本發(fā)明屬于細(xì)胞研究領(lǐng)域，涉及一種基于慢病毒載體骨架的、穩(wěn)定株篩選、觀察細(xì)胞內(nèi)自噬體變化的慢病毒綠色熒光自噬報(bào)告載體及構(gòu)建方法。

背景技術(shù)：

自噬是細(xì)胞內(nèi)的一種“自食”的現(xiàn)象，凋亡是“自殺”的現(xiàn)象，二者共用相同的刺激因素和調(diào)節(jié)蛋白，但是誘發(fā)閾值和門檻不同，如何轉(zhuǎn)換和協(xié)調(diào)目前還不清楚。自噬是指膜包裹部分胞質(zhì)和細(xì)胞內(nèi)需降解的細(xì)胞器、蛋白質(zhì)等形成自噬體，最后與溶酶體融合形成自噬溶酶體，降解其所包裹的內(nèi)容物，以實(shí)現(xiàn)細(xì)胞穩(wěn)態(tài)和細(xì)胞器的更新。

由于自噬過程很快，所以在研究自噬時(shí)要進(jìn)行動(dòng)態(tài)觀察，自噬體屬于亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，所以要在投射電鏡下觀察自噬體，但是投射電鏡耗時(shí)太長(zhǎng)，不利于監(jiān)測(cè)自噬形成。利用lc3在自噬形成過程中發(fā)生聚集的現(xiàn)象開發(fā)出了gfp-lc3技術(shù)：沒有發(fā)生自噬時(shí)，綠色熒光自噬標(biāo)記基因lc3融合蛋白彌散在胞漿中；自噬發(fā)生時(shí)，綠色熒光自噬標(biāo)記基因lc3融合蛋白轉(zhuǎn)位至自噬體膜，在熒光顯微鏡下形成多個(gè)明亮的綠色熒光斑點(diǎn)，一個(gè)斑點(diǎn)相當(dāng)于一個(gè)自噬體，可以通過計(jì)數(shù)來評(píng)價(jià)自噬活性的高低?？梢姌?gòu)建一種綠色熒光自噬載體對(duì)研究的重要性。

目前已有一些商品化的自噬檢測(cè)的綠色熒光載體，但存在一些局限性：1、載體骨架為普通質(zhì)粒載體，難以獲得穩(wěn)定表達(dá)的細(xì)胞株；2、價(jià)格昂貴且使用受限制。售價(jià)從5000元到上萬元不等；3、含有綠色熒光蛋白的載體質(zhì)粒不能特異性的觀察自噬體的變化情況。4、有的載體含有g(shù)418篩選基因，篩選周期長(zhǎng)，穩(wěn)定性不高。因此構(gòu)建一種慢病毒綠色熒光自噬報(bào)告載體在細(xì)胞和相關(guān)領(lǐng)域的研究具有重要的意義和廣闊的應(yīng)用前景。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明解決的問題在于提供一種慢病毒質(zhì)粒為骨架、插入綠色熒光自噬標(biāo)記蛋白lc3基因，獲得慢病毒綠色熒光自噬報(bào)告載體及構(gòu)建方法。

本發(fā)明通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)：

一種慢病毒綠色熒光自噬報(bào)告載體，包含氨芐青霉素抗性、嘌呤霉素篩選標(biāo)記和綠色熒光自噬標(biāo)記蛋白lc3基因序列。

本發(fā)明所述的綠色熒光自噬標(biāo)記蛋白lc3基因序列如seq.id.no.1所示。

一種慢病毒綠色熒光自噬報(bào)告載體的構(gòu)建方法，包括以下步驟：

(1)根據(jù)綠色熒光自噬標(biāo)記蛋白lc3基因序列信息，設(shè)計(jì)并合成引物，以pex-gfp-hlc3wt載體質(zhì)粒為模板，pcr擴(kuò)增獲得綠色熒光自噬標(biāo)記蛋白lc3基因序列；

(2)根據(jù)綠色熒光自噬標(biāo)記蛋白lc3基因序列和plenti-puro序列，用bamhi和xhoi酶切綠色熒光自噬標(biāo)記蛋白lc3基因的pcr產(chǎn)物和plenti-puro載體質(zhì)粒，將酶切產(chǎn)物連接，獲得目的載體plenti-puro-gfp-lc3，載體完整序列seq.id.no.2；

