓，這可導致液體培養(yǎng)基中的ph增加和溶解co2水平降低。在一些實施方案中，可向液體培養(yǎng)基中輸送堿性材料以控制液體的ph。例如，在某些實施方案中，可向液體培養(yǎng)基添加堿(例如，堿性液體)，例如基于碳酸氫根的堿(例如，碳酸氫鹽溶液)，這可增加液體培養(yǎng)基的ph并降低液體培養(yǎng)基中的溶解co2濃度。在一些實施方案中(例如，在其中希望改變液體培養(yǎng)基的ph并同時使溶解co2保持相對恒定的某些實施方案中)，可任選地結合添加堿性材料(例如，液體堿)和/或改變氣體頂部空間中的co2分壓之一或兩者，向液體培養(yǎng)基輸送酸性材料(例如，酸性液體)。反應器腔室可包括一個或更多個傳感器。傳感器可用于例如幫助控制液體培養(yǎng)基中的ph和/或co2水平。在某些實施方案中，反應器腔室包含與腔室中液體相接觸的至少co2傳感器和/或ph傳感器。在一些實施方案中，反應器腔室中的液體可以是經混合的和/或經充氣的。在某些實施方案中，反應器腔室可包括液體子腔室(液體生長培養(yǎng)基可包含在其中)和氣體子腔室。在某些實施方案中，所述液體子腔室和氣體子腔室可被可移動壁(例如柔性膜)隔開。在一些實施方案中，可移動壁可對至少一種氣體(例如，氧氣和/或二氧化碳)是可滲透的。如下文更詳細描述的，在一些實施方案中，在反應器腔室中的混合和充氣可通過以下來實現：將多個反應器腔室串聯布置并對一個或更多個氣體子腔室加壓，這可導致鄰近經加壓子腔室的可移動壁變形(deflection)并導致下方子腔室中的至少部分液體排放到串聯的其他反應器腔室。此類反應器腔室中的混合和充氣還可通過氣體經由直接接觸(例如在氣體和液體組分未被可移動壁隔開的情況下)或通過co2和/或其他氣體可滲透的膜(例如，在氣體和液體組分被可移動壁隔開的情況下)從氣體頂部空間擴散到液體中來實現。采用此類混合和充氣方法的反應器在例如ram等于2011年9月30日提交的標題為“deviceandmethodforcontinuouscellcultureandotherreactions”的美國專利申請序列no.13/249,959和lee于2003年11月18日提交的標題為“peristalticmixingandoxygenationsystem”的美國專利申請公開no.2005/0106045中進行了描述，其每一篇均出于所有目的通過引用整體并入文本。在某些實施方案中，緩沖劑的使用、酸性材料注入、堿性材料注入和/或向氣體頂部空間中輸送co2可用作控制液體培養(yǎng)基中co2濃度和/或ph的方案的一部分。例如，溶解co2和/或ph水平可通過首先測量液體培養(yǎng)基中的ph和/或溶解co2水平來控制。在一些實施方案中，可調節(jié)ph和/或溶解co2水平，例如，通過增加或減小氣體頂部空間(與液體培養(yǎng)基直接接觸或與液體培養(yǎng)基被可移動壁隔開)中的co2分壓，通過向液體培養(yǎng)基中注入堿性材料(例如，含有碳酸氫鹽的溶液或其他堿性材料，任選液體形式的堿性材料)，通過向液體培養(yǎng)基中注入酸性材料(例如，酸性液體)和/或通過向液體培養(yǎng)基添加緩沖劑(例如，基于碳酸氫根的緩沖劑)。在某些實施方案中，液體培養(yǎng)基中的ph和co2水平可獨立地使用本文所概述的策略進行調節(jié)。在某些實施方案中，液體培養(yǎng)基中的ph和co2水平可獨立于液體培養(yǎng)基的摩爾滲透壓濃度進行調節(jié)。例如，在一些實施方案中，可調節(jié)液體培養(yǎng)基的ph而不調節(jié)液體培養(yǎng)基的摩爾滲透壓濃度。在一些實施方案中，可調節(jié)液體培養(yǎng)基中的溶解co2濃度而不調節(jié)液體培養(yǎng)基的摩爾滲透壓濃度。圖1是根據一組實施方案的生物反應器系統(tǒng)100的截面示意圖。在圖1中，生物反應器系統(tǒng)包含反應器腔室102。反應器腔室102可包含液體生長培養(yǎng)基104。在某些實施方案中，液體生長培養(yǎng)基104可包含至少一種生物細胞，例如，當生物反應器系統(tǒng)100用作細胞生長系統(tǒng)時。液體生長培養(yǎng)基104可包含任何類型的生物細胞或細胞類型(例如，原核細胞和/或真核細胞)。例如，所述細胞可以是細菌(例如，大腸桿菌(e.coli))或其他單細胞生物、植物細胞或動物細胞。如果所述細胞是單細胞生物，則所述細胞可以是例如，原生動物、錐蟲、變形蟲、酵母細胞、藻類等。如果所述細胞是動物細胞，則所述細胞可以是例如無脊椎動物細胞(例如，來自果蠅的細胞)、魚細胞(例如，斑馬魚細胞)、兩棲動物細胞(例如，蛙細胞)、爬行動物細胞、鳥細胞或哺乳動物細胞(例如靈長類細胞、牛細胞、馬細胞、豬細胞、山羊細胞、狗細胞、貓細胞或來自嚙齒動物如大鼠或小鼠的細胞)。在一些實施方案中，所述細胞可以是人細胞。在一些實施方案中，所述細胞可以是倉鼠細胞，例如中國倉鼠卵巢(cho)細胞。如果所述細胞來自多細胞生物，則該細胞可來自所述生物的任何部分。例如，如果所述細胞來自動物，則所述細胞可以是心臟細胞、成纖維細胞、角質形成細胞、肝細胞、軟骨細胞、神經細胞、骨細胞、肌細胞、血細胞、內皮細胞、免疫細胞(例如，t細胞、b細胞、巨噬細胞、嗜中性粒細胞、嗜堿性粒細胞、肥大細胞、嗜酸性粒細胞)、干細胞等。在一些情況下，所述細胞可以是基因工程細胞。反應器腔室102可包含氣體頂部空間106。氣體頂部空間106可位于反應器腔室102中的液體生長培養(yǎng)基104上方。在某些實施方案中，氣體頂部空間106與液體生長培養(yǎng)基104可直接接觸。在此類系統(tǒng)中，圖1中的界面108可相當于氣液界面。在另一些實施方案中，氣體頂部空間106與液體生長培養(yǎng)基104可被可移動壁隔開。例如，界面108可相當于柔性膜。在采用這種柔性膜的一些實施方案中，所述膜可對至少一種氣體是可滲透的。例如，在某些實施方案中，所述柔性膜可對氧和/或二氧化碳是可滲透的。在某些實施方案中，所述氣體頂部空間可包含二氧化碳。在某些實施方案中，頂部空間中的二氧化碳濃度可以是足夠高的，使得可將二氧化碳從氣體頂部空間106輸送至液體生長培養(yǎng)基104。二氧化碳從氣體頂部空間106向液體生長培養(yǎng)基104的遞送速率和/或液體生長培養(yǎng)基中的二氧化碳平衡濃度和/或ph可例如通過調節(jié)氣體頂部空間106中二氧化碳的分壓來調節(jié)。這可例如通過向氣體頂部空間106中輸送比該氣體頂部空間中存在氣體含有更多或更少的二氧化碳的氣體來實現。因此，在某些實施方案中，反應器腔室102包括連接二氧化碳氣體源112與氣體頂部空間106的第一入口110。源112可以是任何合適的源，例如氣罐。在某些實施方案中，源112可包含基本上純的二氧化碳(例如，至少約80％的二氧化碳、至少約90％的二氧化碳、至少約95％的二氧化碳或至少約99％的二氧化碳)，而在另一些實施方案中，源112可包含與可與生物反應器系統(tǒng)100聯合使用的一種或更多種其他氣體混合的二氧化碳，所述其他氣體例如氧氣(可用于向液體生長培養(yǎng)基104通氣)、氮氣和/或惰性氣體(例如氦氣或氬氣，其可用于驅動可移動壁208以引起液體生長培養(yǎng)基104中的混合，如其他部分更詳細描述的)。任選地，反應器腔室102可包括可用于將氣體從氣體頂部空間106輸送出去的出口111。在一些實施方案中，改變二氧化碳的分壓可用于控制ph。