本發(fā)明屬于天然產(chǎn)物蛋白提取技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及一種藻藍(lán)蛋白降血糖多肽。

背景技術(shù)：

根據(jù)國際糖尿病聯(lián)(ide)2006年的《diabetesatlas》中報(bào)告，糖尿病已經(jīng)在全球蔓延。目前糖尿病侵襲全球2.46億人，占全球人口的5.9%，而患者總?cè)藬?shù)中接近80%是在發(fā)展中國家，其中印度4090萬，中國3980萬。報(bào)告中預(yù)測(cè)，未來二十年內(nèi)如不采取任何措施，患糖尿病的患者將增加到3.8億人口。全世界糖尿病的流行及治療糖尿病新藥的飛速發(fā)展，將使糖尿病藥物的市場(chǎng)每年增長(zhǎng)16%，達(dá)到2006年的200億美元。糖尿病患者主要分為胰島素依賴型糖尿病(i型糖尿病)和非胰島素依賴型糖尿病(ii型糖尿病)兩種，其中ii型糖尿病占糖尿病總數(shù)的90%以上。ii型糖尿病的防治是糖尿病研究的一個(gè)重點(diǎn)。由于糖尿病的發(fā)病機(jī)制仍不十分明確，目前主要通過長(zhǎng)期用藥以降低血糖，控制并發(fā)癥。世界上治療ii型糖尿病以磺酞脈類藥物為主，輔以雙肌類、。一糖普酶抑制劑等藥物。但是，由于磺酞脈類藥物的副作用大，長(zhǎng)期使用會(huì)因?yàn)橐葝u素過度分泌而導(dǎo)致胰島日細(xì)胞衰竭，服用此類藥物的糖尿病人中，每年有10%的病人會(huì)因治療失效而改用胰島素等其他類藥物。自1984年美國波士頓總醫(yī)院發(fā)現(xiàn)人的腸道內(nèi)存在一類促進(jìn)胰島素分泌的多膚(統(tǒng)稱glp-1)以來，多膚就成了新一代治療ii型糖尿病藥物的開發(fā)熱點(diǎn)。

螺旋藻是至今為止發(fā)現(xiàn)的營養(yǎng)最豐富、最全面的綠色食品，尤其蛋白質(zhì)含量較高，氨基酸平衡，還含有豐富的必需脂肪酸(如r一亞麻酸等)，螺旋藻本身也具有一定的降血糖的功效，但效果并不理想。

現(xiàn)有技術(shù)如，中國發(fā)明授權(quán)專利文獻(xiàn)，授權(quán)公告號(hào)cn102613384b，一種用活體螺旋藻制備螺旋藻多肽粉的方法?，F(xiàn)有制備螺旋藻多肽通常是使用螺旋藻干粉加水配制成懸濁液，再用生物酶工程技術(shù)水解螺旋藻蛋白制備螺旋藻多肽，但螺旋藻干粉活性成份已大量損失，使最終產(chǎn)品活性不足，提取率低，不能消除螺旋藻的腥味。該發(fā)明采用活體螺旋藻為原料，通過堿性蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶、紅曲霉三步酶解法制備螺旋藻多肽粉，該發(fā)明具有提取率高，能有效的保持螺旋藻多肽產(chǎn)品的活性成分，制備的螺旋藻多肽無腥味，口味較好的優(yōu)點(diǎn)，但是上述的活性多肽得率不高，在如何提高多肽得率方面還具有提升空間。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種藻藍(lán)蛋白降血糖多肽，具有降低血壓、降低血脂、活化血管功能，在制備過程中通過細(xì)胞破壁顯著提高多肽得率，多肽的制備步驟簡(jiǎn)單，得率高，可應(yīng)用于具有降血糖的食品或飲料。

本發(fā)明為實(shí)現(xiàn)上述目的所采取的技術(shù)方案為：一種藻藍(lán)蛋白降血糖多肽，降血糖多肽制備步驟為：

1）細(xì)胞破碎：配置藻液，螺旋藻干粉與水的固液比為1:50，在藻液中加入螺旋藻干粉重量的0.05%-0.15%的功能蛋白肽，選用磷酸鈉鹽緩沖液作為提取溶劑，磷酸鈉鹽緩沖液的ph值為7.0，在-20℃和37℃，反復(fù)凍融4-5次，每次4h，于5000rpm下離心30min，收集上清液得到藻藍(lán)蛋白的粗提液，置于4℃冰箱中儲(chǔ)藏備用；功能蛋白肽的氨基酸序列為mkglsfvllvlllmmpdgegdpemqywtgrglcrrfcyeyfvghhcprryrccaira。該活性肽具有親水性和親脂性，親水性使其溶于蒸餾水中，親脂性使其與螺旋藻細(xì)胞膜結(jié)合，使細(xì)胞膜下形成小孔，致使細(xì)胞內(nèi)的物質(zhì)泄漏，提高粗蛋白提取的工作效率，也提高活性蛋白的得率，利用活性肽結(jié)合凍融法進(jìn)行細(xì)胞破碎，大大縮短了提取時(shí)間，提取效果好，粗蛋白液中蛋白含量高，避免了破碎處理過程中需因升溫及機(jī)械力引起的蛋白質(zhì)變性，進(jìn)而提高了最后的多肽得率和多肽的活性；