(3)無內(nèi)毒素提取驗(yàn)證載體plenti-puro-gfp-lc3質(zhì)粒，用bamhi和xhoi酶切載體plenti-puro-gfp-lc3質(zhì)粒，核酸電泳檢測(cè)基因序列大小，同時(shí)將載體plenti-puro-gfp-lc3質(zhì)粒測(cè)序驗(yàn)證序列是否與預(yù)期一致；

(4)用載體plenti-puro-gfp-lc3質(zhì)粒轉(zhuǎn)染hep2細(xì)胞,48h后激光共聚焦顯微鏡觀察gfp-lc3的表達(dá)情況。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果：

1、本發(fā)明的綠色熒光自噬標(biāo)記蛋白lc3質(zhì)粒以慢病毒作為骨架，有利于獲得穩(wěn)定表達(dá)綠色熒光細(xì)胞系的建立，而且由于慢病毒對(duì)哺乳動(dòng)物細(xì)胞廣泛的適用性，本發(fā)明的綠色熒光質(zhì)?？捎糜诙喾N細(xì)胞。與使用普通載體昂貴的價(jià)格和特異性相比，成本很低。

2、本發(fā)明的綠色熒光plenti載體綠色熒光和目的基因lc3使用cmv啟動(dòng)子，該啟動(dòng)子在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中高表達(dá)。

3、本發(fā)明的綠色熒光自噬標(biāo)記蛋白lc3基因融合蛋白能夠利用熒光標(biāo)簽觀察并判斷自噬體的變化情況。

4、本發(fā)明的慢病毒綠色熒光自噬報(bào)告載體含有嘌呤霉素篩選基因，篩選的周期短，穩(wěn)定性更高。

附圖說明

圖1為plenti-puro載體結(jié)構(gòu)圖譜；

圖2為plenti-puro-gfp-lc3目的載體酶切電泳鑒定結(jié)果圖；

圖3為pex-gfp-hlc3wt載體結(jié)構(gòu)圖譜；

圖4為綠色熒光自噬標(biāo)記蛋白lc3目的基因pcr產(chǎn)物電泳鑒定結(jié)果圖；

圖5為plenti-puro載體質(zhì)粒及綠色熒光自噬標(biāo)記蛋白lc3目的基因酶切圖譜；

圖6為plenti-puro-gfp-lc3目的載體電泳鑒定結(jié)果圖；

圖7為plenti-puro-gfp-lc3載體測(cè)序結(jié)果部分峰圖；

圖8為激光共聚焦顯微鏡檢測(cè)綠色熒光自噬標(biāo)記蛋白lc3表達(dá)結(jié)果圖。

具體實(shí)施方式

本發(fā)明提供一種慢病毒綠色熒光自噬報(bào)告載體構(gòu)建方法，包括插入目的載體plenti-puro-gfp-lc3構(gòu)建、插入目的基因的驗(yàn)證、轉(zhuǎn)染細(xì)胞熒光顯微鏡觀察自噬體的驗(yàn)證。下面結(jié)合具體的實(shí)驗(yàn)過程和實(shí)驗(yàn)結(jié)果對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的詳細(xì)說明，所述是對(duì)本發(fā)明的解釋而不是限定。

一種慢病毒綠色熒光自噬報(bào)告載體的構(gòu)建方法，包括以下步驟：

首先提供質(zhì)粒和主要試劑的來源或制備方法：

plenti-puro載體和pex-gfp-hlc3wt載體由本實(shí)驗(yàn)室所提供。dh5α感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)于北京全式金生物技術(shù)公司。lipofectamine3000轉(zhuǎn)染試劑購(gòu)自thermofisherscientific公司。限制性內(nèi)切酶購(gòu)自neb公司。pcr酶購(gòu)于北京全式金生物技術(shù)公司。連接酶購(gòu)自vazyme公司。

