本發(fā)明涉及生物技術領域，且特別涉及一種抗菌劑及其合成方法與應用。

背景技術：

抗菌劑在臨床治療中發(fā)揮著重要作用，但由于抗菌劑的廣泛和不合理應用，多種病原菌對各種抗菌劑日益耐受。目前，病原菌對抗菌劑的耐藥性問題嚴重威脅人類健康，已成為全球范圍的嚴峻挑戰(zhàn)。據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計，每年約有五萬人死于感染性疾病，且耐藥菌數(shù)量仍在不斷增長。因而，細菌耐藥性問題亟待解決，開發(fā)新型、高效的抗菌劑尤為重要。

黃酮類化合物是指兩個苯環(huán)(a環(huán)與b環(huán))通過中央三碳鏈相互連接，形成一類以1,3-二苯丙烷(c6-c3-c6)為基本碳架的化合物。黃酮類化合物廣泛存在于水果和蔬菜等植物中，具有多種生物活性和藥理活性，具有抗氧化、抗菌、抗腫瘤、抗炎、抗病毒、免疫調節(jié)、解毒護肝和細胞保護作用。近年來，黃酮類化合物對微生物的抑制作用受到科學研究者的廣泛關注。大量研究表明，黃酮類化合物對大腸埃希氏桿菌、副溶血弧菌、沙門氏菌和枯草桿菌等多種致病菌具有顯著的抑制作用。然而，大多數(shù)黃酮類化合物在植物中含量低，且提取純化工藝復雜，生產成本高，不能滿足社會需求。因此，人工合成黃酮類化合物對其在抗菌劑領域的廣泛應用具有重要意義。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的之一在于提供一種抗菌劑，該抗菌劑為3,3’,4’,5,5’-五羥基黃烷酮，為首次合成的新型抗菌劑。

本發(fā)明的第二目的在于提供一種上述抗菌劑的合成方法，該合成方法工藝簡單，產物純度和合成產率均較高。

本發(fā)明的第三目的在于提供一種上述抗菌劑在抑制細菌中的應用，尤其是對金黃色葡萄球菌的抑菌作用較強。

本發(fā)明解決其技術問題是采用以下技術方案來實現(xiàn)的：

本發(fā)明提出一種抗菌劑，為3,3’,4’,5,5’-五羥基黃烷酮，該抗菌劑的化學結構式為：

本發(fā)明還提出了一種上述抗菌劑的合成方法，包括以下步驟：

將2,6-二甲氧甲氧基苯乙酮、3,4,5-三甲氧甲氧基苯甲醛和無水乙醇于冰水浴中混合，然后于氮氣氣氛中加入48～52wt％koh水溶液，反應72～78h，萃取，干燥有機層，得2’,3,4,5,6’-五甲氧甲氧基查爾酮粗品。

將2’,3,4,5,6’-五甲氧甲氧基查爾酮粗品、甲醇、濃度為1.8～2.2mol/l的naoh水溶液和28～32wt％h2o2混合，反應10～14h；萃取，干燥有機層，得環(huán)氧化物粗品。

混合環(huán)氧化物粗品、甲醇和11～13wt％氯化氫甲醇溶液，于48～52℃的條件下反應28～32min，除去溶劑，得3,3’,4’,5,5’-五羥基黃烷酮。

本發(fā)明還提出了一種上述抗菌劑在抑制細菌中的應用。

本發(fā)明實施例的抗菌劑及其合成方法與應用的有益效果是：

該合成方法以2,6-二羥基苯乙酮和3,4,5-三羥基苯甲醛為起始原料，通過羥醛縮合反應生成查爾酮，雙鍵過氧化成環(huán)氧鍵，并在酸性條件下開環(huán)與酚羥基反應生成醚，得到3,3’,4’,5,5’-五羥基黃烷酮。該合成方法工藝簡單，設備簡單，操作方便，產物純度高，產物得率較高。且該物質為首次合成得到，未見相關專利或文獻報道。該抗菌劑可用于抑菌，尤其是對金黃色葡萄球菌具有很強的抑菌活性。