在某些實施方案中，液體生長培養(yǎng)基104的ph可通過向液體培養(yǎng)基中引入酸性材料和/或堿性材料來調節(jié)。因此，在一些實施方案中，反應器腔室102包括第二入口114。第二入口114可與堿性液體(例如，包括ph大于或等于7.5、大于或等于8.5、大于或等于9.5、大于或等于11或者更大的堿性液體)源連接。在某些實施方案中，堿性液體可經由入口114輸送至液體生長培養(yǎng)基104，從而可增加液體生長培養(yǎng)基104的ph。可使用任何合適的堿性液體源。在某些實施中，堿性液體可以是基于碳酸氫根的堿性液體(即，其可包含碳酸氫根離子，hco3-)。此類堿性溶液可例如通過將碳酸氫鹽(例如，碳酸氫鈉、碳酸氫鉀等)溶于諸如水的溶劑中來形成。一般來說，任何合適的堿(例如，氫氧化物堿)均可用于堿性液體。在一些實施方案中，所述反應器腔室可在設定的溫度范圍內運行。一般來說，反應器的運行溫度可以是允許原核細胞和/或真核細胞生長和增殖的任何合適溫度。在某些實施方案中，反應器腔室的運行溫度為約20℃至約45℃、約25℃至約45℃、約30℃至約45℃、約30℃至約40℃、約33℃至約38℃、約25℃至約40℃或約20℃至約40℃。例如，在反應器腔室包含真核細胞(例如，哺乳動物細胞)的某些實施方案中，反應器腔室的運行溫度可為約30℃至約45℃(例如，約30℃至約40℃、約33℃至約38℃、約37℃)。在另一實例中，在反應器腔室包含原核細胞(例如，細菌)的一些實施方案中，反應器腔室的運行溫度可為約20℃至約40℃(例如，約25℃至約40℃、約30℃至約40℃、約30℃)。在一些實施方案中，反應器腔室102包含與酸性液體(例如，包括ph小于或等于6.5、小于或等于5.5、小于或等于4.5、小于或等于3或者更小的酸性液體)源連接的入口。在某些實施方案中，酸性液體可經由入口(例如，入口114或另一入口)輸送至液體生長培養(yǎng)基104，這可降低液體生長培養(yǎng)基104的ph?？墒褂萌魏晤愋偷乃?例如，無機酸、有機酸)。在某些實施方案中，所述酸是強酸。所述酸也可以是弱酸。例如，所述酸可包括鹽酸(hcl)、硫酸(h2so4)、硝酸(hno3)或任何其他合適的酸。在某些實施方案中，可使用單一入口(例如，入口114)將堿和酸(例如，在不同時間)輸送到液體生長培養(yǎng)基104中。在這種情況下，與入口114連接的導管可以是分成二枝的，使得一個上游部分與酸源連接，而另一個上游部分與堿性液體源連接。任選地，反應器腔室102可包括可用于將液體培養(yǎng)基從室102中輸送出去的出口115。在某些實施方案中，反應器腔室102包括一個或更多個傳感器。例如，反應器腔室102可包括ph傳感器和/或二氧化碳傳感器?？蓪⒁粋€或更多個傳感器可定位成或以其他方式配置成與液體生長培養(yǎng)基104接觸，以測量液體培養(yǎng)基的性質。一個或更多個其他類型的傳感器可定位成或以其他方式配置成與氣體頂部空間106接觸以測量氣體頂部空間中氣體的性質。在某些實施方案中，液體生長培養(yǎng)基104可包含可幫助控制液體培養(yǎng)基ph的緩沖劑?？墒褂枚喾N類型的緩沖液。在某些實施方案中，緩沖劑包括碳酸氫根(即，hco3-)緩沖劑。與碳酸氫根緩沖劑有關的化學反應概括如下：可使用的另一些緩沖劑包括例如基于硫酸根的緩沖劑、基于乙酸根的緩沖劑、基于磷酸根的緩沖劑等。在某些實施方案中，反應器腔室的容積可相對小。例如，反應器腔室的容積可等于或小于約50毫升、等于或小于約10毫升或者等于或小于約2毫升(和/或，在某些實施方案中，等于或大于10微升、等于或大于100微升或者等于或大于1毫升)。在一些實施方案中，反應器腔室可被配置成含有(和/或在反應器的運行期間含有)體積等于或小于約50毫升、等于或小于約10毫升或者等于或小于約2毫升(和/或，在某些實施方案中，等于或大于10微升、等于或大于100微升或者等于或大于1毫升)的液體培養(yǎng)基。在某些實施方案中，本文所述的反應器可被配置成使得在運行期間，頂部空間的主體與液體培養(yǎng)基的主體之間的二氧化碳的kla類似于已成功用于大得多的反應器的kla值。在某些實施方案中，可運行反應器使得頂部空間的主體與液體培養(yǎng)基的主體之間的二氧化碳的kla為至少約0.1小時-1或至少約1小時-1。在某些實施方案中，可運行反應器使得頂部空間的主體與液體培養(yǎng)基的主體之間的二氧化碳的kla小于或等于約15小時-1、小于或等于約10小時-1或者小于或等于約5小時-1。參數kla(通常稱為體積傳質系數)是本領域的普通技術人員所熟知的，其用于描述反應器系統(tǒng)中氣體的輸送，例如v.linek、p.benes和v.vacek，“measurementofaerationcapacity0ffermenters，”chem.eng.technol.，1989，第12卷，第1期，第213-217頁中所述的。kla中的“kl”部分一般指傳質系數，其涵蓋從液體輸送至氣體的所有阻力。kla中的“a”部分指液體與氣體之間的界面面積。kla是kl乘以a的所得的結果。本領域的普通技術人員通過以下過程能夠計算給定反應器系統(tǒng)在運行期間的二氧化碳的kla值：重建運行條件，隨后向該反應器的氣體頂部空間中注入純氮氣(動態(tài)充氣法)并構建作為時間酯函數的ln(1-dco2)的曲線，其中dco2定義為：其中cco2是在給定時間點的co2濃度，并且c＊co2是在其飽和點時液體培養(yǎng)基中的co2濃度。在構建這樣的曲線之后，曲線斜率的絕對值相當于co2的kla。也就是說，kla是當氣體頂部空間中的co2分壓改變時培養(yǎng)基中溶解co2濃度的衰減或上升的時間常數。多個參數可影響二氧化碳的kla值，包括混合速率、反應器腔室的容積和頂部空間中的co2分壓。出乎意料地發(fā)現，對于容積為50毫升或更小的反應器而言，理想的co2的kla值(包括上文概述的kla值)可通過使用相對慢地(例如，在約5秒或更長時間內)實現基本完全混合(即，約95％完全混合或更多)的混合速率來獲得。此外，反應器頂部空間中可有利地采用以下co2分壓：約0％至約20％、約1％至約20％、約2％至約15％、約2％至約10％、約3％至約7％或約5％，例如，當相對于大氣壓力的總頂部空間氣體壓力為約0磅/平方英寸至約15磅/平方英寸、約1磅/平方英寸至約15磅/平方英寸、約0psi至約10磅/平方英寸、約1磅/平方英寸至約10磅/平方英寸、約1磅/平方英寸至約5磅/平方英寸、約2磅/平方英寸至約4磅/平方英寸、約2.5磅/平方英寸至約3.5磅/平方英寸、或約3磅/平方英寸時。在某些實施方案中，可有利地將反應器腔室中液體培養(yǎng)基的高度(即，液體頂部與反應器腔室底部之間的距離)設定為約0.05英寸至約0.5英寸。應認識到，在某些實施方案中，可采用另一些液體高度，例如約0.05英寸至2英寸、約0.5英寸至2英寸、約0.05英寸至1英寸或約1英寸至2英寸如上所述，在某些實施方案中，氣體頂部空間106和液體生長培養(yǎng)基104直接接觸。在另一些實施方案中，氣體頂部空間106和液體生長培養(yǎng)基104被可移動壁隔開。