本發(fā)明屬于煙草基因工程技術領域，具體涉及一個與植物耐旱相關的ntdr1基因及其應用的專利申請。

背景技術：

煙草是雙子葉植物管花目茄科煙草屬植物。煙草在生長期對水分要求較高，若遭受干旱脅迫會嚴重響應煙葉產(chǎn)量和品質(zhì)。我國是一個水資源相對缺乏的國家，水資源時空分布不均，近年來我們部分煙區(qū)頻繁遭受嚴重干旱，旱災發(fā)生的頻率和影響范圍不斷擴大，持續(xù)時間和遭受的損失增加，對我國煙葉生產(chǎn)產(chǎn)生了極大的影響。

通過興修水利設施灌溉來解決煙草在生長季節(jié)時遭受的干旱問題，雖有不錯的效果，但是成本太高，在短期內(nèi)難于實現(xiàn)全部煙田有配套灌溉，而且在有些煙區(qū)受自然條件或其他因素影響，這種方式具有較大局限性。因此，獲得及利用具有耐旱性的煙草新品種，對煙草的優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)具有重要的生產(chǎn)應用意義。

傳統(tǒng)的雜交育種方式中，受抗性親本資源缺乏的限制，獲得優(yōu)良品種的進程十分緩慢。而隨著煙草基因組計劃的實施，煙草完成了全基因組測序。利用基因工程相關技術，從煙草中分離出耐旱相關基因并將其應用到耐旱煙草分子育種中，對于保證煙草的品質(zhì)和產(chǎn)量具有重要的現(xiàn)實意義。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明目的在于提供一個與植物耐旱相關的ntdr1基因，該基因所表達蛋白能夠增強植物耐旱性，從而為耐旱植物尤其是耐旱煙草新品種培育奠定基礎。

一個與植物耐旱相關的ntdr1基因，包括1424bp堿基，其堿基序列如seqidno.1所示，其中特異性核酸序列為第1~921位核苷酸。

所述植物耐旱相關的ntdr1基因所編碼蛋白，其氨基酸序列如seqidno.2所示。

所述植物耐旱相關的ntdr1基因在增強植物耐旱性中的應用，超表達ntdr1基因后，植物耐旱性能得到提升。

用于超表達植物耐旱相關的ntdr1基因的重組超表達載體，將ntdr1基因與植物表達載體重組連接構建獲得，所述植物表達載體可用于植物微彈轟擊的載體，如pcambia3301、pcambia1300、pbi121、pbin19、pcambia2301、pcambia1301-ubin、pby505或其它衍生植物表達載體等。

所述用于超表達植物耐旱相關的ntdr1基因的重組超表達載體的構建方法，構建重組表達載體時，可在其轉錄起始核苷酸前加上任何一種增強型、組成型、組織特異型或誘導型啟動子，如花椰菜花葉病毒（camv）35s啟動子、泛素（ubiquitin）基因啟動子（pubi）、actin啟動子等，它們可單獨使用或與其它的植物啟動子結合使用；

另外，構建過程中，還可使用增強子，包括翻譯增強子或轉錄增強子，這些增強子區(qū)域可以是atg起始密碼子或鄰接區(qū)域起始密碼子等，但必需與編碼序列的閱讀框相同，以保證整個序列的正確翻譯；

以具體的重組超表達載體（質(zhì)粒）pcosac-ntdr1為例，將ntdr1基因插入pcosac的多克隆位點后，獲得重組表達載體（質(zhì)粒）pcosac-ntdr1；

所述pcosac是將pactin啟動子（堿基序列如seqidno.3所示，長度為1424bp）插入pcambia1301的多克隆位點得到的重組質(zhì)粒。

利用所述用于超表達植物耐旱相關的ntdr1基因的重組超表達載體pcosac-ntdr1所構建的ntdr1基因超表達植物新品種的培育方法，具體為：利用基因槍法、花粉管通道、顯微注射、電導、農(nóng)桿菌介導等生物學方法，將重組超表達載體pcosac-ntdr1轉化、并整合進入植物基因組中（例如煙草、擬南芥等），進一步通過篩選、鑒定獲得ntdr1基因超表達植物新品種；所述ntdr1基因超表達植物新品種，其耐旱性能得到增強，具體表現(xiàn)為：植株在干旱條件下的萌發(fā)率得到提高，根長和根重等表型數(shù)據(jù)得到提升。

