本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其是茶樹lob基因、用于克隆茶樹lob基因的引物及其克隆方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

高等植物的頂端生長(zhǎng)以及眾多側(cè)生器官的相繼分化和發(fā)育，是高等植物最基本的生長(zhǎng)發(fā)育問題，直接關(guān)系到植株各部分器官的組成、個(gè)體的大小和經(jīng)濟(jì)價(jià)值的高低，因而成為近年來(lái)植物功能基因組研究的一個(gè)重要熱點(diǎn)。

植物的莖尖分生組織(sam，shootapicalmeristem)是位于生長(zhǎng)點(diǎn)的一群細(xì)胞，它從胚胎的形態(tài)發(fā)生之初開始啟動(dòng)，一直維持分生狀態(tài)并貫穿植物生長(zhǎng)發(fā)育的始終。莖尖分生組織的維持需要在中央?yún)^(qū)莖細(xì)胞和周邊區(qū)生成細(xì)胞之間保持一種平衡，這種平衡的打破往往導(dǎo)致側(cè)生器官原基的啟動(dòng)和形成。

高等植物的側(cè)枝、葉片、花序、花器官等均為側(cè)生器官。植物的側(cè)生器官邊界區(qū)(lateralorganboundariesdomain，lbd)將葉片等側(cè)生器官(分化細(xì)胞)與頂端分生組織(干細(xì)胞)分隔開，確保器官的形成和干細(xì)胞的維持。此外，器官邊界區(qū)產(chǎn)成側(cè)生分生組織，進(jìn)而形成側(cè)芽，影響植物株型的建成。lbd基因是最近在高等植物中發(fā)現(xiàn)的為植物所特有的一類新的基因，含有保守的lob(lateralorganboundaries)結(jié)構(gòu)域，lob基因是植物所特有的一個(gè)基因。但由于邊界區(qū)細(xì)胞數(shù)量較少，表型不易觀察，因此對(duì)邊界區(qū)形成的正反向遺傳學(xué)研究都很困難，使得我們對(duì)邊界區(qū)形成的調(diào)控機(jī)理知之甚少。

茶葉對(duì)現(xiàn)代疾病如高血壓、糖尿病、輻射病、心臟病、心血管病、帕金森病、癌癥和肥胖癥等有一定的藥理功效。茶多酚是茶樹中主要的次生代謝產(chǎn)物，兒茶素約占茶多酚總量的70％。兒茶素生物合成主要涉及的酶類有pal、c4h、4cl、chs、chi、f3h、f3’h、f3’5’h、dfr、lar、ans和anr等，已有研究結(jié)果表明，pal、f3h、lar和dfr的表達(dá)量隨葉片成熟度增加而逐漸下降：在新芽表達(dá)量最高，新葉次之，老葉最少。

研究發(fā)現(xiàn)擬南芥、甜橙、亞麻薺等植物的lob基因均對(duì)植物地上部、地下部的特定器官的形成與發(fā)育具有重要影響，但對(duì)茶樹中相關(guān)lob基因的研究以及l(fā)ob基因與兒茶素合成的關(guān)系的研究還沒有報(bào)道，因此對(duì)茶樹lob基因的克隆及其他分子研究尤為重要。

主要的技術(shù)文獻(xiàn)有：bowmanj.l.,andeshedy.,2000,formationandmaintenanceoftheshootapicalmeristem,trendsplantsci.,5(3):110-115；aida,m.,ishida,t.,tasaka,m.,1999.shootapicalmeristemandcotyledonformationduringarabidopsisembryogenesis,interactionamongthecupshapedcotyledonandshootmeristemlessgenes.development126,1563–1570；clarks.e.,2001,meristems:startyoursignaling,curr.cpin.plantbiol.,4(1):28-32；iwakawah.,uenoy.,semiartie.,onouchih.,kojimas.,tsukayah.,hasebem.,somat.,ikezakim.,machidac.,andmachiday.,2002,theasymmetricleaves2geneofarabidopsisthaliana,requiredforformationofasymmet-ricflatleaflamina,encodesamemberofanovelfamilyofproteinscharacterizedbycysteinerepeatsandaleucinezipper,plantcellphysiol.,43(5):467-478；chalfun-juniora.,frankenj.,mesj.j.,marsch-martinezn.,pereiraa.,andangenentg.c.,2005,asymmetricleaves-like1gene,amemberoftheas2/lobfamily,controlsproximal-distalpatterninginarabidopsispetals,plantmol.biol.,57(4):559-575；liuh.j.,wangs.f.,yux.b.,yuj.,hex.w.,zhangs.l.,shouh.x.,andwup.,2005,arl1,alob-domainproteinrequiredforadventitiousrootformationinrice,plantj.,43(1):47-56；abe,m.,2003.regμulationofshootepidermalcelldifferentiationbyapairofhomeodomainproteinsinarabidopsis.development130,635-643.