采用此類布置的反應器在例如ram等于2011年9月30日提交的標題為“deviceandmethodforcontinuouscellcultureandotherreactions”的美國專利申請序列no.13/249,959以及l(fā)ee于2003年11月18日提交的標題為“peristalticmixingandoxygenationsystem”的美國專利申請公開no.2005/0106045中進行了描述，其每一篇均出于所有目的通過引用整體并入文本。圖2a至2c是概述流體如何可通過偏轉可移動壁輸送進出反應器腔室之液體子腔室的橫截面示意圖。在圖2a至2c中，反應器系統(tǒng)200包含反應器腔室202。在某些實施方案中，圖2a至2c中的反應器腔室202相當于圖1中的反應器腔室102。反應器腔室202可包含液體子腔室203。液體子腔室203可被配置成包含含有至少一種生物細胞的液體生長培養(yǎng)基。在某些實施方案中，反應器腔室202可包含氣體子腔室206。氣體子腔室206可被配置成包含在液體子腔室203中的液體生長培養(yǎng)基上方的氣體頂部空間。反應器腔室202還可包含可將液體子腔室203與氣體子腔室206隔開的可移動壁208?？梢苿颖?08可包括例如柔性膜。在某些實施方案中，所述可移動壁由對至少一種氣體可滲透的介質(即，氣體可滲透介質)形成。在某些實施方案中，例如，可移動壁可對氧氣和/或二氧化碳氣體是可滲透的。在可移動壁208對氣體(例如，氧氣和/或二氧化碳)可滲透的這種實施方案中，氣體子腔室206中的氣體可被輸送至液體子腔室203，或者反之亦然。這種輸送可用于例如將氧氣輸送到液體子腔室203中和/或通過將二氧化碳輸送進出液體子腔室203來控制ph。在某些實施方案中，反應器系統(tǒng)200可包含氣體入口導管204，其可被配置成向氣體子腔室206中輸送氣體。圖2a至2c中的氣體入口導管204可相當于圖1中所示的氣體入口導管110。向氣體子腔室206中輸送的氣體可來源于例如氣體源216。可使用任何合適的氣體源作為氣體源216，例如氣體鋼瓶。在某些實施方案中，氣體源216是氧氣源和/或二氧化碳源。在一些實施方案中，反應器系統(tǒng)200包含氣體出口導管212，其被配置成將氣體輸送出氣體子腔室206。在某些實施方案中，圖2a至2c中的氣體出口導管212可相當于圖1中所示的氣體出口導管111。在一些實施方案中，反應器系統(tǒng)200包括連接氣體入口導管204與氣體出口導管212的氣體旁路導管210。在某些實施方案中，氣體旁路導管210可被配置成使得其在反應器腔室202的外部。在某些實施方案中，反應器系統(tǒng)200還可包含液體入口導管211和液體出口導管214。在某些實施方案中，可驅動可移動壁208使得可改變液體子腔室203和氣體子腔室206的容積。例如，某些實施方案涉及將來自氣體源216的氣體通過氣體入口導管204輸送至氣體子腔室206以使可移動壁208變形。可移動壁208的變形可例如通過以下來實現：配置反應器200使得當氣體被輸送到氣體子腔室206中時使氣體子腔室206加壓。這種加壓可通過例如在氣體正被供應至氣體子腔室206時限制氣體流出氣體出口導管112(例如，使用閥或其他合適的流量限制裝置)來實現。在某些實施方案中，變形的可移動壁208可導致液體至少部分從液體子腔室203中排出。例如，在圖2b中，可移動壁是已變形的，使得液體子腔室203中基本上所有的液體都已從反應器腔室202中排出。這種運行可用于將液體子腔室203中的液體輸送至其他反應器中的其他液體子腔室，例如下文更詳細描述的圖3中所示的。在某些實施方案中，在已將液體子腔室203中的至少部分液體從液體子腔室203移除之后，可減少氣體向氣體子腔室206的氣體供應使得可移動壁208向其初始位置返回(例如，圖2a中所示的位置)。在某些實施方案中，使可移動壁208變形(deflected)，使得氣體子腔室206中的至少部分氣體從該氣體子腔室中移出。例如，如下文更詳細描述的，如果液體例如由另一上游反應器從液體入口導管211進入液體子腔室203的話，可移除此類氣體。某些實施方案包括以下步驟：至少第二次由氣體源216將氣體供應至氣體子腔室206以使可移動壁變形，從而使液體至少部分從液體子腔室203移除。當重復進行此氣體引入步驟時，可移動壁208可充當將液體輸送進出液體子腔室203的泵送裝置的一部分。這樣的運行在ram等于2011年9月30日提交的標題為“deviceandmethodforcontinuouscellcultureandotherreactions”的美國專利申請序列no.13/249,959中進行了詳細的描述。在向氣體子腔室206中多次輸送氣體的某些實施方案中，氣體可從氣體源通過氣體旁路導管210來輸送?？赏ㄟ^氣體旁路導管210輸送氣體以從進氣口導管204中移除液體而不將液體輸送至氣體子腔室206。例如，在某些實施方案中，可將氣體旁路導管210與氣體入口205之間的第一閥門關閉并且可將氣體旁路導管210與氣體出口207之間的第二閥門關閉(并且可將氣體旁路導管210中的任何閥門打開)，使得當將氣體通過氣體入口導管204輸送時，氣體重新通過氣體旁路管段210并隨后從氣體出口導管212出來。這種操作可用于將任何不想要的濃縮液排出氣體入口導管，從而可提高本文其他部分所述的氣體供應方法的性能。在一些實施方案中，可布置多組反應器腔室(例如串聯)使得沿一個或更多個流體路徑實現流體混合。圖3是說明可用于在多個串聯連接的反應器腔室102a至102c之間建立混合的液體流動路徑的底視截面示意圖，如ram等于2011年9月30日提交的標題為“deviceandmethodforcontinuouscellcultureandotherreactions”的美國專利申請序列no.13/249,959中所述的。在圖3中，反應器系統(tǒng)300包括箭頭310所示的第一流體路徑。第一流體路徑可包括第一反應器腔室102a、第二反應器腔室102b和第三反應器腔室102c。反應器系統(tǒng)300還包括導管321、322和323，這些導管相當于反應器腔室102a至102c的液體入口導管和/或液體出口導管。例如，在圖3中，導管321是反應器腔室102b的液體入口導管和反應器腔室102a的液體出口導管；導管322是反應器腔室102c的液體入口導管和反應器腔室102b的液體出口導管；并且導管322是反應器腔室102a的液體入口導管和反應器腔室102c的液體出口導管。當然，還可使液體的流動反向使得導管321、322和323相對于反應器腔室102a至102c中的每一個承擔相反的作用。反應器系統(tǒng)300還可包括液體輸入導管350和液體輸出導管351，這些導管可用于將液體輸送進出反應器腔室102a、102b和102c中的液體子腔室。閥門352可位于液體輸入導管350中，并且閥門353可位于液體輸出導管351中以抑制或防止在運行期間液體從混合系統(tǒng)中流出。在某些實施方案中，可驅動反應器腔室102a至102c的可移動壁以使沿流體路徑310輸送(和/或沿與路徑310相反方向的流體路徑)液體。這可例如通過依次驅動反應器腔室102a至102c中的可移動壁使得液體沿受控方向輸送來實現。在一些實施方案中，可將反應器腔室102a至102c中的每一個配置成使得其各自能夠采取關閉位置，其中可移動壁208是變形的(strained)，從而減小液體子腔室的體積，例如，如圖2b中所示。蠕動混合可通過例如驅動反應器腔室102a至102c使得其運行狀態(tài)在打開(圖2a或2c)與關閉(圖2b)配置之間交替來實現。