煙草ntdr1基因受是干旱誘導表達，在煙草耐旱過程中發(fā)揮重要作用。將構建好的過量表達載體轉化模式植物擬南芥，獲得過量表達ntdr1基因的擬南芥轉基因植株。

本申請中，發(fā)明人通過克隆和分析ntdr1基因，認為該基因受干旱誘導表達，在煙草耐旱過程中發(fā)揮重要作用，與植物的耐旱性高度相關。進一步通過構建過表達質(zhì)粒pcosac-ntdr1，并轉化植物后，獲得了過量表達ntdr1基因轉基因植株。在模擬干旱或干旱條件下，與野生型對照相比，ntdr1過量表達轉基因植株在萌發(fā)期可明顯提高轉化植物種子在干旱條件下萌發(fā)率，在幼苗期及營養(yǎng)生長期，轉基因植株的根長和根重更有優(yōu)勢，表現(xiàn)出較好地耐旱性?；谶@一結果，通過對ntdr1基因的深入開發(fā)利用，可為耐旱植物新品種開發(fā)和培育奠定一定理論和應用基礎。

附圖說明

圖1為構建pcosac-ntdr1載體酶切圖；其中1、2為酶切結果，m為marker；

圖2為pcosac-ntdr1轉基因擬南芥不同株系中ntdr1的表達情況；其中ck為對照，l1~l10為不同株系；

圖3為pcosac-ntdr1轉基因植株和對照在模擬干旱條件下的萌發(fā)率比較；

圖4為pcosac-ntdr1轉基因植株和對照在模擬干旱下的根長比較；

圖5為pcosac-ntdr1轉基因植株和對照的耐旱性表型。

具體實施方式

下面結合實施例對本申請做進一步的解釋說明，在介紹具體實施例前，就下述實施例中所涉及部分生物材料、實驗試劑、實驗儀器等基本情況簡要介紹如下。

生物材料：

煙草材料：栽培煙草（nicotianatabacum）k326，購自玉溪中煙種子有限責任公司；

擬南芥（nicotianabenthamiana），種子購買于abrc種子中心；

基因測序及引物合成由上海生工生物工程有限公司完成；

過量表達煙草基因所用載體質(zhì)粒pcambia1301購買于pcambialab；

pcosac載體是在pcambia1301基礎上添加上水稻actin組成型表達啟動，具體構建時，按現(xiàn)有技術參考如下流程構建即可：

（1）利用pcr技術從水稻培矮64s基因組中擴增得到pactin啟動子（擴增序列如seqidno.3所示），pcr擴增時，引物序列設計如下：

上游引物：5’–ggtaccctcgaggtcattcatatgcttgag-3’，引物設計時增加了kpni切點，

下游引物：5’-ccatggcacgtgtctagatctacctacaaaaaagctccg-3’，下游引物設計時添加了xbai、pmaci和ncoi酶切位點；

（2）將上述擴增產(chǎn)物連接到pmd18-t載體上，轉化，并進行酶切鑒定，確保重組正確；

（3）用kpni和ncoi對步驟（2）中帶有正確目的片段的克隆進行酶切：先用ncoi酶切，接著用klenow將末端填平，然后再用kpni酶切；回收酶切產(chǎn)物，得到一端為kpni粘性末端，一端為平端的啟動子片段；

（4）用kpni和pmaci對pcambia1301質(zhì)粒（cambialabs）進行雙酶切，同樣得到一端為kpni粘性末端，一端為平端的載體片段；

（5）將步驟（3）與步驟（4）中酶切產(chǎn)物進行連接，轉化、鑒定獲得重組正確的pcosac載體；

實驗試劑：

限制性內(nèi)切酶、dntp、primerstargxldnapolymerase、dna凝膠回收試劑盒minibestagarosegeldnaextractionkit、質(zhì)粒dna小量純化試劑盒minibestplasmidpurificationkit、rna提取trizol試劑等，為invitrogen公司產(chǎn)品；