lb液體培養(yǎng)基配方(1l)：胰蛋白胨10g；酵母提取物5g；nacl10g。加1lddh2o攪拌至完全溶解，高壓滅菌。

lb固體培養(yǎng)基配方(1l)：胰蛋白胨10g；酵母提取物5g；nacl10g。加1lddh2o攪拌至完全溶解，高壓滅菌。

氨芐青霉素(100mg/ml):1g溶于10ml1lddh2o，0.22μm濾器過濾除菌。

1、構(gòu)建載體plenti-puro-gfp-lc3

1)設(shè)計(jì)并合成以下引物：f：5’-cgcggatccgccaccatggtgagcaagggcgaggagctg-3’核苷酸序列如seq.id.no.4；r：5’-ccgctcgagttacactgacaatttcatcccgaacgtc-3’核苷酸序列如seq.id.no.5。引物中下劃線部分分別為bamhi和xhol的酶切位點(diǎn)。以pex-gfp-hlc3wt(載體結(jié)構(gòu)如圖3)質(zhì)粒為模板，使用該引物對(duì)進(jìn)行pcr反應(yīng)獲得含有目的基因綠色熒光自噬標(biāo)記蛋白lc3的產(chǎn)物，核苷酸序列如seq.id.no.1所示，pcr反應(yīng)條件為：95℃，3min；95℃,30sec,57℃,30sec,72℃1min，35個(gè)循環(huán)；72℃，3min。核酸電泳，結(jié)果顯示和目的片段大小相符，電泳結(jié)果如圖4所示，膠回收綠色熒光自噬標(biāo)記蛋白lc3產(chǎn)物。

2)使用bamhi和xhol切割2ug的綠色熒光自噬標(biāo)記蛋白lc3和1ug的plenti-puro質(zhì)粒(核苷酸序列如seq.id.no.2)，核酸電泳，結(jié)果如圖5所示，膠回收酶切產(chǎn)物。

3)酶切后回收的綠色熒光自噬標(biāo)記蛋白lc3與plenti-puro質(zhì)粒片段按照1：5的摩爾比用連接酶4度過夜連接。

4)連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌dh5α感受態(tài)細(xì)胞，涂布含100μg/ml氨芐青霉素的lb平板，37℃過夜培養(yǎng)，挑取單克隆進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)和質(zhì)粒提取。

5)提取的質(zhì)粒進(jìn)行電泳鑒定，結(jié)果見圖6。使用bamhi和xhol酶切質(zhì)粒進(jìn)行電泳鑒定，結(jié)果見圖2。電泳檢測(cè)陽性的質(zhì)粒進(jìn)行dna測(cè)序，驗(yàn)證序列方向和部分峰圖，結(jié)果見seq.id.no.3和圖7。plenti-puro-gfp-lc3部分序列如seq.id.no.1所示。

2、無內(nèi)毒素小量提取plenti-puro-gfp-lc3質(zhì)粒

1)取測(cè)序驗(yàn)證正確的plenti-puro-gfp-lc3菌液20微升，接種至含100μg/ml氨芐青霉素的15mllb液體培養(yǎng)基中，37℃搖床過夜培養(yǎng)。

2)無內(nèi)毒素質(zhì)粒小提試劑盒提取培養(yǎng)的菌液中的plenti-puro-gfp-lc3質(zhì)粒，測(cè)定濃度。

3、目的基因表達(dá)和驗(yàn)證

1)將hep2細(xì)胞按適當(dāng)濃度傳代到60mm培養(yǎng)皿中，轉(zhuǎn)染時(shí)細(xì)胞密度在60-70％。

2)用lipofectamine3000轉(zhuǎn)染試劑將plenti-puro-gfp-lc3質(zhì)粒轉(zhuǎn)染hep2細(xì)胞。

3)轉(zhuǎn)染48小時(shí)后在激光共聚焦顯微鏡下觀察結(jié)果如圖8。

sequencelisting

<110>山西醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院

<120>一種慢病毒綠色熒光自噬報(bào)告載體及構(gòu)建方法

<130>.