在一些實施方案中，可采用三種模式來實現蠕動泵送：第一種模式，其中關閉反應器腔室102a的液體子腔室并打開反應器腔室102b和102c中的液體子腔室；第二種模式，其中關閉反應器腔室102b的液體子腔室并打開反應器腔室102a和102c中的液體子腔室；和第三種模式，其中關閉反應器腔室102c的液體子腔室并打開反應器腔室102a和102b中的液體子腔室。通過在這三種模式之間轉換(例如，從第一種模式變成第二種模式、從第二種模式變成第三種模式并從第三種模式變成第一種模式等)，可沿順時針方向在反應器腔室102a至102c之間輸送液體(如圖2a至2b中所示)。當然，通過重新排列這三種模式發(fā)生的順序(例如，通過從第一種模式變成第三種模式、從第三種模式變成第二種模式并從第二種模式變成第一種模式等)，還可沿逆時針方向輸送液體。下列實施例旨在說明本發(fā)明的某些實施方案，而并不舉例說明本發(fā)明的全部范圍。實施例該實施例描述了整合了本發(fā)明的二氧化碳濃度和ph控制方法的反應器系統(tǒng)的設計和運行。生物制劑(例如單克隆抗體、重組蛋白和基于核酸的蛋白質)在制藥業(yè)中的用途在過去十年里已被普遍認可。因為治療性單克隆抗體一般比傳統(tǒng)的細胞毒性藥物具有更少的副作用，所以其使多種腫瘤學治療發(fā)生了革命性改變。在2007年，市場上有22種治療性單克隆抗體，價值超過170億美元，并且預期到2013年，全球市場將增加至約490億美元。一些公知經批準的單克隆抗體治療為用于癌癥的rituxan、用于關節(jié)炎的remicade、用于肺病的synagis和用于乳腺癌的herceptin。目前，多于50％的制藥行業(yè)投資管線由重組蛋白和單克隆抗體組成，并且每年開發(fā)超過600種的新生物制劑。治療性重組蛋白和單克隆抗體由經基因改良成過量產生治療性蛋白質的重組哺乳動物細胞產生。在很多情況下，哺乳動物細胞系可以是優(yōu)選的，因為其含有可合成、折疊和化學修飾蛋白質以形成三級結構(例如糖基化)的細胞器和酶，這對于蛋白質的治療功能是重要的。后面的過程被稱為翻譯后修飾。在無需對蛋白質進行翻譯后修飾的一些情況下，一些重組蛋白(例如胰島素)可在更健壯且生長更快的細胞(例如大腸桿菌(escherichiacoli))中產生。然而，目前，生產中的大多數治療性蛋白質需要進行僅可在真核細胞中發(fā)現的翻譯后糖基化，其中的約70％使用中國倉鼠卵巢(chinesehamsterovary，cho)細胞系來生產。盡管生物制劑市場在快速增長，但是生物制藥公司不斷面臨著衛(wèi)生保健提供者要降低成本的壓力。此外，從生物制劑的發(fā)現到市場化的長時間經常導致早期專利期滿和利潤損失。來自仿制藥的競爭也驅使生物制藥公司尋找降低研發(fā)和制備成本的路徑。此外，制藥公司還迫切地需要研發(fā)大量新藥物的產品組合以領先于對手生物制藥公司。通常，新藥物需要約6至9年的時間來經歷開發(fā)、制備、臨床試驗和fda批準，之后才能在市場上出售?？s短市場化的時間具有很多益處，包括在藥物投放市場時專利具有較長的有效性，同時測試并開發(fā)更多種生物制劑以增加發(fā)現重磅炸彈(blockbuster)藥物之機會和降低總藥物成本的能力。目前，用于產生重組蛋白的上游開發(fā)工藝是非常復雜和耗時的。對于待經fda批準的藥物蛋白，所產生的重組藥物的質量必須具有一致性，特別地，治療性蛋白質的糖基化和有效性必須保持相同的質量，即使是不同的培養(yǎng)批次。由于重組蛋白糖基化的質量可受工藝條件影響，因此對生物反應器中工藝參數的控制和監(jiān)測就變得非常重要。此外，由于治療性單克隆抗體長期以高劑量使用，因此，為了滿足市場需求，如果細胞培養(yǎng)物能夠產生高產物效價并同時保持相同的產品質量，則是有利的。在生產批次的放大和縮小期間，都應維持所有的這些要求。用于生產重組蛋白的生物工藝的上游研發(fā)一般包括以下四個階段：1.克隆選擇、2.克隆穩(wěn)定性測試、3.工藝開發(fā)和4.放大實驗。首先，使1000個克隆在靜止的96孔板中生長，根據酶聯免疫吸附測定(elisa)結果找到最快生長者和最高產生者克隆。然后，使選擇的克隆(通常約50至100個克隆)在搖瓶中生長，其攪動環(huán)境與生物反應器類似，但不進行任何ph、溫度、溶解氧(do)或進料速率控制。在該階段中還可進行穩(wěn)定性測試以確?？寺≡诮洑v很多代后沒有突變。從搖瓶實驗僅選出4至6個克隆，并將其轉移至實驗臺規(guī)模實驗，之后放大至大規(guī)模工業(yè)生物反應器。在此階段存在決定所選擇克隆的數目的成本限制因素，因為實驗規(guī)模的(benchtop)生物反應器和放大實驗運行的成本非常高。這種選擇工藝具有風險，原因是有證據證明僅通過在96孔板中測量生長和生產力作為單一終點的克隆選擇不是選擇穩(wěn)定細胞的預測因子(predictor)。此外，不對ph、do或進料進行儀器檢測或控制的搖瓶可能不能選擇具有穩(wěn)定糖基化特征譜的最有生產力的克隆，因為產物效價和質量可受實際工藝條件影響。因此，常規(guī)上游開發(fā)方案中缺失的重要技術是具有在線傳感器的微型化高通量和儀器化二代克隆選擇系統(tǒng)，其幾乎剛好就是工業(yè)生物反應器的縮小模型，其容積足以用于線下(offline)表征產品效價、糖基化特征譜和其他重要工藝條件。在不久的將來，生物制藥公司將研究建立幫助闡明進料速率、物理和化學脅迫對細胞代謝狀態(tài)的影響的細胞功能模型。通過采用質量源于設計(qualitybydesign，qbd)的方法，具有預測制備條件對工業(yè)上相關細胞系之影響的模型將大大加速上游工藝的優(yōu)化。通常，重組蛋白的過表達受動力學尚未充分了解的酶限制了速率。了解影響細胞生產力的速率限制步驟將大大減少發(fā)現用于重組細胞系的最佳加工條件所需的實驗。形成完整細胞功能模型所需的大數據庫需要這樣的高通量平臺，其可以以比實驗臺規(guī)模生物反應器低得多的運行成本但使用同一組儀器來運行。這種微型化生物技術平臺將必須是自動化的并且平行進行至少20個實驗，從而在合理的時間范圍中完成實驗。中國倉鼠卵巢(cho)細胞系是用于生產重組蛋白治療劑的一種重要細胞系，其占生物治療市場的約70％，遠超過其他常用的哺乳動物細胞系，例如3t3、btk、hela和hepg2。在2006年，僅使用cho細胞生產的生物制劑產品的全球銷售額就超過300億美元。隨著在擴大由cho細胞生產的生物制劑之范圍方面的興趣迅速增長，越來越需要在高通量微型生物反應器(例如微流體裝置和孔板)，特別用于重組cho細胞研究和生物技術工藝優(yōu)化的高通量微型生物反應器中的上游研發(fā)。近年來，已出現用于微生物細胞系之上游研發(fā)的微流體裝置和孔板形式的微型生物反應器。用于哺乳動物細胞系(例如cho細胞系)的微型生物反應器的研發(fā)還未獲得足夠的動力，這主要是因為當嘗試使這些微生物微型生物反應器適用于更敏感的哺乳動物細胞系時復雜性增加。表1中列出了為哺乳動物細胞系以及酵母和大腸桿菌(細菌細胞系)而設計的微型生物反應器的設計標準。表1：基于當前工業(yè)工藝所獲得的參數的微型生物反應器的標準。與細菌或酵母細胞不同，中國倉鼠卵巢(cho)細胞的生長和生產力對工藝條件非常敏感。與大多數哺乳動物細胞一樣，cho細胞在物理和化學脅迫下可容易地經歷壞死細胞或凋亡細胞死亡。為了給出其對剪切應力的敏感性的認識：cho細胞的剪切應力耐受性比生物技術中常用的細菌類型大腸桿菌(e.coli)細胞的剪切應力耐受性低約3個數量級。