反轉錄試劑盒，roche公司產(chǎn)品；

dnaase酶，fermentas公司產(chǎn)品；

卡那霉素、利福平等抗生素購于上海生工生物工程有限公司。

實施例1

本實施例主要就ntdr1基因的獲得過程簡要介紹說明如下。

（1）、總rna提取

在正常生長條件下，對生長4周的栽培煙草k326取材，將樣品材料在液氮中研磨成粉末狀，取約100mg粉末狀材料置于盛有1.0mltrizol(invitrogen)的１.5ml離心管中，置-80℃保存?zhèn)溆茫?/p>

采用trizol試劑提取法提取總rna，具體過程為：

將-80℃保存?zhèn)溆玫臉悠啡〕觯覝亟鈨龊?，加?00μl氯仿，振蕩混勻；

離心后，小心取出上層水相，轉入另一離心管中，加入500μl異丙醇，沉淀、離心分離出rna；

再經(jīng)75%酒精洗滌，室溫微干后，加入適當體積的rnase-free的水，充分溶解；

所提rna經(jīng)dna酶（fermentas）處理。

（2）、反轉錄為cdna

取2μg的k326總rna樣品進行反轉錄，加入0.5μg/μl的oligo（dt）1μl，加入去離子水補足到12μl；

70℃保溫5min后，依次加入5×rtbuffer4μl，20u/μl的rnase抑制劑1μl，10mmol/ldntp2μl，37℃保溫5min；

然后加入200u/μlm-mlv反轉錄酶1μl，反應終體積為20μl；

42℃反應60min，70℃加熱10min終止反應。

（3）、pcr體外擴增

pcr擴增參考了clontech公司的in-fisuon方法，人工合成一對引物，并在其5’端分別加上15-20bp載體互補序列；

上游引物及下游引物如下：

ntdr1-f：5’-gtaggtagatctagacacgttatcacagtctccgagttt-3’，

ntdr1-r：5’-attcacactccatggcactcagagtggctgtacattccgg-3’；

以上述步驟（2）所制備k326的cdna作為模板，以ntdr1-f和ntdr1-r為引物，采用高保真primestar?gxldnapolymerase（takara）進行pcr擴增；40μl反應體系設計如下：

gxldnapolymerase，0.8μl；

5×gxlbuffer，8μl；

dntp，4μl；

ntdr1-f，2μl；

ntdr1-r，2μl；

cdna，1μl；

ddh2o，22.2μl；

反應程序:98℃、10s；52℃、15s，68℃、1min，35個循環(huán)，最后72℃延伸10min；反應結束后，電泳檢測pcr結果（結果如圖1所示）。

電泳后，在紫外光照射下進行切膠回收，利用凝膠回收試劑盒（takara）回收目的基因片斷。

對所回收擴增產(chǎn)物進行測序，即為ntdr1基因，其包括1424bp堿基，其堿基序列如seqidno.1所示，其中特異性核酸序列為第1~921位核苷酸。

實施例2

利用實施例1所獲得ntdr1基因，發(fā)明人進一步構建了轉化用重組表達載體pcosac-ntdr1，相關過程簡要介紹如下。

首先將實施例1所獲得ntdr1基因與經(jīng)pmaci酶切后的pcosac質(zhì)粒進行連接，參照clontech公司的in-fusion無縫連接說明書，按試劑盒要求建立連接10μl的反應體系如下：