<160>5

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>718

<212>dna

<213>homosapiens

<400>1

atggtgagcaagggcgaggagctgttcaccggggtggtgcccatcctggtcgagctggac60

ggcgacgtaaacggccacaagttcagcgtgtccggcgagggcgagggcgatgccacctac120

ggcaagctgaccctgaagttcatctgcaccaccggcaagctgcccgtgccctggcccacc180

ctcgtgaccaccctgacctacggcgtgcagtgcttcagccgctaccccgaccacatgaag240

cagcacgacttcttcaagtccgccatgcccgaaggctacgtccaggagcgcaccatcttc300

ttcaaggacgacggcaactacaagacccgcgccgaggtgaagttcgagggcgacaccctg360

gtgaaccgcatcgagctgaagggcatcgacttcaaggaggacggcaacatcctggggcac420

aagctggagtacaactacaacagccacaacgtctatatcatggccgacaagcagaagaac480

ggcatcaaggtgaacttcaagatccgccacaacatcgaggacggcagcgtgcagctcgcc540

gaccactaccagcagaacacccccatcggcgacggccccgtgctgctgcccgacaaccac600

tacctgagcacccagtccgccctgagcaaagaccccaacgagaagcgcgatcacatggtc660

ctgctggagttcgtgaccgccgccgggatcactctcggcatggacgagctgtacaagt718

<210>2

<211>7067

<212>dna

<213>homosapiens

<400>2

aatgtagtcttatgcaatactcttgtagtcttgcaacatggtaacgatgagttagcaaca60

tgccttacaaggagagaaaaagcaccgtgcatgccgattggtggaagtaaggtggtacga120

tcgtgccttattaggaaggcaacagacgggtctgacatggattggacgaaccactgaatt180

gccgcattgcagagatattgtatttaagtgcctagctcgatacataaacgggtctctctg240

gttagaccagatctgagcctgggagctctctggctaactagggaacccactgcttaagcc300

tcaataaagcttgccttgagtgcttcaagtagtgtgtgcccgtctgttgtgtgactctgg360

taactagagatccctcagacccttttagtcagtgtggaaaatctctagcagtggcgcccg420

aacagggacttgaaagcgaaagggaaaccagaggagctctctcgacgcaggactcggctt480

gctgaagcgcgcacggcaagaggcgaggggcggcgactggtgagtacgccaaaaattttg540

actagcggaggctagaaggagagagatgggtgcgagagcgtcagtattaagcgggggaga600

attagatcgcgatgggaaaaaattcggttaaggccagggggaaagaaaaaatataaatta660

aaacatatagtatgggcaagcagggagctagaacgattcgcagttaatcctggcctgtta720

gaaacatcagaaggctgtagacaaatactgggacagctacaaccatcccttcagacagga780

tcagaagaacttagatcattatataatacagtagcaaccctctattgtgtgcatcaaagg840

atagagataaaagacaccaaggaagctttagacaagatagaggaagagcaaaacaaaagt900

aagaccaccgcacagcaagcggccgctgatcttcagacctggaggaggagatatgaggga960

caattggagaagtgaattatataaatataaagtagtaaaaattgaaccattaggagtagc1020

acccaccaaggcaaagagaagagtggtgcagagagaaaaaagagcagtgggaataggagc1080

tttgttccttgggttcttgggagcagcaggaagcactatgggcgcagcgtcaatgacgct1140

gacggtacaggccagacaattattgtctggtatagtgcagcagcagaacaatttgctgag1200

ggctattgaggcgcaacagcatctgttgcaactcacagtctggggcatcaagcagctcca1260

ggcaagaatcctggctgtggaaagatacctaaaggatcaacagctcctggggatttgggg1320

ttgctctggaaaactcatttgcaccactgctgtgccttggaatgctagttggagtaataa1380

atctctggaacagatttggaatcacacgacctggatggagtgggacagagaaattaacaa1440

ttacacaagcttaatacactccttaattgaagaatcgcaaaaccagcaagaaaagaatga1500

acaagaattattggaattagataaatgggcaagtttgtggaattggtttaacataacaaa1560

ttggctgtggtatataaaattattcataatgatagtaggaggcttggtaggtttaagaat1620

agtttttgctgtactttctatagtgaatagagttaggcagggatattcaccattatcgtt1680

tcagacccacctcccaaccccgaggggacccgacaggcccgaaggaatagaagaagaagg1740

tggagagagagacagagacagatccattcgattagtgaacggatctcgacggtatcgata1800

agcttgggagttccgcgttacataacttacggtaaatggcccgcctggctgaccgcccaa1860

cgacccccgcccattgacgtcaataatgacgtatgttcccatagtaacgccaatagggac1920

tttccattgacgtcaatgggtggagtatttacggtaaactgcccacttggcagtacatca1980

agtgtatcatatgccaagtacgccccctattgacgtcaatgacggtaaatggcccgcctg2040