高于0.005nm-2的剪切應力顯示出因內質網(負責蛋白質折疊和糖基化的細胞器)發(fā)生形態(tài)變形而影響cho細胞中的蛋白質糖基化。因此，應將微型生物反應器設計成具有產生低剪切應力但仍提供快到足以防止可導致營養(yǎng)饑餓或毒性之大梯度的混合的混合器。此外，與因其短得多的倍增時間(約1小時)而可僅持續(xù)多至4天的大腸桿菌培養(yǎng)相比，因為cho細胞的長倍增時間(22至24小時)，對于cho細胞一般需要長得多的培養(yǎng)時間，通常2至3周長。對于長期培養(yǎng)而言，蒸發(fā)因為小工作體積的微型生物反應器的高表面/體積比而變成主要問題。水分損失也可導致培養(yǎng)基的摩爾滲透壓濃度在5天內增加至毒性水平。對于進行長期培養(yǎng)物(例如cho細胞培養(yǎng)物)的微型生物反應器而言，一般需要采用蒸發(fā)補償策略。cho細胞較長的倍增時間還使得培養(yǎng)物更容易被污染，因為cho細胞可輕易被生長更快的酵母和細菌細胞取代。因此，微型生物反應器應能夠在整個10至14天的培養(yǎng)持續(xù)時間中保持無菌，并且所有的過程(包括樣品移除和孵育)必須在不損壞生長腔室之無菌性的情況下來進行。自中國倉鼠卵巢(cho)細胞被廣泛用于制備治療性蛋白質以來，其已得到了非常廣泛的研究并且其最佳生長條件也已進行了充分報道。cho細胞培養(yǎng)的一個重要工藝參數是培養(yǎng)基中的二氧化碳分壓pco2。pco2還影響培養(yǎng)基的ph和摩爾滲透壓濃度，如方程1所示移除co2可增加培養(yǎng)基的ph并降低其摩爾滲透壓濃度。培養(yǎng)基中的高pco2還可導致細胞的內部ph——phi降低，原因是co2是非極性的并因此自由擴散通過細胞膜。phi降低可改變細胞代謝并影響胞質酶的性能。此外，細胞質ph的改變還可改變內質網中的ph，從而影響蛋白質的翻譯后加工，例如糖基化和分泌。由于co2是細胞代謝的副產物，因此有效的cho細胞生物反應器中應包括co2的有效去除。co2氣體還可用于控制ph，并且其相對于液體酸添加是優(yōu)選策略，原因是其不會使培養(yǎng)基的摩爾滲透壓濃度增加得與添加液體一樣多。然而，當cho細胞達到高濃度時，co2氣體去除可變得更加困難，而添加液體堿將更有效地中和由培養(yǎng)基中co2氣體累積而導致的酸性。出于這些原因，pco2控制對cho細胞微型生物反應器來說是非常重要的，原因是其影響cho細胞的摩爾滲透壓濃度、ph和糖基化。pco2的最佳范圍為31mmhg至75mmhg(0.04大氣壓至0.10大氣壓)，如果其超過99mmhg(0.13大氣壓)，則其可能對cho細胞的生長、生產力和產物質量有害。另外要注意的是，已顯示出輕度缺氧導致細胞耗氧量下降而不影響細胞生長速率、最大細胞密度、重組蛋白生產速率或重組蛋白活性。cho細胞系在ph為7.0至7.6的培養(yǎng)基中還顯示出增強的生長。如果ph超過8.2或下降至6.9以下，則蛋白質糖基化一般會受到影響，原因是未質子化的nh3在高ph下(參見方程2)和co2在低ph下(參見方程1)擴散通過細胞膜可改變高爾基體的內部ph。如文獻中所報道的，cho細胞的葡萄糖攝取速率qglc為1.0mmol/1010個細胞/小時至1.5mmol/1010個細胞/小時，氧消耗速率qglc為1.25mmol/1010個細胞/小時至1.5mmol/1010個細胞/小時，并且乳糖產生速率與葡萄糖消耗速率之比ylac，glc為1.1至1.2。通常，對cho細胞培養(yǎng)而言，期望的摩爾滲透壓濃度為260mosm/kg至320mosm/kg，與290mosm/kg下的血清類似。隨著摩爾滲透壓濃度從320mosm/kg增加至375mosm/kg和435mosm/kg，哺乳動物細胞的死亡專率(specificdeathrate)顯示出穩(wěn)定增加。實驗室規(guī)模生物反應器是規(guī)模為工業(yè)生物反應器之1/1000至1/10,000的工業(yè)生物反應器之縮小模型的標準。由于體積和表面積的尺度與長度不同，因此細胞經歷的物理和化學環(huán)境是不同的，即使是在與工業(yè)生物反應器幾何學上相同的實驗室規(guī)模生物反應器中也是如此。細胞的物理和化學環(huán)境可嚴重影響細胞的生理學和生產力，因此在放大期間應使其保持恒定或者使其保持在臨界值界限內。首先，o2和co2的氣體傳輸速率應足夠高使得溶解氧水平保持在細胞的氧攝取速率之上，并且有效去除諸如二氧化碳的廢氣。其次，細胞經歷的最高剪切速率應保持與在放大期間影響生產力的臨界值相同或者比其低。因為其剪切敏感性，所以這可能對哺乳動物細胞(例如cho)尤其重要。循環(huán)時間也是一個重要參數，因為其影響細胞經歷高剪切的頻率。據報道，內質網的反復變形影響蛋白質糖基化。在細胞循環(huán)返回到葉輪頂端之前，具有不同腔室容積的生物反應器具有很不同的循環(huán)時間，并因此一些實驗室規(guī)模生物反應器配備有循環(huán)管路，從而使細胞的物理環(huán)境能夠模擬大工業(yè)規(guī)模生物反應器中所見到的循環(huán)時間。另一方面，微型生物反應器的混合速率必須足夠快且均勻，使得培養(yǎng)物中不存在細胞營養(yǎng)饑餓或具有大濃度梯度的區(qū)域。當設計生物反應器的縮小模型時，應使能量耗散率保持基本恒定，使得內部能量向細胞的轉移保持基本恒定。已開發(fā)了圖4中所示的新反應器設計來用于培養(yǎng)細胞(包括cho細胞)，該新反應器設計在本實施例中稱為防蒸發(fā)補償驅動器(resistiveevaporationcompensatedactuator，reca)微型生物反應器。該反應器包括5個注入用的儲存器，包括用于蒸發(fā)補償的包含無菌水的儲存器。另外四個儲存器可用于碳酸氫鈉(nahco3)堿注入、進料和其他必需補充。注入可通過經pdms膜驅動的蠕動泵依次將流體塞推進生長腔室中來進行。在該實施例中，生長腔室的容積為2毫升。均勻混合可通過將流體推動通過連接3個生長腔室的小通道獲得，每個生長室的容積均為1毫升。在生長室之后還定位有取樣用的10微升儲存器。取樣可通過蠕動泵送10微升樣品(plug)來進行。除與生長腔室連接之外，樣品儲存器還經由通道與無菌水管路和干凈空氣管路連接?？赏ㄟ^樣品儲存器注射空氣以將任何剩余的樣品排入到取樣容器(例如eppendorf管)，并且在此之后可注入水來清洗樣品儲存器并移除剩余的任何細胞培養(yǎng)物或細胞。然后，可通過存儲器傳送干凈的空氣以干燥這些室，使得沒有任何水留下稀釋下一樣品?？稍诿總€取樣步驟之后重復該過程。reca微型生物反應器與氣體歧管的連接示于圖5中。所有的儲存器輸入閥可共用同一氣體管路，因為不必對各輸入閥進行單獨控制?？蓪Υ嫫鞯膲毫υO定為1.5磅/平方英寸(1.03x105pa)，其低于混合壓力3磅/平方英寸(2.06x105pa)。儲存器壓力可用于確保向蠕動泵輸入看起來相同的壓力并且不受外部流體靜壓影響，從而確保一致的泵送體積。儲存器的輸出(即注入閥)可受單獨的氣體管路獨立控制，因為這些是決定哪個進料管路注入生長腔室中的閥門。接下來是控制蠕動泵的氣體管路。混合器可具有單獨的輸入管路和輸出管路，從而能夠沖掉混合器管路上的冷凝水，因此進入混合器中的空氣可以是濕潤的以減少生長培養(yǎng)基的蒸發(fā)。微型生物反應器腔室中的生長腔室具有大的表面/容積比，因此，蒸發(fā)速率一般要大于較大生物反應器的蒸發(fā)速率。