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明要解決的第一個(gè)技術(shù)問題是提供一種用于克隆茶樹lob基因保守域的引物及其克隆方法，其核苷酸序列為seqidno.1，氨基酸序列為seqidno.2。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：

首先利用ncbi的entrez檢索系統(tǒng)，查找到一條擬南芥lob基因的氨基酸序列，具有seqidno.3所述的氨基酸序列。隨后利用這一序列使用blastp(通過(guò)蛋白查查找蛋白)，在整個(gè)nr數(shù)據(jù)庫(kù)中查找與之相似的其它物種的氨基酸序列。

將搜索到的同一基因的不同氨基酸序列進(jìn)行多序列比對(duì)，可選工具clustalw。通過(guò)序列比對(duì)，確定兩個(gè)相距47個(gè)氨基酸的保守區(qū)域，氨基酸序列分別為seqidno.4和seqidno.5所述的氨基酸序列。得到保守區(qū)域后，利用primer5.0進(jìn)行簡(jiǎn)并引物的設(shè)計(jì)。將參與多序列比對(duì)的序列中的任一條導(dǎo)入primer5.0中，再將其翻譯成核苷酸序列，有密碼子簡(jiǎn)并性，其結(jié)果是有n多條彼此只相差一個(gè)核苷酸的序列群，該群可用一條有簡(jiǎn)并性的核苷酸鏈來(lái)表示(其中r＝a/g，y＝c/t，m＝a/c，k＝g/t，s＝c/g，w＝a/t，h＝a/c/t，b＝c/g/t，v＝a/c/g，d＝a/g/t，n＝a/c/g/t)，在primer5.0中修改參數(shù)，令其在兩個(gè)距離合適的保守的nt區(qū)域內(nèi)尋找引物對(duì)，要保證上下游引物都落在該簡(jiǎn)并鏈的保守區(qū)域內(nèi)。

基于上述步驟，本發(fā)明提供的克隆茶樹lob基因保守域的引物組為：

lob-degenerate-f:5’-tgygcbgcstgcaartt-3’

lob-degenerate-r:5’-gakatdgcdccdacrcagcc-3’

克隆茶樹lob基因保守域的方法包括如下步驟：提取龍井長(zhǎng)葉rna，按照takaraprimescript^tmii1ststrandcdnasynthesiskit的方法將上述rna進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄得到cdna，以該cdna為模板，lob-degenerate-f為上游引物，lob-degenerate-r為下游引物進(jìn)行pcr。獲得茶樹lob基因保守域的核苷酸序列，即seqidno.1。

本發(fā)明要解決的第二個(gè)技術(shù)問題是提供擴(kuò)增茶樹lob基因5’末端、3’末端全長(zhǎng)的特異性引物組。根據(jù)已得到的茶樹lob基因保守序列核苷酸序列，設(shè)計(jì)得到5’和3’末端擴(kuò)增反應(yīng)所需的引物組，其特征如下：

5’raceouterprimer：5’-catggctacatgctgacagccta-3’

5’raceinnerprimer：5’-cgcggatccacagcctactgatgatcagtcgatg-3’

cslob-5’race-gsp1:5’-aggagttgactgcgtcttcacgttggtg-3’

cslob-5’race-gsp2:5’-gagcttcgtgacgttgcttgctccaaag-3’

3’raceouterprimer：5’-taccgtcgttccactagtgattt-3’

3’raceouterprimer：5’-cgcggatcctccactagtgatttcactatagg-3’

cslob-3’race-gsp1:5’-tgcaagtttcttcgccggaaatgcatgc-3’

cslob-3’race-gsp2:5’-gagccacacaaattcgccaacgtccac-3’

本發(fā)明要解決的第三個(gè)技術(shù)問題是提供一種用于克隆茶樹lob基因全長(zhǎng)序列的引物組及該基因的克隆方法，其特征在于用于該基因的引物分別為cslob-f(seqidno.6)和cslob-r(seqidno.7)，該基因的核苷酸序列為seqidno.8。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：

