本發(fā)明涉及一種強化表達streptomycessp.fa1來源木聚糖酶的畢氏酵母重組菌，屬于基因工程領域。

背景技術：

木聚糖酶屬于糖苷水解酶[ec3.2.1.x]，根據(jù)作用位點的不同，這類酶可分為兩種：一類是作用于木聚糖的主鏈骨架，主要有內(nèi)切β-1,4-d-木聚糖酶和β-木糖苷酶，前者作用于木聚糖中間β-1,4-d-糖苷鍵，后者則是作用于低聚木糖的末端分解成木糖單糖，在這兩種酶的共同參與下，實現(xiàn)木聚糖的降解。第二類是作用于作用于支鏈取代基的酶，包括α-l-呋喃阿拉伯糖苷酶[ec3.2.1.55]、α-d-葡萄糖醛酸酶[ec3.2.1.139]、乙酰木聚糖酯酶[ec3.2.1.72]、p-香豆酸酯酶[ec3.1.1]等。

木聚糖酶分布廣泛，主要來自自然界中一些真菌、細菌、一些無脊椎的動物體內(nèi)以及植物組織等，既可以通過動植物體內(nèi)提取，也可以通過微生物發(fā)酵獲木聚糖酶。人們研究比較多的是微生物產(chǎn)木聚糖酶，已經(jīng)報道的產(chǎn)木聚糖酶菌株有各種霉菌和鏈霉菌以及芽孢桿菌等。木聚糖酶種類繁多組成各異，性質(zhì)上也有所不同。

木聚糖酶能應用在多個領域中。在食品領域可以用于面制品烘焙，能夠改善面制品的品質(zhì)；另外木聚糖可用于制備低聚木糖。在飼料工業(yè)木聚糖酶和其他半纖維素酶一起添加在飼料中利于增加飼料營養(yǎng)分解。在制漿和造紙工業(yè)領域，木聚糖酶可作為預漂白劑處理紙漿，從而降低紙漿漂白過程中化學試劑使用量，減少對環(huán)境的污染。在紡織工業(yè)麻類植物的纖維素含量豐富，是紡織行業(yè)中纖維原材料，但是麻類植物中含有半纖維素、木質(zhì)素、果膠等雜質(zhì)不利于紡織，木聚糖酶可以進行脫膠以去除這些膠質(zhì)，減少化學品對環(huán)境的污染。迄今為止，國內(nèi)外已報道了400多種木聚糖酶基因，大多數(shù)木聚糖酶在野生菌中表達量僅在10-20iu·ml-1。為了進一步推動木聚糖酶在工業(yè)生產(chǎn)中的應用，利用分子生物學方法將木聚糖酶基因進行異源表達以提高木聚糖酶的表達水平，是目前普遍采用的木聚糖酶制備方式。

畢氏酵母表達系統(tǒng)是近年發(fā)展起來的應用廣泛的真核表達系統(tǒng)。畢氏酵母菌屬于單細胞微生物，具有生長力旺盛、營養(yǎng)條件簡單、發(fā)酵技術成熟、ph適應范圍較寬、不產(chǎn)有毒物質(zhì)等優(yōu)點，至今已有數(shù)百種的外源蛋白利用該表達系統(tǒng)表達成功。用于外源基因表達的啟動子主要有乙醇氧化酶(aox)啟動子和3-磷酸甘油醛脫氫酶啟動子(gap)。aox是一種強啟動子，以甲醇為誘導劑能嚴格控制外源蛋白的誘導表達。gap啟動子則屬于組成型啟動子，在菌體生長過程中都能啟動表達。外源基因的表達方式有兩種，分別是整合到基因組中表達和構(gòu)建游離的重組質(zhì)粒進行表達。整合型表達中通過將外源基因整合到微生物基因組中從而使菌株具有遺傳穩(wěn)定的特點?；谫|(zhì)粒高拷貝數(shù)通過構(gòu)建游離表達質(zhì)粒進行表達可獲得多拷貝外源基因表達菌株，從而顯著提高表達量。目前在畢氏酵母表達系統(tǒng)中均是構(gòu)建整合型重組菌株進行外源基因重組表達，尚未見到采用游離型表達質(zhì)粒來進行表達。

技術實現(xiàn)要素：

為解決上述技術問題，本發(fā)明提供了一種穩(wěn)定的、可以大量分泌木聚糖酶的游離表達型畢氏酵母重組菌及其構(gòu)建方法，工業(yè)應用前景廣闊。

本發(fā)明的第一個目的是提供一種表達木聚糖酶的畢氏酵母重組菌，所述畢氏酵母重組菌是將木聚糖酶基因連接到含有自主復制序列的游離表達載體上，然后轉(zhuǎn)化至已整合表達木聚糖酶基因的畢氏酵母中，得到畢氏酵母重組菌。