此外，全部的三個混合器氣體管路可被設計成具有相同阻力，以確保3個生長腔室中均勻的混合速率?？蓪⒒旌掀鳉怏w管路制得比其余管路寬，因為空氣是濕潤的并且在阻力太大時任何冷凝都可能堵塞這些管路。最后的空氣管路控制朝向取樣口的閥門。取樣口由10微升樣品儲存器及控制取樣和取樣口自動化清洗的閥門組成。左上角的孔可用聚碳酸酯蓋密封并用雙面膠帶粘貼?？蓪⒖諝夤苈吠ㄟ^位于芯片左下角的20個羽支(barb)的組與氣體歧管連接。氣體歧管可用于將電磁閥與微型生物反應器的空氣管路連接。氣體歧管的設計示于圖6中。該實施例中的歧管具有3層。微型生物反應器的羽支連接器位于歧管頂層的中心。中間層將電磁閥的輸出通向連接歧管與微生物反應器的羽支連接器。底層將主空氣管路通向電磁閥的輸入。為了便于參考，表2a至2c列出了如圖6所示的具有其編號的所有閥門，以及氣體連接。表2a針對閥門1至8表2b針對閥門9至16閥門名稱nonc9氣體混合2氮氣(3磅/平方英寸)氧氣(3磅/平方英寸)10泵2閥門關(atm)閥門開(15磅/平方英寸)11泵3閥門開(15磅/平方英寸)閥門關(atm)12樣品儲存器閥門開(15磅/平方英寸)閥門關(atm)13進樣閥門開(15磅/平方英寸)閥門關(atm)14出樣閥門開(15磅/平方英寸)閥門關(atm)15樣品空氣進入閥門開(15磅/平方英寸)閥門關(atm)16氣體混合3氮氣(3磅/平方英寸)co2(3磅/平方英寸)圖2c針對閥門17至24閥門名稱nonc17混合器底部出去混合器關(atm)堵塞18混合器底部進入堵塞混合器開(3磅/平方英寸)19混合器左側出去混合器關(atm)堵塞20混合器左邊進入堵塞混合器開(3磅/平方英寸)21混合器頂部出去混合器關(atm)堵塞22混合器頂部進入堵塞混合器開(3磅/平方英寸)23儲存器壓力儲存器關(atm)儲存器開(1.5磅/平方英寸)24氣體混合4可用可用在表2a至2c中，no表示常開而nc表示常閉?？蛇x擇氣體管路常開或常閉的選擇作為閥門的最通常狀態(tài)，更通常的是通常使得該閥門是不活動的以節(jié)省能量消耗。特別地，可將閥門10(泵2)設置為?！伴]”，同時可將其余的所有閥門設置成常“開”。除在微型生物反應器上進行混合和閥門打開所需的電磁閥之外，還有4個氣體混合器電磁閥。二氧化碳(co2)氣體濃度相對于氮氣(n2)的控制可通過改變氣體混合(gasmix)3電磁閥的占空比來實現。氧氣(o2)濃度可經由氣體混合2通過相同的策略來控制。然后，可使用氣體混合1將兩種輸出以50-50的占空比混合在一起。如果需要任何額外的閥門的話，可使用氣體混合4。完整設置示于圖7中所示?？捎帽銛y式電腦控制現場可編程門陣列(field-programmablegatearray，fpga)板，該fpga板可控制電磁板、加熱板和光電探測器板。空氣管路在與氣體歧管連接之前可與壓力調節(jié)器連接。閥門管路可從氣體歧管出發(fā)，直接與微型生物反應器連接。這樣連接管路中的混合器，首先通過空氣阻力管路，然后通過45℃的局部加濕器，之后到達微型生物反應器。微型生物反應器發(fā)出的混合器出去管路與脫水器(watertrap)連接，之后與空氣阻力管路連接，然后僅與氣體歧管連接。將二氧化碳傳感器(配置用以檢測pco2)與reca反應器整合在一起。所述傳感器為來自presensgmbh的傳感器點。這些傳感器包括氣體可滲透膜，其中壽命短的ph敏感性發(fā)光染料(羥基芘三磺酸(hpts))與緩沖液和壽命長的惰性參照發(fā)光染料固定在一起。濕潤的co2氣體滲透到膜中改變了緩沖液的內部ph和hpts的發(fā)光。這兩種熒光體具有重疊的激發(fā)和發(fā)射光譜，使得其可用同一光源激發(fā)并用同一光電探檢測器檢測。將激發(fā)源調制為與長壽命熒光體相容的頻率fmod。具有不同壽命τ的熒光體以相位滯后φ滯后于經調制的源，如方程3所給出的tanφ＝2πfmodτ[3]參照熒光體具有恒定的相位滯后，其由φref給出。由于hpls具有非常短的壽命，因此相位滯后約是零，即φind～0。由參照和指示染料產生的發(fā)射熒光的實部和虛部列于以下方程中，其中振幅為am，并且相位為φm：amcosφm＝arefcosφref+aind[4]amsinφm＝arefsinφref+aind[5]這些方程簡化地給出了所產生熒光的相位滯后的余切cot(φm)之間的線性關系，以及指示熒光與參考熒光振幅之比aind/aref，因為cot(φref)和sin(φref)兩者都是常數。根據下面3個化學方程，co2增加將導致緩沖液區(qū)域中的質子成比例增加。給出了20℃下的平衡常數。指示染料發(fā)光是因為未質子化hpts的存在，因此pco2增加導致了指示染料的熒光強度降低。將振幅之比aind/aref與pco2聯系起來的方程示于方程10中，其中k由hpls的pka和緩沖液的ph推導出來。然后，可將得到的相位滯后φm與液體中的二氧化碳分壓pco2聯系起來，其中φ0為在零pco2下的相位滯后，而phimax為飽和時pco2的相位滯后。首先，應確定在430nm下的激發(fā)光的最佳調制頻率fmod。在517nm波長下檢測傳感器的發(fā)射。由于指示物具有納秒級的衰變時間，而參照具有微秒級的衰變時間，因此fmod在500hz與30mhz之間掃頻以找到最佳頻率。不含co2的氫氧化鈉(naoh)溶液通過將naoh顆粒溶于在沸騰后經兩次蒸餾的水中并用氮氣(n2)凈化來制備。對于高pco2濃度的溶液，使用1mnahco3溶液。在整個頻率范圍內，對1mnahco3溶液的相位滯后進行測量，然后與不含co2的溶液相減。將相位差δφ最大的頻率選定為最佳調制頻率fmod。如果假設參照染料的響應時間為50微秒并且指示物的響應時間為50納秒，然后假設在零點時aind～aref并且在飽和時aind＜＜aref，則可用方程12在理論上建立相位差δφ作為調至頻率fmod之函數的模型。結果繪制于圖8中。在獲得最佳調制頻率后，在此頻率下在37℃運行溫度下用具有不同pco2濃度的溶液校準傳感器。為了校準，使用前文所述的不含co2的溶液和1mnahco3溶液的稀釋液?？捎梅匠?4至16來計算每個標準溶液中的pco2。方程中列出的平衡常數對20℃的溫度有效?？筛鶕铝蟹匠虂碛嬎惴磻募妓棺杂赡?，以轉換成37℃的平衡常數。δg0＝-rtlnkeq[13]由方程13可知，t1lnkeq(t1)＝t2lnkeq(t2)。因此，可將這三個化學平衡方程式用37℃下的新平衡常數改寫。根據這些方程，可使用muller，等，“fluorescenceopticalsensorforlowconcentrationsofdissolvedcarbondioxide，”analyst，121(march)：339-343，1996中所概述的方法計算pco2。不同濃度的nahco3溶液的二氧化碳分壓pco2列于表3中。表3.由nahco3的所測量ph值和已知濃度計算的nahco3溶液在25℃溶解的二氧化碳濃度。在測量之前和在測量期間，將溶液新鮮混合并儲存于密封小瓶中，將該小瓶保持密封并攪拌以減小傳感器的響應時間。傳感器用可不含co2的naoh標準溶液和剩余的濃度遞增的nahco3溶液校準，同時在前面實驗中所測量的最佳頻率下對led進行調制。校準曲線可與方程11擬合。φ0值可通過不含co2的測量獲得。φmax和k可從最佳擬合參數獲得。