附圖說明

為了更清楚地說明本發(fā)明實施例的技術方案，下面將對實施例中所需要使用的附圖作簡單地介紹，應當理解，以下附圖僅示出了本發(fā)明的某些實施例，因此不應被看作是對范圍的限定，對于本領域普通技術人員來講，在不付出創(chuàng)造性勞動的前提下，還可以根據(jù)這些附圖獲得其他相關的附圖。

圖1為本發(fā)明實施例合成的3,3’,4’,5,5’-五羥基黃烷酮的質譜圖；

圖2為本發(fā)明實施例合成的3,3’,4’,5,5’-五羥基黃烷酮的氫譜圖；

圖3為本發(fā)明實施例合成的3,3’,4’,5,5’-五羥基黃烷酮的碳譜圖。

具體實施方式

為使本發(fā)明實施例的目的、技術方案和優(yōu)點更加清楚，下面將對本發(fā)明實施例中的技術方案進行清楚、完整地描述。實施例中未注明具體條件者，按照常規(guī)條件或制造商建議的條件進行。所用試劑或儀器未注明生產廠商者，均為可以通過市售購買獲得的常規(guī)產品。

下面對本發(fā)明實施例的抗菌劑及其合成方法與應用進行具體說明。

本實施例的抗菌劑的合成方法可以包括以下步驟：將2,6-二甲氧甲氧基苯乙酮、3,4,5-三甲氧甲氧基苯甲醛和無水乙醇加入至圓底燒瓶，于冰水浴中混合，得第一混合液?；旌线^程中可加以攪拌以使圓底燒瓶中的各物質混合均勻。

于氮氣氣氛中，向第一混合液中加入48～52wt％koh水溶液反應72～78h，較佳地，koh水溶液加入的速度不宜過快，以使反應物充分接觸反應。具體地，加入koh水溶液后，將整個體系于冰水浴中反應2～4h后，然后轉移至20～25℃的條件下繼續(xù)反應70～74h，得到第二混合液。

向第二混合液中加入冰水和用于調節(jié)第二混合液的ph至1～2的酸，然后經(jīng)乙酸乙酯萃取，干燥有機層，也即合并有機層并干燥，得2’,3,4,5,6’-五甲氧甲氧基查爾酮粗品。作為可選地，上述酸可以是鹽酸，其濃度可以為2.5～3.5mol/l。

較佳地，上述2,6-二甲氧甲氧基苯乙酮、3,4,5-三甲氧甲氧基苯甲醛、無水乙醇和koh水溶液的添加比例為1g：0.5～0.6g：20～25ml：4～4.5ml。

進一步地，將上述2’,3,4,5,6’-五甲氧甲氧基查爾酮粗品、甲醇、濃度為1.8～2.2mol/l的naoh水溶液和28-32wt％h2o2混合，并于20～25℃的條件下攪拌反應10～14h。除去溶劑，加冰水和乙酸乙酯萃取，合并有機層，干燥，得環(huán)氧化物粗品。

較佳地，在上述合成環(huán)氧化物粗品的過程中，2’,3,4,5,6’-五甲氧甲氧基查爾酮粗品、甲醇、naoh水溶液和h2o2的添加比例為1g：16～17ml：1.6～1.7ml：1.2～1.4ml。

進一步地，將上述環(huán)氧化物粗品、甲醇和11-13wt％氯化氫甲醇溶液混合并于48～52℃的條件下反應28～32min，除去溶劑，得3,3’,4’,5,5’-五羥基黃烷酮。

較佳地，在上述3,3’,4’,5,5’-五羥基黃烷酮的過程中，環(huán)氧化物粗品、甲醇和氯化氫甲醇溶液的添加比例為1g：3～4ml：5～7ml。

作為可選地，本實施例中的2,6-二甲氧甲氧基苯乙酮和3,4,5-三甲氧甲氧基苯甲醛均可自行合成。其中，2,6-二甲氧甲氧基苯乙酮可以經(jīng)以下步驟得到：

將nah和無水dmf加入圓底燒瓶，于冰水浴中混合攪拌，得第三混合液。于氮氣氣氛中，向第三混合液中依次緩慢加入溶于無水dmf的2,6-二羥基苯乙酮和氯甲基甲醚。然后于20～25℃的條件下反應5～7h后加入冰水和乙酸乙酯萃取，合并有機層，干燥，得2,6-二甲氧甲氧基苯乙酮粗品。