(1)茶樹lob基因5’末端擴(kuò)增反應(yīng)

首先以takara5’-fullracekit提供的5’raceouterprimer和基因特異引物cslob-5’race-gsp1為引物，龍井長(zhǎng)葉cdna為模板，進(jìn)行5’末端outerpcr反應(yīng)；然后再以5’raceinnerprime和基因特異引物cslob-5’race-gsp2為引物，以0.5μlouterpcr產(chǎn)物為模板，進(jìn)行茶樹lob基因5’末端innerpcr反應(yīng)。

(2)茶樹lob基因3’末端擴(kuò)增反應(yīng)

首先以takara3’-fullracekit提供的3’raceouterprimer和基因特異引物cslob-3’race-gsp1為引物，龍井長(zhǎng)葉cdna為模板，進(jìn)行3’末端outerpcr反應(yīng)；然后再以3’raceinnerprimer和基因特異引物cslob-3’race-gsp2為引物，以0.5μlouterpcr產(chǎn)物為模板，進(jìn)行茶樹lob基因3’末端innerpcr反應(yīng)。

(3)茶樹lob基因全長(zhǎng)cdna擴(kuò)增

根據(jù)茶樹lob基因5’和3’末端測(cè)序結(jié)果分別設(shè)計(jì)了正向引物cslob-f和反向引物cslob-r，以龍井長(zhǎng)葉cdna為模板，擴(kuò)增茶樹lob基因全長(zhǎng)序列。

本發(fā)明要解決的第四個(gè)技術(shù)問題是提供一種用于lob基因熒光定量rt-pcr的引物組，其特征在于用于定量pcr的引物分別為cslob-qrt-f(seqidno.9)和cslob-qrt-r(seqidno.10)，內(nèi)參基因引物分別為csgapdh-qrt-f(seqidno.11)和csgapdh-qrt-r(seqidno.12)。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：

提取龍井長(zhǎng)葉不同組織(芽，第一葉，第二葉，老葉)的rna，按照takaraprimescript^tmii1ststrandcdnasynthesiskit的方法將上述rna進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄(20μl逆轉(zhuǎn)錄體系加入1μg的totalrna)得到cdna，以該cdna為模板，分別以cslob-qrt-f/cslob-qrt-r和csgapdh-qrt-f/csgapdh-qrt-r引物組，按照sybrpremixextaqii染料法熒光定量試劑盒的方法配制pcr反應(yīng)液，分析不同組織中l(wèi)ob的表達(dá)量。

本發(fā)明的有益效果是：本發(fā)明根據(jù)已知其它物種lob基因的氨基酸及核苷酸序列設(shè)計(jì)得到擴(kuò)增茶樹lob基因保守序列的引物，再根據(jù)擴(kuò)增得到的茶樹lob基因保守序列，擴(kuò)增茶樹lob基因的5’和3’末端序列，最終首次獲得茶樹lob基因全長(zhǎng)序列。通過(guò)克隆茶樹lob基因的引物組和克隆方法，它能快速準(zhǔn)確地克隆茶樹lob基因的全序列。已有研究表明，不同發(fā)育階段茶鮮葉中，新芽的兒茶素合成相關(guān)基因表達(dá)量最高，第一葉次之，成熟葉片中明顯低于第一葉。熒光定量pcr檢測(cè)結(jié)果表明，茶樹芽中l(wèi)ob的表達(dá)量最少，老葉中表達(dá)量相對(duì)較高，這一結(jié)果與兒茶素積累量是相反的，可能是由于lob對(duì)兒茶素的合成起負(fù)調(diào)控作用。本發(fā)明為后續(xù)茶樹lob基因的確切功能和參與的兒茶素代謝調(diào)控途徑等知識(shí)的研究奠定基礎(chǔ)。

附圖說(shuō)明

圖1為不同植物(擬南芥、亞麻薺、蕪菁、甜橙、甘藍(lán)型油菜等)lob氨基酸序列比對(duì)圖。

圖2為cslob3’-race末端擴(kuò)增的瓊脂糖凝膠電泳圖。

圖3為cslob5’-race末端擴(kuò)增的瓊脂糖凝膠電泳圖。

圖4為擴(kuò)增茶樹lob基因全長(zhǎng)cdna的瓊脂糖凝膠電泳圖。

圖5為茶樹不同組織(芽、第一葉、第二葉、老葉)中l(wèi)ob定量pcr圖。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施方案對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的說(shuō)明，這些實(shí)施例應(yīng)被理解為僅為本發(fā)明的最佳實(shí)例，而非以任何方式限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明原則之內(nèi)所做的任何改進(jìn)、修飾和等同替換，均應(yīng)包含在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。

