本發(fā)明屬于天然產(chǎn)物蛋白提取技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及一種螺旋藻藻藍(lán)蛋白的提取方法。

背景技術(shù)：

螺旋藻(spirulina)是一類分布于熱帶、亞熱帶地區(qū)淡水或鹽堿湖泊中的多細(xì)胞、無異型胞、絲狀呈螺旋狀的原核生物，又稱藍(lán)細(xì)菌，螺旋藻中的藻膽蛋白是一種重要的捕光色素蛋白，由藻藍(lán)蛋白和別藻藍(lán)蛋白組成，吸收的光能量由藻藍(lán)蛋白傳遞給別藻藍(lán)蛋白，再由別藻藍(lán)蛋白傳遞給光合作用反應(yīng)中心，有研究表明，藻藍(lán)蛋白能提高淋巴細(xì)胞活性，通過淋巴系統(tǒng)提高機(jī)體免疫功能，全面增強(qiáng)機(jī)體的防病、抗病能力。

目前螺旋藻藻藍(lán)蛋白和別藻藍(lán)蛋白的分離純化通常采用羥基磷灰石介質(zhì)進(jìn)行層析分離，但存在吸附性弱、洗脫時(shí)間長、上樣量少等問題，并且還需結(jié)合其它多步層析操作如體積排阻層析和離子交換層析等進(jìn)一步提高藻藍(lán)蛋白純度。也有報(bào)道可通過反復(fù)鹽析操作或雙水相萃取技術(shù)，提高藻膽蛋白的純度，無需多步層析操作，但多步提取操作同樣存在產(chǎn)品收率低，操作周期長等問題，尤其對(duì)具有熒光特性的藻藍(lán)蛋白，其熒光特性易在長時(shí)間的提取操作過程中損失。

現(xiàn)有技術(shù)，例如中國發(fā)明授權(quán)專利文獻(xiàn)，授權(quán)專利號(hào)cn102993297b，該發(fā)明涉及螺旋藻藻藍(lán)蛋白的提取方法，將螺旋藻粉懸濁液采用反復(fù)凍融法結(jié)合機(jī)械破碎法處理得到螺旋藻細(xì)胞破碎液；采用30%和50%硫酸銨溶液分級(jí)鹽析沉淀螺旋藻細(xì)胞破碎液得到藻藍(lán)蛋白粗提液1；加入peg20000和nacl進(jìn)一步沉淀出較高純度的藻藍(lán)蛋白粗提物；用磷酸鹽緩沖液溶解藻藍(lán)蛋白粗提物，制得藻藍(lán)蛋白粗提液2；藻藍(lán)蛋白粗提液2進(jìn)而用peg20000/na2so4雙水相體系萃取，萃取后的下相經(jīng)過透析除鹽可得藻藍(lán)蛋白精提液，冷凍干燥制備藻藍(lán)蛋白成品。該發(fā)明提取工藝簡單、成本低，適于間歇性和規(guī)?；a(chǎn)加工高純度、高收率的螺旋藻藻藍(lán)蛋白成品。該發(fā)明制得的藻藍(lán)蛋白粗提物可長時(shí)間貯存，進(jìn)一步純化制備的藻藍(lán)蛋白成品具有良好的抗氧化自由基清除效果和熒光強(qiáng)度，但是該藻藍(lán)蛋白提取過程中的破壁效果不太理想，不利于提高蛋白的得率，該提取方法對(duì)具有熒光特性的藻藍(lán)蛋白，其熒光特性易在長時(shí)間的提取操作過程中損失。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種通過細(xì)胞破壁提高藻藍(lán)蛋白純度和得率，可保護(hù)熒光性藻藍(lán)蛋白的熒光特性，工藝簡單，生產(chǎn)成本低，可批量生產(chǎn)的一種螺旋藻藻藍(lán)蛋白的提取方法。

本發(fā)明為實(shí)現(xiàn)上述目的，所采取的方案為：一種螺旋藻藻藍(lán)蛋白的提取方法，包括：粗細(xì)胞破碎、鹽析、雙水相萃取、超濾，具體操作步驟如下：