較佳地，上述2,6-二羥基苯乙酮、nah、總無水dmf和氯甲基甲醚的添加比例為1g：1.5～2g：35～40ml：4～6ml。

3,4,5-三甲氧甲氧基苯甲醛可經(jīng)以下步驟得到：

將3,4,5-三羥基苯甲醛、無水k2co3和丙酮加入圓底燒瓶，于冰水浴中混合攪拌，得第四混合液。在氮氣氣氛中，于30min內向第四混合液中緩慢加入氯甲基甲醚；攪拌回流7～9h，過濾，除去溶劑，得3,4,5-三甲氧甲氧基苯甲醛粗品。其中，氯甲基甲醚于30min內加入，可有效避免反應劇烈產生大量熱，同時，緩慢加入可以讓反應物充分接觸反應。超過30min過長加入氯甲基甲醚，會增加反應時長，降低生產效率。

較佳地，上述3,4,5-三羥基苯甲醛、無水k2co3、丙酮和氯甲基甲醚的添加比例為1g：8～10g：100～200ml：5～6ml。

承上，在2,6-二甲氧甲氧基苯乙酮和3,4,5-三甲氧甲氧基苯甲醛的合成過程中均加入了氯甲基甲醚，其目的是對2,6-二甲氧甲氧基苯乙酮和3,4,5-三甲氧甲氧基苯甲醛所具有所有羥基均進行保護，避免在發(fā)生羥醛縮合反應前發(fā)生其它反應。

鑒于經(jīng)上述合成方法得到的3,3’,4’,5,5’-五羥基黃烷酮中含有部分雜質，為了提高3,3’,4’,5,5’-五羥基黃烷酮的純度，本實施例的合成方法中還可包括對3,3’,4’,5,5’-五羥基黃烷酮進行純化。較佳地，例如可用制備型高效液相色譜儀進行純化。

純化條件如下：ods-3色譜柱(5μm)；流速，18.9ml/min；柱溫，25℃；檢測波長，280nm；洗脫液，35wt％甲醇-水溶液；收集28min的色譜峰，除去溶劑。

對最終合成所得的物質進行電噴霧電離質譜法(esi-ms)和核磁共振(nmr)檢測，其結果分別如圖1至圖3所示。

其中，圖1所示的3,3’,4’,5,5’-五羥基黃烷酮化合物的電噴霧電離質譜(esi-ms)圖表明該化合物的分子量為m/z303.31[m-h]^-。

圖2所示的3,3’,4’,5,5’-五羥基黃烷酮化合物的氫譜圖的結果顯示：¹h-nmrδ(600hz,dmso-d4)ppm(jinhz)：4.54(1h,dd,j＝11.2,6.2,3-h),4.99(1h,d,j＝11.2,2-h),5.82(1h,d,j＝6.2,3-oh),6.41(2h,s,2’,6’-oh),6.45(1h,d,j＝8.3,6-h),6.50(1h,d,j＝8.3,8-h),7.44(1h,t,j＝8.3,7-h),8.17(1h,s,4’-oh),8.85(2h,s,3’,5’-oh),11.49(1h,s,5-oh)。

圖3所示的3,3’,4’,5,5’-五羥基黃烷酮化合物的碳譜圖的結果顯示：¹³c-nmrδ(dmso-d4)ppm：72.66(c-3),83.72(c-2),107.14(c-10),107.49(c-2’and6’),107.86(c-6),109.15(c-8),127.40(c-1’),134.00(c-4’),138.82(c-7),146.17(c-3’and5’),161.52(c-5and9),200.85(c-4)。

承上，證實該物質的確為3,3’,4’,5,5’-五羥基黃烷酮。

承上所述，本實施例中的3,3’,4’,5,5’-五羥基黃烷酮合成方法是以2,6-二羥基苯乙酮和3,4,5-三羥基苯甲醛為起始原料，先用氯甲基甲醚將2,6-二羥基苯乙酮和3,4,5-三羥基苯甲醛的所有羥基進行保護，再通過羥醛縮合反應生成查爾酮，雙鍵過氧化成環(huán)氧鍵，并在酸性條件下開環(huán)與酚羥基反應生成醚，最后采用制備型高效液相色譜分離純化得到高純度的3,3’,4’,5,5’-五羥基黃烷酮。其具體合成路線如下：