實(shí)施例1：龍井長(zhǎng)葉totalrna的提取

取龍井長(zhǎng)葉葉片組織2g于液氮中研磨，按照柱式小量植物組織抽提試劑盒說(shuō)明，提取totalrna，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)質(zhì)量符合要求后，凍存?zhèn)溆谩?/p>

實(shí)施例2：茶樹lob基因保守域擴(kuò)增反應(yīng)

根據(jù)已知其它物種lob基因的氨基酸及核苷酸序列設(shè)計(jì)得到擴(kuò)增茶樹lob基因保守序列的引物lob-degenerate-f和lob-degenerate-r，以龍井長(zhǎng)葉cdna為模板，擴(kuò)增茶樹lob基因保守域的序列。反應(yīng)程序?yàn)?4℃3min，94℃30s，58℃30s，72℃30s，35cycles，72℃10min。

根據(jù)已知其它物種lob基因的氨基酸及核苷酸序列設(shè)計(jì)得到擴(kuò)增茶樹lob基因保守序列的引物lob-degenerate-f和lob-degenerate-r具體是：首先利用ncbi的entrez檢索系統(tǒng)，查找到一條擬南芥lob基因的氨基酸序列，具有seqidno.3所述的氨基酸序列。隨后利用這一序列使用blastp(通過(guò)蛋白查查找蛋白)，在整個(gè)nr數(shù)據(jù)庫(kù)中查找與之相似的其它物種的氨基酸序列。

將搜索到的同一基因的不同氨基酸序列進(jìn)行多序列比對(duì)，可選工具clustalw，其結(jié)果圖如圖1所示。通過(guò)序列比對(duì)，確定兩個(gè)相距47個(gè)氨基酸的保守區(qū)域，氨基酸序列分別為seqidno.4和seqidno.5所述的氨基酸序列。得到保守區(qū)域后，利用primer5.0進(jìn)行簡(jiǎn)并引物的設(shè)計(jì)。將參與多序列比對(duì)的序列中的任一條導(dǎo)入primer5.0中，再將其翻譯成核苷酸序列，有密碼子簡(jiǎn)并性，其結(jié)果是有n多條彼此只相差一個(gè)核苷酸的序列群，該群可用一條有簡(jiǎn)并性的核苷酸鏈來(lái)表示(其中r＝a/g，y＝c/t，m＝a/c，k＝g/t，s＝c/g，w＝a/t，h＝a/c/t，b＝c/g/t，v＝a/c/g，d＝a/g/t，n＝a/c/g/t)，在primer5.0中修改參數(shù)，令其在兩個(gè)距離合適的保守的nt區(qū)域內(nèi)尋找引物對(duì)，要保證上下游引物都落在該簡(jiǎn)并鏈的保守區(qū)域內(nèi)。

實(shí)施例3：茶樹lob基因5’末端擴(kuò)增反應(yīng)

a、totalrna去磷酸化處理

按照takara5’-fullracekit說(shuō)明，使用alkalinephosphatase(ciap)對(duì)totalrna中裸露的5’磷酸基團(tuán)進(jìn)行去磷酸反應(yīng)。去磷酸反應(yīng)液體系為茶樹totalrna(1μg/μl)1μl，rnaseinhibitor(40u/μl)1μl，10×alkalinephosphatasebuffer(mgcl2free)5μl，alkalinephosphatase(calfintestine)(16u/μl)0.6μl，rnasefreedh2o46.9μl。50℃反應(yīng)1小時(shí)后。向上述反應(yīng)液中加入20μl的3mch3coona(ph5.2)，130μl的rnasefreedh2o，充分混勻。再加入200μl的苯酚/氯仿/異戊醇(25：24：1)，充分混勻后13,000×g室溫離心5min，將上層水相轉(zhuǎn)移至新的microtube中。再加入200μl的氯仿，充分混勻后13,000×g室溫離心5min，將上層水相轉(zhuǎn)移至新的microtube中。加入2μl的nacarrier均勻混合后，加入200μl的異丙醇，冰上冷卻10min，13,000×g4℃離心20min，棄上清，加入500μl70％的乙醇漂洗，13,000×g4℃離心5min，棄上清后干燥，最后加入7μl的rnasefreedh2o溶解沉淀，得到ciap-treatedrna。