co2傳感器可通過經在1khz至100khz頻率下調制的led(430nm)照射以獲得最佳調制頻率。由于電路中存在截止100khz頻率的電子低通濾波器，因此該系統(tǒng)可使用的最高調制頻率為93khz。然后，將從光電二極管獲得的信號與參照信號進行比較并得到兩個信號之間的相位滯后。該測量在1mmnahco3溶液上進行，然后用1mnahco3溶液進行重復。然后，將兩個測量之間的相位差作為頻率的函數作圖，并示于圖9中。可將得到的數據擬合成方程式6，以獲得參照染料和指示染料的壽命。根據擬合結果，參照染料的壽命測量為2.5微秒(與文獻值～5微秒接近)，指示染料的壽命測量為312納秒，與文獻值173-293納秒類似。根據測量結果，提供最高靈敏性的最佳調制頻率是電子系統(tǒng)的最高調制頻率，約93khz。將選擇用于該掃頻的調制頻率選定為素數，以避免測量中因背景中的電子噪聲源諧波而引起的噪聲。將co2傳感器用不同濃度的碳酸氫鈉(nahco3)溶液校準，不同濃度的碳酸氫鈉(nahco3)溶液表示具有不同溶解co2水平的溶液，如圖e8中所列出的。將溶液新鮮混合，然后密封。在即將測量之前，測量溶液的ph以確定溶解co2的濃度。一旦將溶液注入到具有co2傳感器的微型生物反應器中，就允許相位測量達到穩(wěn)定狀態(tài)。結果繪制于圖10中。將數據擬合成方程11，其中k值＝3.43×103。測量的最大相位滯后φmax為147°，零溶解co2濃度下的相位滯后φ0為149°。為了使微型生物反應器具有與大規(guī)模生物反應器相同的通氣速率，表征了新reca微型生物反應器對氧氣和二氧化碳兩者的氣體傳輸率(kla)。該表征在確定了每個阻力管路的最佳混合時間之后進行，因為氣體傳輸率kla是時間常數，其與通過pdms膜和液體的氣體種類的擴散性以及在液體中的混合速率均有關。擴散性和混合速率越高，氣體種類向傳感器所在室的底部傳輸得越快。足夠的氧氣氣體傳輸率對于確保細胞具有充足的氧并且不會進入缺氧狀態(tài)所必需的。使用提供二氧化碳適當的氣體傳輸率的參數，可確保將ph控制為與在大規(guī)模生物反應器中觀察到的類似。為了確定氧的kla，使用動態(tài)氣體方法進行實驗，因為對聚結液體(例如我們的系統(tǒng))而言，kla的穩(wěn)態(tài)和動態(tài)放氣值是相當的，如v.linek，p.benes，和v.vacek，“measurementofaerationcapacityoffermenters，”chem.eng.technol.，1989，第12卷，第1期，第213-217頁中所述。在該實施例中所描述的實驗中，將混合器頂部空間中的氣體從醫(yī)用氣體混合物(21％o2、5％co2，剩余部分為n2)轉換成純氮氣(100％n2)。描述氧氣的氣體傳輸關系的微分方程由方程17給出，其中c表示液體中的溶解氧濃度。c＊是液體中的氧飽和濃度，并且our指液體中的氧攝取速率(例如，液體中吸收氧的生物細胞或分子的氧攝取速率)。求解上述微分方程，得到了溶解氧濃度c作為時間函數的指數關系，其中our＝0。圖11中示出了對于最佳混合循環(huán)時間為12秒的阻力管路1，通過利用動態(tài)放氣方法之氧傳感器測量的結果。根據測量結果，在氧氣從頂部空間通過膜擴散到液體中時(即，在醫(yī)用氣體混合物在頂部空間中時)獲得的kla為6.9±0.1小時-1。當將氣體轉換成純氮氣時，用頂部空間中的低濃度氧氣將氧氣從系統(tǒng)清除(purging)，并測量凈化的氣體傳輸率為1.37±0.04小時-1。作為比較，對于15,000l生物反應器，氧氣的氣體傳輸率為2至3小時-1，而對于2l生物反應器為15小時-1。在相同試驗中，還測量了co2的氣體傳輸率，因為醫(yī)用氣體混合物還包含co2氣體。阻力管路1的結果示于圖12中。將兩個指數圖與數據擬合以獲得為kla倒數的時間常數。根據數據的指數擬合，來自醫(yī)用氣體混合物的co2的氣體傳輸率kla為2.14±0.07小時-1，并且從液體到純氮氣氣體頂部空間的氣體傳輸速率為4.93±0.04小時-1。作為比較，對于15,000l生物反應器，co2氣體傳輸率為0.2至0.4小時-1，而對于2l生物反應器為5至6小時-1。示出使用頂部空間中通過pdms膜的co2氣體變化來控制ph的實驗結果(三角形)示于圖12中。線表示出數據的最佳擬合。使用cdcho(invitrogen)作為液體培養(yǎng)基進行實驗。使用70μm厚的pdms膜作為氣體可滲透壁。通過調節(jié)電磁閥的占空比使氣體頂部空間中的co2與o2和he混合，從而使每種氣體在頂部空間中的比例不同。用位于液體室底部的光學ph傳感器(presens)測量ph。ph傳感器用ph緩沖液預先校準并將ph測量結果與標準ph探頭進行比較。液體培養(yǎng)基通過使膜彎曲進行攪動，以幫助氣體傳輸。作為比較，也在頂部空間中使用醫(yī)用氣體混合物(75％n2、20％o2和5％co2)。圖12中，醫(yī)用氣體混合物的數據點以圓圈示出。盡管本文中已對本發(fā)明的幾個實施方案進行了描述和說明，但是本領域中的普通技術人員將容易想到多種的其他方法和/或結構來實現本文所述功能和/或獲得本文所述結果和/或一個或更多個優(yōu)點，并且認為這些變化或改變中的每一個均在本發(fā)明的范圍內。更一般地，本領域技術人員將容易認識到，本文所述的所有參數、尺寸、材料和結構均僅是示例性的，并且實際的參數、尺寸、材料和/或結構將取決于采用本發(fā)明教導的一種或更多種特定應用。本領域技術人員僅使用常規(guī)實驗將認識到或者將能夠確定許多與本文所描述的本發(fā)明特定實施方案等同的方案。因此，應理解，前述實施方案僅作為示例示出，并且在所述權利要求及其等價方案的范圍內，本發(fā)明可以以不同于已具體描述并要求保護的方式的其他方式進行實踐。本發(fā)明涉及本文所述的每一個單獨的特征、系統(tǒng)、制品、材料和/或方法。此外，如果這些特征、系統(tǒng)、制品、材料和/或方法不相互矛盾，則兩個或更多個的這些特征、系統(tǒng)、制品、材料和/或方法的任意組合均包括在本發(fā)明的范圍內。除非明確地相反指示，否則本文說明書和權利要求書中使用的沒有數量詞修飾的名詞應理解為指“至少一個”。本文說明書和權利要求書中使用的短語“和/或”應理解為指以此要素中的“兩者之一或兩者”這樣結合，即要素在一些情況下共同存在而其他情況下分開存在。除非明確地相反指示，否則除“和/或”表述具體指示的要素之外，還可任選地存在另一些要素，無論與這些要素是否與具體指示的要素相關。因此，作為非限制性實例，提及“a和/或b”，當與開放式語言例如“包含/包括”結合使用時：在一個實施方案中，可指a而無b(任選地包括除b之外的要素)；在另一個實施方案中，可指b而無a(任選地包括除a之外的要素)；在又一個實施方案中，可指a和b兩者(任選地包括另一些要素)等。本文說明書和權利要求書中使用的“或”應理解為與以上定義的“和/或”相同的含義。例如，當在列表中分列項目時，“或”或“和/或”應解釋為包括在內，即包括大量要素或要素列表中的至少一個，但是也包括其中的多于一個，并任選地包括另外的未列出項目。只有明確指出相反的術語，如“僅之一”或“正好之一”或當在權利要求中使用的“由……組成”，將指包括大量要素或要素列表中的正好一個要素。一般而言，當前面有排他性術語，例如：“兩者之一”、“一個”、“僅其一”或“恰好其一”時，本文使用的術語“或”僅應解釋為指排他性替代(即“一個或另一個而非兩者”)。