在本發(fā)明的一種實施方式中，所述木聚糖酶基因氨基酸序列如seqidno:1所示。

在本發(fā)明的一種實施方式中，所述自主復制序列的核苷酸序列如seqidno:2所示。

在本發(fā)明的一種實施方式中，所述游離表達載體為通過將核苷酸序列如seqidno:2的pars復制子連接到pgapzαa質(zhì)粒上得到pgapzαa-pars游離表達載體。

在本發(fā)明的一種實施方式中，所述已整合表達木聚糖酶基因的畢氏酵母為畢氏酵母km71/ppic9k-xyna(axylanasefromstreptomycessp.fa1:heterologousexpression,characterization,anditsapplicationinchinesesteamedbread，yangxu，journalofindustrialmicrobiology&biotechnology，may2016，volume43，issue5，pp663–670)

本發(fā)明第二個目的是提供一種所述畢氏酵母重組菌的構(gòu)建方法，所述方法包括如下步驟：

(1)獲得氨基酸序列如seqidno:1所示的木聚糖酶基因；

(2)獲得序列如seqidno:2所示的自主復制序列pars基因；

(3)將步驟(2)所得pars基因與質(zhì)粒pgapzαa相連，得到表達載體pgapzαa-pars；

(4)將步驟(1)中的木聚糖酶基因與步驟(3)中的表達載體pgapzαa-pars相連，得到重組載體pgapzαa-pars-xyna；

(5)將重組載體pgapzαa-pars-xyna轉(zhuǎn)化到已整合表達木聚糖酶基因的畢氏酵母中，得到所述畢氏酵母重組菌。

本發(fā)明的第三個目的是提供所述的畢氏酵母重組菌生產(chǎn)木聚糖酶的方法，所述方法包括以下步驟：

(1)以權(quán)利要求1所述畢氏酵母重組菌為生產(chǎn)菌株，活化后，30℃、200rpm條件下培養(yǎng)24h，得一級種子發(fā)酵液；

(2)以2.5％接種量接種一級種子發(fā)酵液至種子培養(yǎng)基中，30℃、200rpm條件下培養(yǎng)24h，得二級種子發(fā)酵液；

(3)以10％的接種量將二級種子發(fā)酵液接種至發(fā)酵培養(yǎng)基中30℃、200rpm進行發(fā)酵；

(4)待do值迅速上升時，進行補料，od600＝100時停止補料，饑餓至第二次出現(xiàn)do值迅速上升時繼續(xù)補料。

在本發(fā)明的一種實施方式中，所述種子培養(yǎng)基為ypd培養(yǎng)基；所述發(fā)酵培養(yǎng)基為bsm培養(yǎng)基；其中bsm培養(yǎng)基包括如下成分：85％磷酸26.7ml/l，caso40.93g/l，k2so418.2g/l，mgso4·7h2o14.9g/l，koh4.13g/l，甘油40.0g/l，ptm14.35ml/l，上述成分均溶于水中形成所述bsm培養(yǎng)基。

在本發(fā)明的一種實施方式中，所述方法中補料配方為100％甲醇、1.25％ptm1；甲醇和ptm1溶于水中形成所述補料。

本發(fā)明的第四個目的是提供所述畢氏酵母重組菌在飼料、食品、紡織或化工領域的應用。

本發(fā)明的有益效果

本發(fā)明在原有基因組已整合aox啟動子啟動表達xyna基因的菌株中進一步導入含有gap啟動子啟動表達xyna基因的游離表達質(zhì)粒，從而強化xyna在畢氏酵母中的分泌表達。和單一整合性表達菌株相比，進一步導入游離型重組表達質(zhì)粒后木聚糖酶產(chǎn)量顯著提高了53％，重組酶的比活力提高了90％。本發(fā)明為利用畢氏酵母高效分泌表達外源蛋白提供了一種新方法。

附圖說明

圖1重組質(zhì)粒pgapzαa-pars-xyna的構(gòu)建過程圖；

圖2pgapzαa-pars-xyna重組質(zhì)粒的雙酶切驗證圖；

圖3km71/ppic9k-xyna/pgapzαa-pars-xyna重組菌3.6l發(fā)酵sds-page電泳圖；

圖4km71/ppic9k-xyna/pgapzαa-pars-xyna重組菌3.6l發(fā)酵酶活對比圖。

具體實施方式

將0.5g的木聚糖溶于100ml，50mmol/l，ph5.5的磷酸緩沖液充分混勻，取1ml底物，在55℃預熱10min，加入1ml的酶液，反應10min后加入3mldns，煮沸10min迅速冷卻，加蒸餾水定容至20ml，540nm下測吸光度(以滅活的酶液為催化劑同樣操作作為空白對照)。