b、mrna“去帽子”反應(yīng)。

使用tobaccoacidpyrophosphatase(tap)去掉mrna的5’帽子結(jié)構(gòu)，保留一個(gè)磷酸基團(tuán)。反應(yīng)體系為ciap-treatedrna7μl，rnaseinhibitor(40u/μl)1μl，10×tapreactionbuffer1μl，tobaccoacidpyrophosphatase(0.5u/μl)1μl，37℃反應(yīng)1小時(shí)，得到ciap/tap-treatedrna。

c、5’raceadaptor的連接

首先配置下列溶液：ciap/tap-treatedrna5μl，5’raceadaptor(15μm)1μl，rnasefreedh2o4μl。上述溶液65℃反應(yīng)1小時(shí)后，加入20μl的3mch3coona(ph5.2),140μl的rnasefreedh2o，充分混勻。再加入200μl的苯酚/氯仿/異戊醇(25：24：1)，充分混勻后13,000×g室溫離心5min，將上層水相轉(zhuǎn)移至新的microtube中。再加入200μl的氯仿，充分混勻后13,000×g室溫離心5min，將上層水相轉(zhuǎn)移至新的microtube中。加入2μl的nacarrier均勻混合后，加入200μl的異丙醇，冰上冷卻10min，13,000×g4℃離心20min，棄上清，加入500μl70％的乙醇漂洗，13,000×g4℃離心5min，棄上清后干燥，最后加入6μl的rnasefreedh2o溶解沉淀，得到ligatedrna。

d、反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。

反應(yīng)體系為ligatedrna6μl，random9mers(50μm)0.5μl，dntp(10mmeach)1μl，rnaseinhibitor(40u/μl)0.25μl，reversetranscriptasem-mlv(rnaseh^-)(200u/μl)0.25μl。反應(yīng)條件為30℃10min，42℃1hr，72℃15min，即可得到用于擴(kuò)增5’末端的龍井長(zhǎng)葉cdna。

e、outerpcr反應(yīng)。

以takara5’-fullracekit提供的5’raceouterprimer和基因特異引物cslob-5’race-gsp1為引物，龍井長(zhǎng)葉cdna為模板，進(jìn)行5’末端outerpcr反應(yīng)；擴(kuò)增體系為龍井長(zhǎng)葉cdna2μl，1×cdnadilutionbufferii8μl，10×lapcrbuffer(mg²⁺free)4μl，mgcl2(25mm)3μl，takaralataq(5u/μl)0.25μl，cslob-5’race-gsp1(10μm)2μl，5’raceouterprimer(10μm)2μl，dh2o28.75μl。pcr反應(yīng)條件為94℃3min，94℃30s，55℃30s，72℃1min，20cycles，72℃10min。

f、innerpcr反應(yīng)。

以5’raceinnerprimer和基因特異引物cslob-5’race-gsp2為引物，以1μlouterpcr產(chǎn)物為模板，進(jìn)行茶樹lob基因5’末端innerpcr反應(yīng)。反應(yīng)體系和擴(kuò)增程序同outerpcr反應(yīng)。pcr產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測(cè)，結(jié)果如圖2所示。

實(shí)施例4：茶樹lob基因3’末端擴(kuò)增反應(yīng)

a、反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。

反應(yīng)體系為totalrna(500ng/μl)1μl，3’raceadaptor(5μm)1μl，5×primescriptbuffer2μl，dntpmixture(10mmeach)1μl，rnaseinhibitor(40u/μl)0.25μl，primescriptrtase(200u/μl0.25μl)0.25μl，rnasefreedh2o4.5μl。反應(yīng)條件42℃60min，70℃15min，反應(yīng)結(jié)束即得到用于擴(kuò)增3’末端的龍井長(zhǎng)葉cdna。