以下結合實施例對本發(fā)明的特征和性能作進一步的詳細描述。

實施例1

(1)在200ml圓底燒瓶中加入10ml無水dmf，于冰水浴中攪拌加入1.5gnah，得第三混合液。取1g的2,6-二羥基苯乙酮溶于20ml無水dmf，在氮氣氣氛中，于30min內緩慢加入上述第三混合液；然后取4ml氯甲基甲醚溶于5ml無水dmf，繼續(xù)緩慢加入上述反應混合液。接著，于20℃的條件下攪拌反應6h，加入100ml冰水，用450ml乙酸乙酯萃取三次，合并有機層，并用無水na2so4干燥，減壓除去溶劑，得1.4g的2,6-二甲氧甲氧基苯乙酮粗品。

(2)在500ml圓底燒瓶中依次加入0.5g的3,4,5-三羥基苯甲醛、4.5g無水k2co3和100ml丙酮，置于冰水浴中攪拌，得第四混合液。在氮氣氣氛中，于30min內向上述第四混合液中加入2.5ml氯甲基甲醚；攪拌回流反應8h，過濾，減壓除去溶劑，得0.8g的3,4,5-三甲氧甲氧基苯甲醛粗品。

(3)在200ml圓底燒瓶中依次加入1.4g步驟(1)中得到的2,6-二甲氧甲氧基苯乙酮粗品、0.8g步驟(2)中得到的3,4,5-三甲氧甲氧基苯甲醛以及30ml無水乙醇，置于冰水浴中混合攪拌，得第一混合液。在氮氣氣氛中，向第一混合液中緩慢加入6ml50wt％koh水溶液，于冰水浴中攪拌反應3h后，轉移至20℃的條件下繼續(xù)反應72h，得到第二混合液。向第二混合液中加入40ml冰水，并3mol/l的hcl水溶液調節(jié)第二混合液的ph至1，然后用200ml乙酸乙酯萃取三次，合并有機層，無水na2so4干燥，減壓除去溶劑，得1.2g的2’,3,4,5,6’-五甲氧甲氧基查爾酮粗品。

(4)在100ml圓底燒瓶中依次加入步驟(3)中得到的1.2g2’,3,4,5,6’-五甲氧甲氧基查爾酮粗品以及20ml甲醇、2ml2mol/l的naoh水溶液和1.5ml30wt％h2o2，于20℃的條件下反應12h。減壓除去溶劑，加入30ml冰水，用100ml乙酸乙酯萃取三次，合并有機層，無水na2so4干燥，得0.8g環(huán)氧化物粗品。

(5)在50ml圓底燒瓶中依次加入步驟(4)中得到的0.8g環(huán)氧化物粗品以及3ml甲醇和5ml12wt％氯化氫甲醇溶液，于50℃攪拌反應30min，減壓除去溶劑，得0.35g的3,3’,4’,5,5’-五羥基黃烷酮粗品。

(6)收集步驟(5)中得到的3,3’,4’,5,5’-五羥基黃烷酮粗品，用制備型高效液相色譜純化。制備色譜的分離條件如下：ods-3色譜柱(5μm)；流速，18.9ml/min；柱溫，25℃；檢測波長，280nm；洗脫液，35wt％甲醇-水溶液；收集28min的色譜峰，減壓除去溶劑，得0.12g的3,3’,4’,5,5’-五羥基黃烷酮純品。

實施例2

(1)在500ml圓底燒瓶中加入20ml無水dmf，于冰水浴中攪拌加入4gnah，得第三混合液。取2g2,6-二羥基苯乙酮溶于40ml無水dmf，在氮氣氣氛中，于30min內緩慢加入上述第三混合液；然后取12ml氯甲基甲醚溶于20ml無水dmf，繼續(xù)緩慢加入上述反應混合液。接著，于25℃的條件下攪拌反應5h，加入200ml冰水，用800ml乙酸乙酯萃取三次，合并有機層，并用無水na2so4干燥，減壓除去溶劑，得3g的2,6-二甲氧甲氧基苯乙酮粗品。