在上述條件下，將每分鐘水解木聚糖糖生成1μmol的木糖所需酶量定義為木聚糖酶的一個單位的酶活力(u)。

實施例1：表達載體pgapzαa-pars的構(gòu)建

利用全基因合成技術合成核苷酸序列如seqidno.2所示的自主復制序列pars；將回收得到的pars基因片段，用infusion酶與質(zhì)粒pgapzαa相連，構(gòu)建得到表達載體pgapzαa-pars。

實施例2：畢氏酵母km71/ppic9k-xyna感受態(tài)細胞制作：

1)挑取酵母km71/ppic9k-xyna單菌落，接種至含有10mlypd培養(yǎng)基的50ml三角瓶中，30℃，250rpm培養(yǎng)過夜；

2)接種培養(yǎng)細胞100μl于含有100mlypd培養(yǎng)基的500ml三角瓶中，30℃，250rpm培養(yǎng)過夜，至od600達到1.3～1.5；

3)3個50ml無菌離心管于4℃，5000rpm離心5min棄上清，每管加入4ml無菌水充分懸浮細胞，收集合并成一管；加入2ml10*te緩沖液(ph＝7.5)2ml10*liac和0.5ml1mdtt旋轉(zhuǎn)混勻，在30℃50rpm水浴搖床45min。

4)將3)中菌懸液加無菌水稀釋至30ml，于4℃，5000rpm離心5min棄上清收集菌體，并加入預冷的無菌水25ml，充分懸浮細胞；

5)于4℃，5000rpm離心5min收集菌體，加入20ml預冷的1mol/l山梨醇重懸菌體；

6)重復步驟5)

7)于4℃，5000rpm離心5min收集菌體，加入1ml預冷的1mol/l山梨醇輕輕吹打，充分懸浮細胞，分裝，當天使用。

實施例3：強化表達重組菌km71/ppic9k-xyna/pgapzαa-pars-xyna的構(gòu)建

重組質(zhì)粒pgapzαa-pars-xyna的構(gòu)建：

以質(zhì)粒pmd18-t-xyna(axylanasefromstreptomycessp.fa1:heterologousexpression,characterization,anditsapplicationinchinesesteamedbread，yangxu，journalofindustrialmicrobiology&biotechnology，may2016，volume43，issue5，pp663–670)為模板，設計序列如seqidno.3所示的正向引物：ccggaattcatggccgagaacaccctt，序列如seqidno.4所示的反向引物：atttgcggccgctcaggtgcgggtccagcgtt。通過聚合酶鏈式反應獲得具有noti和ecori酶切位點的xyna片段。

pcr反應體系(50μl)：

pcr程序：94℃，4min(預變性)；98℃，10s(變性)；60℃，5s(退火)；72℃，90s(延伸)；設置30個循環(huán)；72℃，10min(保溫)后設置保藏溫度為4℃。將pcr產(chǎn)物進行膠回收、酶切回收目的基因?qū)⑵渑c表達載體pgapzαa-pars進行雙酶切，并于16℃連接過夜，轉(zhuǎn)化e.colijm109，涂布含zecoin抗性的lb平板，37℃培養(yǎng)8-10h，挑取轉(zhuǎn)化子，提取重組質(zhì)粒并雙酶切驗證，然后對驗證正確的重組質(zhì)粒測定dna序列，陽性克隆子即pgapzαa-pars-xyna。見圖1和圖2。

重組質(zhì)粒pgapzαa-pars-xyna的轉(zhuǎn)化：

(1)從乙醇中取出電轉(zhuǎn)杯，置于超凈臺中吹干，并置于冰中預冷備用；

(2)在冰上進行以下操作：將重組游離質(zhì)粒pgapzαa-pars-xyna預冷，吸取5μl快速與80μlkm71/ppic9k-xyna酵母感受態(tài)中混勻，轉(zhuǎn)移到0.2cm經(jīng)過紫外照射的的電轉(zhuǎn)杯，冰浴5min，電擊條件為：電壓1500v，時間控制4-10ms；

(3)迅速向電擊杯中加入1ml1mol·l^-1預冷的山梨醇，輕輕吹打均勻，然后將其轉(zhuǎn)移至冰冷的1.5ml無菌ep管中，30℃、50r·min^-1培養(yǎng)1-2h；

(4)離心菌體，重新懸浮均勻后吸取200μl-300μl涂布上還有zecoin抗性的ypd平板上，于30℃恒溫條件下培養(yǎng)，至長出單菌落，即為含有游離質(zhì)粒的重組單菌落。