b、outerpcr反應(yīng)。

以takara3’-fullracekit提供的3’raceouterprimer和基因特異引物cslob-3’race-gsp1為引物，龍井長(zhǎng)葉cdna為模板，進(jìn)行3’末端outerpcr反應(yīng)；擴(kuò)增體系為龍井長(zhǎng)葉cdna2μl，1×cdnadilutionbufferii8μl，10×lapcrbuffer(mg²⁺free)4μl，mgcl2(25mm)3μl，takaralataq(5u/μl)0.25μl，cslob-3’race-gsp1(10μm)2μl，3’raceouterprimer(10μm)2μl，dh2o28.75μl。pcr反應(yīng)條件為94℃3min，94℃30s，55℃30s，72℃1min，20cycles，72℃10min。

c、innerpcr反應(yīng)。

以3’raceinnerprimer和基因特異引物cslob-3’race-gsp2為引物，以1μlouterpcr產(chǎn)物為模板，進(jìn)行茶樹lob基因3’末端innerpcr反應(yīng)。反應(yīng)體系和擴(kuò)增程序同outerpcr反應(yīng)。pcr產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測(cè)，結(jié)果如圖3所示。

實(shí)施例5：茶樹lob基因全長(zhǎng)cdna序列擴(kuò)增。

根據(jù)茶樹lob基因5’和3’末端測(cè)序結(jié)果分別設(shè)計(jì)了正向引物cslob-f和反向引物cslob-r，以龍井長(zhǎng)葉cdna為模板，擴(kuò)增茶樹lob基因全長(zhǎng)序列。反應(yīng)程序?yàn)?4℃3min，94℃30s，58℃30s，72℃30s，35cycles，72℃10min。pcr產(chǎn)物電泳結(jié)果如圖4所示。

實(shí)施例6：pcr產(chǎn)物的克隆純化與篩選。

pcr產(chǎn)物經(jīng)1.5％瓊脂糖凝膠電泳后，用膠回收試劑盒對(duì)pcr產(chǎn)物進(jìn)行回收，經(jīng)純化后與takara公司t載體pmd18-tvector進(jìn)行連接，用熱激法導(dǎo)入大腸桿菌dh5α感受態(tài)中并在氨芐青霉素平板上篩選陽(yáng)性克隆。分子檢測(cè)確定后的陽(yáng)性克隆子送杭州擎科生物公司完成測(cè)序。

實(shí)施例7：熒光定量pcr檢測(cè)茶樹不同組織中l(wèi)ob的表達(dá)量

提取龍井長(zhǎng)葉不同組織(芽，第一葉，第二葉，老葉)的rna，按照takaraprimescript^tmii1ststrandcdnasynthesiskit的方法將上述rna進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄(20μl逆轉(zhuǎn)錄體系加入1μg的totalrna)得到cdna，以該cdna為模板，利用本發(fā)明所述的引物cslob-qrt-f、cslob-qrt-r、csgapdh-qrt-f和csgapdh-qrt-r為引物，按照下列組分配制pcr反應(yīng)液：premixextaq^tmii10μl，pcrforwardprimer(10μm)0.8μl，reverseprimer(10μm)0.8μl，cdna1μl，dh2o7.4μl。

pcr擴(kuò)增程序如下：94℃3min，94℃20s，58℃20s，72℃20s，40cycles，72℃收集熒光，結(jié)果如圖5所示。

seqidno.1：

tgcgcggcgtgcaagtttcttcgccggaaatgcatgccgggatgcatattcgcgccatattttccaccggaggagccacacaaattcgccaacgtccacaaaatctttggagcaagcaacgtcacgaagctcctcaacgagctcctccctcaccaacgtgaagacgcagtcaactccttagcctatgaggccgaggcacgtgtccgtgaccccgtctatggctgcgtaggcgccatctc

seqidno.2：

caackflrrkcmpgcifapyfppeephkfanvhkifgasnvtkllnellphqredavnslayeaearvrdpvygcvgai

seqidno.3：

masssnsynspcaackflrrkcmpgcifapyfppeephkfanvhkifgasnvtkllnellphqredavnslayeaearvrdpvygcvgaisylqrqvhrlqkeldaanadlahyglstsaagapgnvvdlvfqpqplpsqqlpplnpvyrlsgaspvmnqmprgtggsygtflpwnnghdqqggnm

seqidno.4：spcaackflrrkc

seqidno.5：slayeaearv

seqidno.6：atggcgtcgtcatcaaactcatacaac

seqidno.7：tcaaatatttcctccagaagggctattg

seqidno.8：

atggcgtcgtcatcaaactcatacaactcaacatgcgcggcgtgcaagtttcttcgccggaaatgcatgccgggatgcatattcgcgccatattttccaccggaggagccacacaaattcgccaacgtccacaaaatcttcggcgcaagcaacataagtaagctcctcaatgaaatcctccctcaccaaagagatgatgcagtgagttccctcgcctacgaagccgaagcacgagtgcgagatccagtgtacggttgtgttggtgctatctccttcctccaaagacaggttgagaagctccagaaagatctagaagtcgccaatgccaatttgattcactga