（1）粗細(xì)胞破碎：配置螺旋藻提取液，固液比(m(g):v(ml))=1:150，加入螺旋藻干粉重量的0.06%-0.12%功能蛋白肽，加入25mm磷酸鈉鹽緩沖液(ph7.0)，在-20℃和37℃反復(fù)凍融4-5次，每次凍融時(shí)間為4h，將凍融4-5次后的破壁液于5000rpm下離心30min,收集上清液得到藻藍(lán)蛋白的粗提液，置于4℃冰箱中儲(chǔ)藏備用，功能蛋白肽的氨基酸序列為mkglsfvllvlllmmpdgegtdpemqywtcgrglcrrfcyaeyfvghhcprryrccaira。該活性肽具有親水性和親脂性，親水性使其溶于蒸餾水中，親脂性使其與螺旋藻細(xì)胞膜結(jié)合，使細(xì)胞膜下形成小孔，致使細(xì)胞內(nèi)的物質(zhì)泄漏，提高粗蛋白提取的工作效率，也提高活性蛋白的得率，利用活性肽結(jié)合凍融法進(jìn)行細(xì)胞破碎，大大縮短了提取時(shí)間，提取效果好，粗蛋白液中蛋白含量高，避免了破碎處理過程中需因升溫及機(jī)械力引起的蛋白質(zhì)變性，可保護(hù)熒光性藻藍(lán)蛋白的熒光特性；

（2）鹽析步驟為：向蛋白粗提液中加入(nh4)2so4溶液至75-84%飽和度，3-5℃下靜置11-13h，離心，即得鹽析沉淀物；該步驟中加入大量的硫酸銨，使蛋白質(zhì)得溶解度降低而沉淀析出，該方法優(yōu)點(diǎn)在于硫酸銨濃度變化具有連續(xù)性，鹽析效果好，節(jié)約能耗；

（3）雙水相萃取步驟：將乙二醇和無機(jī)鹽配成ph為5.8-6.5，聚乙二醇濃度為15-17%，無機(jī)鹽濃度為11-13%，加入鹽析沉淀物，磁力攪拌，然后轉(zhuǎn)移至分液漏斗中分層，上相即為蛋白溶液，雙水相萃取技術(shù)是一種新型的萃取分配技術(shù)，其反應(yīng)條件溫和，容易工藝放大，分相時(shí)間短，效果好，其中聚乙二醇相為上相，無機(jī)鹽相為下相，藻藍(lán)蛋白主要分布在聚乙二醇相中；無機(jī)鹽為磷酸鉀鹽、磷酸鈉鹽、硫酸鈉、硫酸鉀、酒石酸鉀鈉中的一種或幾種混合；

（4）超濾：將蛋白溶液置于截留分子量為20-40kda超濾離心管中，離心，冷凍干燥，即為螺旋藻藻藍(lán)蛋白，該步驟可以在不破壞活性蛋白的前提下，能有效去除蛋白溶液中的聚乙二醇，提高了蛋白的濃度并且保證蛋白的純度不會(huì)減小甚至有所增加，該蛋白能提高淋巴細(xì)胞活性，通過淋巴系統(tǒng)提高機(jī)體免疫功能，全面增強(qiáng)機(jī)體的防病、抗病能力還具有優(yōu)異的抗氧化與輻射、抗炎、抑菌的功能，提取的藻藍(lán)蛋白可用于飼料或飲料領(lǐng)域。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果為：1）本發(fā)明提取的藻藍(lán)蛋白能提高淋巴細(xì)胞活性，通過淋巴系統(tǒng)提高機(jī)體免疫功能，全面增強(qiáng)機(jī)體的防病、抗病能力還具有優(yōu)異的抗氧化與輻射、抗炎、抑菌的功能，可用于飼料或飲料領(lǐng)域；2）利用活性肽結(jié)合凍融法進(jìn)行細(xì)胞破碎，大大縮短了提取時(shí)間，提取效果好，粗蛋白液中蛋白含量高，避免了破碎處理過程中需因升溫及機(jī)械力引起的蛋白質(zhì)變性，可保護(hù)熒光性藻藍(lán)蛋白的熒光特性；3）本發(fā)明螺旋藻藻藍(lán)蛋白的提取工藝簡單，可操作性強(qiáng)，生產(chǎn)成本低，可批量生產(chǎn)螺旋藻藻藍(lán)蛋白。

具體實(shí)施方式

以下結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案作進(jìn)一步詳細(xì)描述：

實(shí)施例1：

一種螺旋藻藻藍(lán)蛋白的提取方法，包括：粗細(xì)胞破碎、鹽析、雙水相萃取、超濾，具體操作步驟如下：

（1）粗細(xì)胞破碎：配置螺旋藻提取液，固液比(m(g):v(ml))=1:150，加入螺旋藻干粉重量的0.08%功能蛋白肽，加入25mm磷酸鈉鹽緩沖液(ph7.0)，在-20℃和37℃反復(fù)凍融5次，每次凍融時(shí)間為4h，將凍融5次后的破壁液于5000rpm下離心30min,收集上清液得到藻藍(lán)蛋白的粗提液，置于4℃冰箱中儲(chǔ)藏備用，功能蛋白肽的氨基酸序列為mkglsfvllvlllmmpdgegtdpemqywtcgrglcrrfcyaeyfvghhcprryrccaira；