“基本由…組成”當在權利要求書使用中時應具有其在專利法領域中所使用的一般含義。在提及一個或更多個要素的列表時。本文說明書和權利要求書中使用的短語“至少一個”應理解為選自要素列表中的任何一個或更多個要素的至少一個要素，但并不一定包括元素列表中具體列出的每個和各個要素中的至少一個要素，并且不排除要素列表中要素的任意組合。該定義還允許除了在短語“至少一個”所指的要素列表內的具體表示的要素之外，可任選地存在另一些要素，無論與具體表示指定的那些要素是否相關。因此，作為非限制性實例，“a和b中的至少一個”(或者等價地，“a或b中的至少一個”，或者等價地，“a和/或b中的至少一個”)可以是這樣的：在一個實施方案中，指至少一個，任選地包括多于一個的a，但不存在b(并且任選地包括除b之外的要素)；在另一個實施方案中，指包括至少一個，任選地包括多于一個的b，但不存在a(并且任選地包括除a之外的要素)；在又一個實施方案中，指至少一個，任選地包括多于一個的a和至少一個(任選地包括多于一個的)b(并且任選包括其他要素)等。在權利要求書及以上的說明書中，所有過渡性短語例如“包含”、“包括”、“攜帶”、“具有”、“含有”、“涉及”、“持有”等應理解為開放式的，即指包括但不限于。僅過渡性短語“由…組成”和“基本由…組成”分別應是封閉式的或半封閉式的過渡性短語，如unitedstatespatentofficemanualofpatentexaminingprocedures，第2111.03章中所述。本發(fā)明還涉及以下實施方案：1.生物反應器系統(tǒng)，其包含：反應器腔室，其容積等于或小于約50毫升并且包含含有緩沖劑和至少一種生物細胞的液體生長培養(yǎng)基以及在所述液體生長培養(yǎng)基上方的含有二氧化碳的氣體頂部空間；第一入口，所述第一入口連接二氧化碳氣體源與所述氣體頂部空間；以及第二入口，所述第二入口連接堿性液體源與所述液體生長培養(yǎng)基。2.生物反應器系統(tǒng)，其包含：反應器腔室，其容積等于或小于約50毫升并且包含含有緩沖劑和至少一種生物細胞的液體生長培養(yǎng)基以及在所述液體生長培養(yǎng)基上方的含有二氧化碳的氣體頂部空間；第一入口，所述第一入口連接二氧化碳氣體源與所述氣體頂部空間；以及反應器腔室中的傳感器，其被配置成測定所述液體生長培養(yǎng)基中的二氧化碳濃度和/或ph。3.實施方案1所述的生物反應器系統(tǒng)，其包含所述反應器腔室中的傳感器，所述傳感器被配置成測定所述液體生長培養(yǎng)基中的二氧化碳濃度。4.實施方案1至3中任一項所述的生物反應器系統(tǒng)，其中所述反應器腔室的長寬比小于約10。5.實施方案2至4中任一項所述的生物反應器系統(tǒng)，其中所述傳感器與所述液體生長培養(yǎng)基直接接觸。6.實施方案1至5中任一項所述的生物反應器系統(tǒng)，其中所述反應器腔室包含可移動壁。7.實施方案6所述的生物反應器系統(tǒng)，其中所述可移動壁將所述氣體頂部空間與所述液體生長培養(yǎng)基隔開。8.實施方案6和7中任一項所述的生物反應器系統(tǒng)，其中所述可移動壁對至少一種氣體是可滲透的。9.實施方案8所述的生物反應器系統(tǒng)，其中所述氣體是氧氣和/或二氧化碳。10.實施方案1至9中任一項所述的生物反應器系統(tǒng)，其中所述生物細胞是真核細胞。11.實施方案1至9中任一項所述的生物反應器系統(tǒng)，其中所述生物細胞選自單細胞生物、植物細胞和動物細胞。12.實施方案11所述的生物反應器系統(tǒng)，其中所述單細胞生物是細菌、原生動物、錐蟲、變形蟲、酵母細胞或藻類。13.實施方案1至10中任一項所述的生物反應器系統(tǒng)，其中所述生物細胞來自多細胞生物。14.根據實施方案1至10和13中任一項所述的生物反應器系統(tǒng)，其中所述生物細胞是選自以下的哺乳動物細胞：靈長類細胞、牛細胞、馬細胞、豬細胞、山羊細胞、狗細胞、貓細胞、嚙齒動物細胞、人細胞和倉鼠細胞。15.實施方案1至10和13中任一項所述的生物反應器系統(tǒng)，其中所述生物細胞是心臟細胞、成纖維細胞、角質形成細胞、肝細胞、軟骨細胞、神經細胞、骨細胞、肌細胞、血細胞、內皮細胞、免疫細胞或干細胞。16.實施方案1至15中任一項所述的生物反應器系統(tǒng)，其中所述生物細胞是基因工程細胞。17.實施方案1至16中任一項所述的生物反應器系統(tǒng)，其中所述二氧化碳氣體源包含基本上純的二氧化碳。18.實施方案1和3至17中任一項所述的生物反應器系統(tǒng)，其中所述堿性液體包含碳酸氫根離子。19.實施方案1和3至18中任一項所述的生物反應器系統(tǒng)，其中所述堿性液體的ph大于或等于7.5。20.要求1和3至19中任一項所述的生物反應器系統(tǒng)，其包含連接酸性材料源與所述液體生長培養(yǎng)基的第三入口。21.實施方案20所述的生物反應器系統(tǒng)，其中所述酸性材料的ph小于或等于6.5。22.實施方案1至21中任一項所述的生物反應器系統(tǒng)，其中在所述液體培養(yǎng)基上方的二氧化碳的分壓為約0％至約20％。23.實施方案1至22中任一項所述的生物反應器系統(tǒng)，其中所述氣體頂部空間的總壓力為約0磅/平方英寸至約15磅/平方英寸。24.實施方案1至23中任一項所述的生物反應器系統(tǒng)，其中所述氣體頂部空間與所述液體生長培養(yǎng)基直接接觸。25.實施方案1至24中任一項所述的生物反應器系統(tǒng)，其中所述細胞包含中國倉鼠卵巢(cho)細胞。26.實施方案1至25中任一項所述的生物反應器系統(tǒng)，其中所述反應器腔室被配置成包含體積等于或大于10微升并且小于約50毫升的所述液體培養(yǎng)基。27.運行生物反應器的方法，其包括：提供反應器腔室，所述反應器腔室的容積等于或小于約50毫升并且包含含有至少一種生物細胞的液體培養(yǎng)基及在所述液體生長培養(yǎng)基上方的含有二氧化碳的氣體頂部空間；以及運行所述反應器，使得所述頂部空間與所述液體培養(yǎng)基的主體之間的二氧化碳的kla為至少約0.1小時-1并且小于約15小時-1。28.運行生物反應器的方法，其包括：提供容積等于或小于約50毫升的反應器腔室，所述反應器腔室包含：含有至少一種生物細胞的液體生長培養(yǎng)基，和在所述液體培養(yǎng)基上方的含有二氧化碳的氣體頂部空間；向所述氣體頂部空間輸送含有二氧化碳的氣體；以及向所述液體生長培養(yǎng)基輸送堿性液體。29.實施方案28所述的方法，其包括運行所述反應器使得所述頂部空間與所述液體培養(yǎng)基的主體之間的二氧化碳的kla為至少約0.1小時-1并且小于約15小時-1。30.實施方案27至29中任一項所述的方法，其包括向所述液體生長培養(yǎng)基輸送酸性材料。31.實施方案28至29中任一項所述的方法，其中所述液體生長培養(yǎng)基的摩爾滲透壓濃度在輸送所述氣體的步驟期間基本上是恒定的。32.實施方案28至31中任一項所述的方法，其中所述堿性液體包含碳酸氫根離子。33.根據實施方案27和29至32中任一項所述的方法，其中所述頂部空間與所述液體培養(yǎng)基的主體之間的二氧化碳kla小于或等于約15小時-1。34.根據實施方案27至33中任一項所述的方法，其中所述反應器腔室包含體積等于或大于10微升并且小于約50毫升的所述液體培養(yǎng)基。當前第1頁12