(2)在500ml圓底燒瓶中依次加入1g的3,4,5-三羥基苯甲醛、8g無水k2co3和100ml丙酮，置于冰水浴中攪拌，得第四混合液。在氮氣氣氛中，于30min內向上述第四混合液中加入6ml氯甲基甲醚；攪拌回流反應7h，過濾，減壓除去溶劑，得1.7g的3,4,5-三甲氧甲氧基苯甲醛粗品。

(3)在500ml圓底燒瓶中依次加入3g步驟(1)中得到的2,6-二甲氧甲氧基苯乙酮粗品、1.8g步驟(2)中得到的3,4,5-三甲氧甲氧基苯甲醛以及60ml無水乙醇，置于冰水浴中混合攪拌，得第一混合液。在氮氣氣氛中，向第一混合液中緩慢加入12ml48wt％koh水溶液，于冰水浴中攪拌反應2h后，轉移至25℃的條件下繼續(xù)反應70h，得到第二混合液。向第二混合液中加入80ml冰水，并2.5mol/l的hcl水溶液調節(jié)第二混合液的ph至2，然后用400ml乙酸乙酯萃取三次，合并有機層，無水na2so4干燥，減壓除去溶劑，得2.5g的2’,3,4,5,6’-五甲氧甲氧基查爾酮粗品。

(4)在200ml圓底燒瓶中依次加入步驟(3)中得到的2.5g2’,3,4,5,6’-五甲氧甲氧基查爾酮粗品以及40ml甲醇、4ml1.8mol/l的naoh水溶液和3ml28wt％h2o2，于25℃的條件下反應10h。減壓除去溶劑，加入50ml冰水，用200ml乙酸乙酯萃取三次，合并有機層，無水na2so4干燥，得1.8g環(huán)氧化物粗品。

(5)在100ml圓底燒瓶中依次加入步驟(4)中得到的1.8g環(huán)氧化物粗品以及5.4ml甲醇和9ml11wt％氯化氫甲醇溶液，于48℃攪拌反應28min，減壓除去溶劑，得0.8g的3,3’,4’,5,5’-五羥基黃烷酮粗品。

(6)收集步驟(5)中得到的3,3’,4’,5,5’-五羥基黃烷酮粗品，用制備型高效液相色譜純化。制備色譜的分離條件如下：ods-3色譜柱(5μm)；流速，18.9ml/min；柱溫，25℃；檢測波長，280nm；洗脫液，35wt％甲醇-水溶液；收集28min的色譜峰，減壓除去溶劑，得0.28g的3,3’,4’,5,5’-五羥基黃烷酮純品。

實施例3

(1)在200ml圓底燒瓶中加入15ml無水dmf，于冰水浴中攪拌加入2.6gnah，得第三混合液。取1.5g2,6-二羥基苯乙酮溶于30ml無水dmf，在氮氣氣氛中，于30min內緩慢加入上述第三混合液；然后取7.5ml氯甲基甲醚溶于11.25ml無水dmf，繼續(xù)緩慢加入上述反應混合液。接著，于22.5℃的條件下攪拌反應7h，加入150ml冰水，用650ml乙酸乙酯萃取三次，合并有機層，并用無水na2so4干燥，減壓除去溶劑，得2g的2,6-二甲氧甲氧基苯乙酮粗品。

(2)在500ml圓底燒瓶中依次加入0.75g的3,4,5-三羥基苯甲醛、7.5g無水k2co3和112.5ml丙酮，置于冰水浴中攪拌，得第四混合液。在氮氣氣氛中，于30min內向上述第四混合液中加入4ml氯甲基甲醚；攪拌回流反應9h，過濾，減壓除去溶劑，得1.2g的3,4,5-三甲氧甲氧基苯甲醛粗品。

(3)在200ml圓底燒瓶中依次加入2g步驟(1)中得到的2,6-二甲氧甲氧基苯乙酮粗品、1g步驟(2)中得到的3,4,5-三甲氧甲氧基苯甲醛以及50ml無水乙醇，置于冰水浴中混合攪拌，得第一混合液。在氮氣氣氛中，向第一混合液中緩慢加入9ml52wt％koh水溶液，于冰水浴中攪拌反應4h后，轉移至22.5℃的條件下繼續(xù)反應74h，得到第二混合液。向第二混合液中加入60ml冰水，并3.5mol/l的hcl水溶液調節(jié)第二混合液的ph至1.5，然后用300ml乙酸乙酯萃取三次，合并有機層，無水na2so4干燥，減壓除去溶劑，得1.8g的2’,3,4,5,6’-五甲氧甲氧基查爾酮粗品。