（2）鹽析步驟為：向蛋白粗提液中加入(nh4)2so4溶液至80%飽和度，3℃下靜置12h，離心，即得鹽析沉淀物；

（3）雙水相萃取步驟：將乙二醇和無機(jī)鹽配成ph為6.0，聚乙二醇濃度為15%，無機(jī)鹽濃度為11%，無機(jī)鹽為磷酸鉀鹽和磷酸鈉鹽的混合物，加入鹽析沉淀物，磁力攪拌，然后轉(zhuǎn)移至分液漏斗中分層，上相即為蛋白溶液；

（4）超濾：將蛋白溶液置于截留分子量為20kda超濾離心管中，離心，冷凍干燥，即為螺旋藻藻藍(lán)蛋白。

實(shí)施例2：

一種螺旋藻藻藍(lán)蛋白的提取方法，包括：粗細(xì)胞破碎、鹽析、雙水相萃取、超濾，具體操作步驟如下：

（1）粗細(xì)胞破碎：配置螺旋藻提取液，固液比(m(g):v(ml))=1:150，加入螺旋藻干粉重量的0.10%功能蛋白肽，加入25mm磷酸鈉鹽緩沖液(ph7.0)，在-20℃和37℃反復(fù)凍融4次，每次凍融時(shí)間為4h，將凍融4次后的破壁液于5000rpm下離心30min,收集上清液得到藻藍(lán)蛋白的粗提液，置于4℃冰箱中儲(chǔ)藏備用，功能蛋白肽的氨基酸序列為mkglsfvllvlllmmpdgegtdpemqywtcgrglcrrfcyaeyfvghhcprryrccaira。該活性肽具有親水性和親脂性，親水性使其溶于蒸餾水中，親脂性使其與螺旋藻細(xì)胞膜結(jié)合，使細(xì)胞膜下形成小孔，致使細(xì)胞內(nèi)的物質(zhì)泄漏，提高粗蛋白提取的工作效率，也提高活性蛋白的得率，利用活性肽結(jié)合凍融法進(jìn)行細(xì)胞破碎，大大縮短了提取時(shí)間，提取效果好，粗蛋白液中蛋白含量高，避免了破碎處理過程中需因升溫及機(jī)械力引起的蛋白質(zhì)變性，可保護(hù)熒光性藻藍(lán)蛋白的熒光特性；

（2）鹽析步驟為：向蛋白粗提液中加入(nh4)2so4溶液至75%飽和度，5℃下靜置11h，離心，即得鹽析沉淀物；，該步驟中加入大量的硫酸銨，使蛋白質(zhì)得溶解度降低而沉淀析出，該方法優(yōu)點(diǎn)在于硫酸銨濃度變化具有連續(xù)性，鹽析效果好，節(jié)約能耗；

（3）雙水相萃取步驟：將乙二醇和無機(jī)鹽配成ph為6.0，聚乙二醇濃度為15%，無機(jī)鹽濃度為11%，無機(jī)鹽為磷酸鈉鹽、硫酸鈉、酒石酸鉀鈉中的混合物；加入鹽析沉淀物，磁力攪拌，然后轉(zhuǎn)移至分液漏斗中分層，上相即為蛋白溶液，雙水相萃取技術(shù)是一種新型的萃取分配技術(shù)，其反應(yīng)條件溫和，容易工藝放大，分相時(shí)間短，效果好，其中聚乙二醇相為上相，無機(jī)鹽相為下相，藻藍(lán)蛋白主要分布在聚乙二醇相中；

（4）超濾：將蛋白溶液置于截留分子量為30kda超濾離心管中，離心，冷凍干燥，即為螺旋藻藻藍(lán)蛋白，該步驟可以在不破壞活性蛋白的前提下，能有效去除蛋白溶液中的聚乙二醇，提高了蛋白的濃度并且保證蛋白的純度不會(huì)減小甚至有所增加，該蛋白能提高淋巴細(xì)胞活性，通過淋巴系統(tǒng)提高機(jī)體免疫功能，全面增強(qiáng)機(jī)體的防病、抗病能力還具有優(yōu)異的抗氧化與輻射、抗炎、抑菌的功能，可用于飼料或飲料領(lǐng)域。

本發(fā)明的操作步驟中的常規(guī)操作為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知，在此不進(jìn)行贅述。

以上所述的實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行了詳細(xì)說明，應(yīng)理解的是以上所述僅為本發(fā)明的具體實(shí)施例，并不用于限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的原則范圍內(nèi)所做的任何修改、補(bǔ)充或類似方式替代等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。

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<110>浦江縣歐立生物技術(shù)有限公司

<120>一種螺旋藻藻藍(lán)蛋白的提取方法

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