seqidno.9：5’-gaaatcctccctcaccaaagag-3’

seqidno.10：5’-aggagatagcaccaacacaac-3’

seqidno.11：5’-ttggcatcgttgagggtct-3’

seqidno.12：5’-cagtgggaacacggaaagc-3’

sequencelisting

<110>浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院

<120>用于克隆茶樹lob基因的引物及其克隆方法

<130>1

<160>12

<170>patentinversion3.3

<210>1

<211>239

<212>dna

<213>人工合成

<400>1

tgcgcggcgtgcaagtttcttcgccggaaatgcatgccgggatgcatattcgcgccatat60

tttccaccggaggagccacacaaattcgccaacgtccacaaaatctttggagcaagcaac120

gtcacgaagctcctcaacgagctcctccctcaccaacgtgaagacgcagtcaactcctta180

gcctatgaggccgaggcacgtgtccgtgaccccgtctatggctgcgtaggcgccatctc239

<210>2

<211>79

<212>prt

<213>人工合成

<400>2

cysalaalacyslyspheleuargarglyscysmetproglycysile

151015

phealaprotyrpheproproglugluprohislysphealaasnval

202530

hislysilepheglyalaserasnvalthrlysleuleuasngluleu

354045

leuprohisglnarggluaspalavalasnserleualatyrgluala

505560

glualaargvalargaspprovaltyrglycysvalglyalaile

657075

<210>3

<211>186

<212>prt

<213>人工合成

<400>3

metalaserserserasnsertyrasnserprocysalaalacyslys

151015

pheleuargarglyscysmetproglycysilephealaprotyrphe

202530

proproglugluprohislysphealaasnvalhislysilephegly

354045

alaserasnvalthrlysleuleuasngluleuleuprohisglnarg

505560

gluaspalavalasnserleualatyrglualaglualaargvalarg

65707580

aspprovaltyrglycysvalglyalailesertyrleuglnarggln

859095

valhisargleuglnlysgluleuaspalaalaasnalaaspleuala

100105110

histyrglyleuserthrseralaalaglyalaproglyasnvalval

115120125

aspleuvalpheglnproglnproleuproserglnglnleupropro

130135140

leuasnprovaltyrargleuserglyalaserprovalmetasngln

145150155160

metproargglythrglyglysertyrglythrpheleuprotrpasn

165170175

asnglyhisaspglnglnglyglyasnmet

180185

<210>4

<211>13

<212>prt

<213>人工合成

<400>4

serprocysalaalacyslyspheleuargarglyscys

1510

<210>5

<211>10

<212>prt

<213>人工合成

<400>5

serleualatyrglualaglualaargval

1510

<210>6

<211>27

<212>dna

<213>人工合成

<400>6

atggcgtcgtcatcaaactcatacaac27

<210>7

<211>28

<212>dna

<213>人工合成

<400>7

tcaaatatttcctccagaagggctattg28

<210>8

<211>342

<212>dna

<213>人工合成

<400>8

atggcgtcgtcatcaaactcatacaactcaacatgcgcggcgtgcaagtttcttcgccgg60

aaatgcatgccgggatgcatattcgcgccatattttccaccggaggagccacacaaattc120

gccaacgtccacaaaatcttcggcgcaagcaacataagtaagctcctcaatgaaatcctc180

cctcaccaaagagatgatgcagtgagttccctcgcctacgaagccgaagcacgagtgcga240

gatccagtgtacggttgtgttggtgctatctccttcctccaaagacaggttgagaagctc300

cagaaagatctagaagtcgccaatgccaatttgattcactga342

<210>9

<211>22

<212>dna

<213>人工合成

<400>9

gaaatcctccctcaccaaagag22

<210>10

<211>21

<212>dna

<213>人工合成

<400>10

aggagatagcaccaacacaac21

<210>11

<211>19

<212>dna

<213>人工合成

<400>11

ttggcatcgttgagggtct19

<210>12

<211>19

<212>dna

<213>人工合成

<400>12

cagtgggaacacggaaagc19