(5)使用無菌牙簽挑取ypd平板上的菌落，接種于含有10ml液體ypd培養(yǎng)基的50ml三角瓶中，30℃，200r/min，培養(yǎng)24h；

(6)將2.5ml(5)中菌液轉(zhuǎn)入裝有50mlbmgy培養(yǎng)基的500ml三角瓶培養(yǎng)表達24h，培養(yǎng)物經(jīng)離心后,將菌體重懸轉(zhuǎn)入25mlbmmy培養(yǎng)基的250ml三角瓶培養(yǎng)并每天加入375μl甲醇，誘導表達4～5天；培養(yǎng)物經(jīng)離心后得到含重木聚糖酶的上清，利用dns法對其進行酶活檢測。

實施例4：km71/ppic9k-xyna/pgapzαa-pars-xyna重組菌3.6l發(fā)酵罐發(fā)酵

重組畢氏酵母工程菌發(fā)酵罐發(fā)酵生產(chǎn)木聚糖酶的方法在3.6linfors罐進行，過程分為三階段進行：

第一階段：接種實施例3中的陽性轉(zhuǎn)化子單菌落至裝有10mlypd培養(yǎng)基的50ml三角瓶中，200rpm，30℃振蕩培養(yǎng)24h，作為一級種子發(fā)酵液；

第二階段：取所述一級種子發(fā)酵液2.5ml接種于裝有100ml發(fā)酵培養(yǎng)基的500ml三角瓶中，200rpm，30℃振蕩培養(yǎng)24h，作為二級種子發(fā)酵液；

第三階段：將100ml的種子發(fā)酵液接種到裝有900mlbsm培養(yǎng)基中的3.6l發(fā)酵罐中，200rpm，30℃的條件下培養(yǎng)，全程用25％氨水進行ph值的調(diào)節(jié)，保持在5.0；所述bsm培養(yǎng)基包括如下成分：85％磷酸26.7ml/l，caso40.93g/l，k2so418.2g/l，mgso4·7h2o14.9g/l，koh4.13g/l，甘油40.0g/l，ptm14.35ml/l上述成分均溶于水中形成所述bsm培養(yǎng)基；

待碳源耗盡，即do值迅速上升時，進行補料，待od600＝100時，停止補料，饑餓至第二次出現(xiàn)do值迅速上升時，繼續(xù)補料，補料配方為100％甲醇；1.25％ptm1；甲醇和ptm1互溶形成所述補料。

實施例5：木聚糖酶酶活測定

取實施例3中km71/ppic9k-xyna/pgapzαa-pars-xyna重組菌產(chǎn)的酶進行酶活測定，實驗結(jié)果見圖4。結(jié)果表明，強化表達重組菌km71/ppic9k-xyna/pgapzαa-pars-xyna獲得的木聚糖酶的最大酶活力2100u/ml，蛋白含量4.8mg/ml。整合型km71/ppic9k-xyna重組菌獲得的木聚糖酶的最大酶活力為1370u/ml，蛋白含量6.3mg/ml(axylanasefromstreptomycessp.fa1:heterologousexpression,characterization,anditsapplicationinchinesesteamedbread，yangxu，journalofindustrialmicrobiology&biotechnology，may2016，volume43，issue5，pp663–670)，同整合型km71/ppic9k-xyna重組菌相比，強化表達重組菌表達木聚糖酶酶活提高了53％，同時表達的酶的比活力提高了90％，從而顯著降低了工業(yè)化生產(chǎn)木聚糖酶的生產(chǎn)成本。此外，km71/ppic9k-xyna/pgapzαa-pars-xyna重組菌所產(chǎn)酶的蛋白電泳結(jié)果顯示在43kda處有一條與理論分子量一致的條帶(結(jié)果如圖3所示)。

雖然本發(fā)明已以較佳實施例公開如上，但其并非用以限定本發(fā)明，任何熟悉此技術的人，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)，都可做各種的改動和修飾，因此本發(fā)明的保護范圍應該以權(quán)利要求書所界定的為準。

序列表

<110>江南大學

<120>一種強化表達streptomycessp.fa1來源木聚糖酶的畢氏酵母重組菌

<160>4

<170>patentinversion3.3

<210>1

<211>436

<212>prt

<213>streptomycessp.fa1

<400>1

metalagluasnthrleuglyalaalaalaalaglnserglyargtyr

151015

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202530

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<210>2

<211>164

<212>dna

<213>人工合成

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<213>人工合成

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<210>4

<211>32

<212>dna

<213>人工合成

<400>4

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