(4)在100ml圓底燒瓶中依次加入步驟(3)中得到的1.8g的2’,3,4,5,6’-五甲氧甲氧基查爾酮粗品以及30.6ml甲醇、3.6ml的2.2mol/l的naoh水溶液和2.52ml32wt％h2o2，于22.5℃的條件下反應14h。減壓除去溶劑，加入45ml冰水，用150ml乙酸乙酯萃取三次，合并有機層，無水na2so4干燥，得1.2g環(huán)氧化物粗品。

(5)在50ml圓底燒瓶中依次加入步驟(4)中得到的1.2g環(huán)氧化物粗品以及4.8ml甲醇和8.4ml13wt％氯化氫甲醇溶液，于52℃攪拌反應33min，減壓除去溶劑，得0.5g的3,3’,4’,5,5’-五羥基黃烷酮粗品。

(6)收集步驟(5)中得到的3,3’,4’,5,5’-五羥基黃烷酮粗品，用制備型高效液相色譜純化。制備色譜的分離條件如下：ods-3色譜柱(5μm)；流速，18.9ml/min；柱溫，25℃；檢測波長，280nm；洗脫液，35wt％甲醇-水溶液；收集28min的色譜峰，減壓除去溶劑，得0.18g的3,3’,4’,5,5’-五羥基黃烷酮純品。

應用例1

以上述實施例1中合成的3,3’,4’,5,5’-五羥基黃烷酮對細菌中的金黃色葡萄球菌進行最小抑菌濃度測定，測定方法及結果如下：

(1)將金黃色葡萄球菌接種至營養(yǎng)肉湯，于37℃及120rpm的條件下培養(yǎng)8h，獲得對數(shù)生長期菌株，用新鮮營養(yǎng)肉湯稀釋，得到含菌量約1×10⁶cfu/ml的接種菌液。

(2)用二甲基亞砜將3,3’,4’,5,5’-五羥基黃烷酮溶解至100mg/ml，并用營養(yǎng)肉湯稀釋至2mg/ml，再依次對倍稀釋，得到2、1、0.5、0.25、0.125、0.0625、0.0313、0.0156、0.0078、0.0039和0.0020mg/ml共11個梯度濃度。取100μl上述不同濃度的3,3’,4’,5,5’-五羥基黃烷酮依次加入無菌96孔板1～11號孔內，每個濃度做3個平行，第12孔加入100μl營養(yǎng)肉湯作為生長對照孔。

(3)取100μl上述接種菌液至1～12號孔內，即最終接種菌濃為5×10⁵cfu/ml，藥物受試濃度為1～0.0010mg/ml。將96孔板置于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后觀察結果。

培養(yǎng)24h后肉眼觀察，1～4號孔澄清透明，無菌生長；5～12孔均渾濁，有菌生長；故3,3’,4’,5,5’-五羥基黃烷酮對金黃色葡萄球菌最小抑菌濃度為0.125mg/ml。

此外，將實施例2和實施例3所合成的3,3’,4’,5,5’-五羥基黃烷酮按照上述方法對金黃色葡萄球菌進行最小抑菌濃度測定，其結果均與實施例1所得結果一致。

承上，由本發(fā)明實施例所合成的3,3’,4’,5,5’-五羥基黃烷酮對金黃色葡萄球菌具有很強的抑制作用。

綜上所述，本發(fā)明實施例的抗菌劑的合成方法工藝簡單，設備簡單，操作方便，產物純度高，產物得率較高。該物質可用于抑菌，尤其是對金黃色葡萄球菌具有很強的抑菌活性。

以上所描述的實施例是本發(fā)明一部分實施例，而不是全部的實施例。本發(fā)明的實施例的詳細描述并非旨在限制要求保護的本發(fā)明的范圍，而是僅僅表示本發(fā)明的選定實施例?；诒景l(fā)明中的實施例，本領域普通技術人員在沒有作出創(chuàng)造性勞動前提下所獲得的所有其他實施例，都屬于本發(fā)明保護的范圍。