2）鹽析：向蛋白粗提液中加入(nh4)2so4溶液至75-84%飽和度，3-5℃下靜置11-13h，離心，即得鹽析沉淀物；該步驟中加入大量的硫酸銨，使蛋白質(zhì)得溶解度降低而沉淀析出，該方法優(yōu)點(diǎn)在于硫酸銨濃度變化具有連續(xù)性，鹽析效果好，節(jié)約能耗；

3）雙水相萃?。簩⒁叶己蜔o機(jī)鹽配成ph為5.8-6.5，聚乙二醇濃度為15%-17%，無機(jī)鹽濃度為11%-13%，加入鹽析沉淀物，磁力攪拌，然后轉(zhuǎn)移至分液漏斗中分層，上相即為蛋白溶液；雙水相萃取技術(shù)是一種新型的萃取分配技術(shù)，其反應(yīng)條件溫和，容易工藝放大，分相時(shí)間短，效果好，其中聚乙二醇相為上相，無機(jī)鹽相為下相，藻藍(lán)蛋白主要分布在聚乙二醇相中；無機(jī)鹽為磷酸鉀鹽、磷酸鈉鹽、硫酸鈉、硫酸鉀、酒石酸鉀鈉中的一種或幾種混合；

4）超濾：將蛋白溶液置于截留分子量為6000-10000da超濾離心管中，離心，冷凍干燥，即為藻藍(lán)蛋白降血糖多肽。該步驟可以在不破壞活性多肽的前提下，能有效去除多肽溶液中的聚乙二醇，提高了多肽的濃度并且保證多肽的純度不會(huì)減小甚至有所增加，該多肽具有降低血壓、降低血脂、活化血管功能，其提取成本低，功能明確，分子量小，易吸收，特異性強(qiáng)，副作用小。

作為優(yōu)選，降血糖多肽可應(yīng)用于具有降血糖的食品或飲料，降血糖多肽的分子量小，易吸收，通過添加在食品中或飲料中便于人體吸收，起到降血糖、降血脂和活化血管的作用，還提高了添加的食品或飲料的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果為：1）本發(fā)明提取的藻藍(lán)蛋白降血糖多肽具有降低血壓、降低血脂、活化血管功能，其提取成本低，功能明確，分子量小，易吸收，特異性強(qiáng)，副作用小；2）利用活性肽結(jié)合凍融法進(jìn)行細(xì)胞破碎，大大縮短了提取時(shí)間，提取效果好，粗蛋白液中蛋白含量高，避免了破碎處理過程中需因升溫及機(jī)械力引起的蛋白質(zhì)變性，提高了最后的多肽得率和多肽的活性；3）本發(fā)明藻藍(lán)蛋白降血糖多肽的制備步驟簡(jiǎn)單，多肽得率高，可應(yīng)用于具有降血糖的食品或飲料。

具體實(shí)施方式

以下結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案作進(jìn)一步詳細(xì)描述：

實(shí)施例1：

一種藻藍(lán)蛋白降血糖多肽，降血糖多肽制備步驟為：

1）細(xì)胞破碎：配置藻液，螺旋藻干粉與水的固液比為1:50，在藻液中加入螺旋藻干粉重量的0.07%的功能蛋白肽，選用磷酸鈉鹽緩沖液作為提取溶劑，磷酸鈉鹽緩沖液的ph值為7.0，在-20℃和37℃，反復(fù)凍融5次，每次4h，于5000rpm下離心30min，收集上清液得到藻藍(lán)蛋白的粗提液，置于4℃冰箱中儲(chǔ)藏備用；功能蛋白肽的氨基酸序列為mkglsfvllvlllmmpdgegdpemqywtgrglcrrfcyeyfvghhcprryrccaira；

2）鹽析：向蛋白粗提液中加入(nh4)2so4溶液至80%飽和度，4℃下靜置12h，6000rpm下離心15min，即得鹽析沉淀物；

3）雙水相萃取：將乙二醇和無機(jī)鹽配成ph為6.2，聚乙二醇濃度為16%，無機(jī)鹽濃度為11%，無機(jī)鹽為磷酸鉀鹽、磷酸鈉鹽的混合物，加入鹽析沉淀物，磁力攪拌，然后轉(zhuǎn)移至分液漏斗中分層，上相即為蛋白溶液；