5xin-fusion，2μl；

pcosac（pmaci酶切后回收產(chǎn)物），4μl；

ntdr1，4μl；

50℃、15min，放冰上，用于下一步的轉化。

采用熱激法，將上述連接產(chǎn)物轉化大腸桿菌感受態(tài)細胞，具體過程為：

無菌條件下取10μl連接產(chǎn)物加到感受態(tài)細胞中，輕輕混勻后冰浴30min；

42℃熱激90s，將離心管迅速轉到冰浴中放置2-3min；

加無抗生素的lb培養(yǎng)基800μl，37℃搖床溫和搖振1h左右；

取200μl培養(yǎng)液涂于含抗生素（kam）50μg/ml的lb固體培養(yǎng)基上，37℃倒置培養(yǎng)12-16h。

挑取培養(yǎng)基中長出白色菌斑，分別接種于含有50μg/ml的kam的lb液體培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)12-16h，利用堿裂解法小量提取質(zhì)粒dna（takara），所得質(zhì)粒經(jīng)bamhi和hindiii雙酶切驗證，結果正確的陽性克隆進一步送公司測序，以確保重組質(zhì)粒構建正確。

實施例3

利用熱激法，將實施例2所制備pcosac-ntdr1載體轉化農(nóng)桿菌gv3101（購于天根生化科技（北京）有限公司），抽提質(zhì)粒并進行酶切鑒定，以確定表達載體pcosac-ntdr1成功轉化農(nóng)桿菌。

轉化擬南芥：

采用農(nóng)桿菌浸染花序法將表達載體整合到擬南芥（col-0）基因組中，篩選在含有潮霉素（50mg/l）的ms培養(yǎng)基上進行；

t2代種子繼續(xù)在含潮霉素的ms上篩選，選取分離比例為3:1的株系在t3代繼續(xù)篩選；

t3代時，若種子100%可以在含潮霉素的ms上生長，則認為該株系為純合株系。

隨機選取其中兩個純合株系進行分子檢測。

采用trizol試劑提取法（invitrogen）提取擬南芥總rna，并反轉錄得到cdna；以此cdna為模板，進行實時定量pcr檢測。如圖2檢測結果表明，ntdr1基因在不同轉基因株系中均可表達，但表達水平存在一定差異。但也證明了ntdr1基因已整合到擬南芥基因組中，且在轉基因擬南芥中能進行表達。

耐旱性鑒定

將上述轉pcosac-ntdr1擬南芥移至溫室培養(yǎng)，自交，收集轉基因擬南芥的種子。同時以轉pcosac空載體的擬南芥為對照。選取l1和l3兩個表達水平相對較高的轉基因株系用于后續(xù)的耐旱性鑒定。

將同期收獲的轉pcosac-ntdr1轉基因擬南芥、轉pcosac的擬南芥的種子消毒，種子分別點種到正常的ms培養(yǎng)基或含有200mm甘露醇的ms培養(yǎng)基上。培養(yǎng)皿放置于4℃，黑暗培養(yǎng)，2天后將皿取出放到光照培養(yǎng)箱中，常規(guī)生長條件培養(yǎng)（16h/8h，光期/暗期；22℃），4天后統(tǒng)計萌發(fā)率。

結果發(fā)現(xiàn)，ntdr1的轉基因株系在模擬干旱條件下的萌發(fā)率明顯高于對照（如圖3所示）。

另外，將上述消毒、春化后的種子分別點種于含有200mm的甘露醇的ms培養(yǎng)基以及正常ms培養(yǎng)基上，生長條件如上述所示，保持培養(yǎng)皿直立，第14天測量根長。在模擬干旱的情況下，ntdr1轉基因植株的根長生長受抑制情況比對照弱（如圖4所示）。

將轉pcosac-ntdr1轉基因擬南芥、轉pcosac的擬南芥萌發(fā)后轉移到到營養(yǎng)土土中，常規(guī)條件生長3周后開始斷水。斷水14天后開始復水，復水一周后拍照。結果如圖5所示，轉pcosac-ntdr1擬南芥（l1、l3）在經(jīng)歷先斷水后復水之后的成活率明顯高于空載體對照。

綜上所述：在干旱/模擬干旱脅迫下，轉pcosac-ntdr1轉基因擬南芥的耐受性明顯強于與空載體對照。換言之，通過過表達ntdr1基因，可明顯增強植株的耐旱性能。

sequencelisting

<110>中國煙草總公司鄭州煙草研究院

<120>與植物耐旱相關的ntdr1基因及其應用

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