4）超濾：將蛋白溶液置于截留分子量為8000da超濾離心管中，離心，冷凍干燥，即為藻藍(lán)蛋白降血糖多肽。

降血糖多肽可應(yīng)用于具有降血糖的食品或飲料，降血糖多肽的分子量小，易吸收，通過添加在食品中或飲料中便于人體吸收，起到降血糖、降血脂和活化血管的作用，還提高了添加的食品或飲料的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。

本實(shí)施例中的常規(guī)技術(shù)為本領(lǐng)域技術(shù)人員所知曉的現(xiàn)有技術(shù)，例如離心、雙水相萃取操作步驟、超濾操作步驟、冷凍干燥等現(xiàn)有技術(shù)，故在此不再詳細(xì)贅述。

實(shí)施例2：

一種藻藍(lán)蛋白降血糖多肽，降血糖多肽制備步驟為：

1）細(xì)胞破碎：配置藻液，螺旋藻干粉與水的固液比為1:50，在藻液中加入螺旋藻干粉重量的0.08%的功能蛋白肽，選用磷酸鈉鹽緩沖液作為提取溶劑，磷酸鈉鹽緩沖液的ph值為7.0，在-20℃和37℃，反復(fù)凍融5次，每次4h，于5000rpm下離心30min，收集上清液得到藻藍(lán)蛋白的粗提液，置于4℃冰箱中儲(chǔ)藏備用；功能蛋白肽的氨基酸序列為mkglsfvllvlllmmpdgegdpemqywtgrglcrrfcyeyfvghhcprryrccaira。該活性肽具有親水性和親脂性，親水性使其溶于蒸餾水中，親脂性使其與螺旋藻細(xì)胞膜結(jié)合，使細(xì)胞膜下形成小孔，致使細(xì)胞內(nèi)的物質(zhì)泄漏，提高粗蛋白提取的工作效率，也提高活性蛋白的得率，利用活性肽結(jié)合凍融法進(jìn)行細(xì)胞破碎，大大縮短了提取時(shí)間，提取效果好，粗蛋白液中蛋白含量高，避免了破碎處理過程中需因升溫及機(jī)械力引起的蛋白質(zhì)變性，進(jìn)而提高了最后的多肽得率和多肽的活性；

2）鹽析：向蛋白粗提液中加入(nh4)2so4溶液至82%飽和度，3℃下靜置12h，6500rmp下離心10min，即得鹽析沉淀物；該步驟中加入大量的硫酸銨，使蛋白質(zhì)得溶解度降低而沉淀析出，該方法優(yōu)點(diǎn)在于硫酸銨濃度變化具有連續(xù)性，鹽析效果好，節(jié)約能耗；

3）雙水相萃?。簩⒁叶己蜔o機(jī)鹽配成ph為5.9，聚乙二醇濃度為16%，無機(jī)鹽濃度為11%，機(jī)鹽為磷酸鈉鹽、酒石酸鉀鈉混合物，加入鹽析沉淀物，磁力攪拌，然后轉(zhuǎn)移至分液漏斗中分層，上相即為蛋白溶液；雙水相萃取技術(shù)是一種新型的萃取分配技術(shù)，其反應(yīng)條件溫和，容易工藝放大，分相時(shí)間短，效果好，其中聚乙二醇相為上相，無機(jī)鹽相為下相，藻藍(lán)蛋白主要分布在聚乙二醇相中；無機(jī)鹽為磷酸鉀鹽、磷酸鈉鹽、硫酸鈉、硫酸鉀、酒石酸鉀鈉中的一種或幾種混合；

4）超濾：將蛋白溶液置于截留分子量為7500da超濾離心管中，離心，冷凍干燥，即為藻藍(lán)蛋白降血糖多肽。該步驟可以在不破壞活性多肽的前提下，能有效去除多肽溶液中的聚乙二醇，提高了多肽的濃度并且保證多肽的純度不會(huì)減小甚至有所增加，該多肽具有降低血壓、降低血脂、活化血管功能，其提取成本低，功能明確，分子量小，易吸收，特異性強(qiáng)，副作用小。

降血糖多肽可應(yīng)用于具有降血糖的食品或飲料，降血糖多肽的分子量小，易吸收，通過添加在食品中或飲料中便于人體吸收，起到降血糖、降血脂和活化血管的作用，還提高了添加的食品或飲料的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。

本實(shí)施例中的常規(guī)技術(shù)為本領(lǐng)域技術(shù)人員所知曉的現(xiàn)有技術(shù)，例如離心、雙水相萃取操作步驟、超濾操作步驟、冷凍干燥等現(xiàn)有技術(shù)，故在此不再詳細(xì)贅述。

以上所述的實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行了詳細(xì)說明，應(yīng)理解的是以上所述僅為本發(fā)明的具體實(shí)施例，并不用于限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的原則范圍內(nèi)所做的任何修改、補(bǔ)充或類似方式替代等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。

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<110>浦江縣歐立生物技術(shù)有限公司

<120>一種藻藍(lán)蛋白降血糖多肽

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