gcattatgcccagtacatgaccttatgggactttcctacttggcagtacatctacgtatt2100

agtcatcgctattaccatggtgatgcggttttggcagtacatcaatgggcgtggatagcg2160

gtttgactcacggggatttccaagtctccaccccattgacgtcaatgggagtttgttttg2220

gcaccaaaatcaacgggactttccaaaatgtcgtaacaactccgccccattgacgcaaat2280

gggcggtaggcgtgtacggtgggaggtctatataagcagagctctccctatcagtgatag2340

agatctccctatcagtgatagagatcgtcgactagtggatccagtgtggtggaattctgc2400

agatatccagcacagtggcggccgctcgagtctagagggcccgcggttcgaaggtaagcc2460

tatccctaaccctctcctcggtctcgattctacgcgtaccggtcatcatcaccatcacca2520

ttgagtttaaacctgctgatcagcctcgactgtgccttctagtcgaccctgtggaatgtg2580

tgtcagttagggtgtggaaagtccccaggctccccagcaggcagaagtatgcaaagcatg2640

catctcaattagtcagcaaccaggtgtggaaagtccccaggctccccagcaggcagaagt2700

atgcaaagcatgcatctcaattagtcagcaaccatagtcccgcccctaactccgcccatc2760

ccgcccctaactccgcccagttccgcccattctccgccccatggctgactaatttttttt2820

atttatgcagaggccgaggccgcctcggcctctgagctattccagaagtagtgaggaggc2880

ttttttggaggcctaggcttttgcaaaaagcttaccatgaccgagtacaagcccacggtg2940

cgcctcgccacccgcgacgacgtccccagggccgtacgcaccctcgccgccgcgttcgcc3000

gactaccccgccacgcgccacaccgtcgatccggaccgccacatcgagcgggtcaccgag3060

ctgcaagaactcttcctcacgcgcgtcgggctcgacatcggcaaggtgtgggtcgcggac3120

gacggcgccgcggtggcggtctggaccacgccggagagcgtcgaagcgggggcggtgttc3180

gccgagatcggcccgcgcatggccgagttgagcggttcccggctggccgcgcagcaacag3240

atggaaggcctcctggcgccgcaccggcccaaggagcccgcgtggttcctggccaccgtc3300

ggcgtctcgcccgaccaccagggcaagggtctgggcagcgccgtcgtgctccccggagtg3360

gaggcggccgagcgcgccggggtgcccgccttcctggagacctccgcgccccgcaacctc3420

cccttctacgagcggctcggcttcaccgtcaccgccgacgtcgagtgcccgaaggaccgc3480

gcgacctggtgcatgacccgcaagcccggtgcctgaggtacctttaagaccaatgactta3540

caaggcagctgtagatcttagccactttttaaaagaaaaggggggactggaagggctaat3600

tcactcccaacgaagacaagatctgctttttgcttgtactgggtctctctggttagacca3660

gatctgagcctgggagctctctggctaactagggaacccactgcttaagcctcaataaag3720

cttgccttgagtgcttcaagtagtgtgtgcccgtctgttgtgtgactctggtaactagag3780

atccctcagacccttttagtcagtgtggaaaatctctagcagtagtagttcatgtcatct3840

tattattcagtatttataacttgcaaagaaatgaatatcagagagtgagaggaacttgtt3900

tattgcagcttataatggttacaaataaagcaatagcatcacaaatttcacaaataaagc3960

atttttttcactgcattctagttgtggtttgtccaaactcatcaatgtatcttatcatgt4020

ctggctctagctatcccgcccctaactccgcccatcccgcccctaactccgcccagttcc4080

gcccattctccgccccatggctgactaattttttttatttatgcagaggccgaggccgcc4140

tcggcctctgagctattccagaagtagtgaggaggcttttttggaggcctagggacgtac4200

ccaattcgccctatagtgagtcgtattacgcgcgctcactggccgtcgttttacaacgtc4260

gtgactgggaaaaccctggcgttacccaacttaatcgccttgcagcacatccccctttcg4320

ccagctggcgtaatagcgaagaggcccgcaccgatcgcccttcccaacagttgcgcagcc4380

tgaatggcgaatgggacgcgccctgtagcggcgcattaagcgcggcgggtgtggtggtta4440

cgcgcagcgtgaccgctacacttgccagcgccctagcgcccgctcctttcgctttcttcc4500

cttcctttctcgccacgttcgccggctttccccgtcaagctctaaatcgggggctccctt4560

tagggttccgatttagtgctttacggcacctcgaccccaaaaaacttgattagggtgatg4620

gttcacgtagtgggccatcgccctgatagacggtttttcgccctttgacgttggagtcca4680

cgttctttaatagtggactcttgttccaaactggaacaacactcaaccctatctcggtct4740

attcttttgatttataagggattttgccgatttcggcctattggttaaaaaatgagctga4800

tttaacaaaaatttaacgcgaattttaacaaaatattaacgcttacaatttaggtggcac4860

ttttcggggaaatgtgcgcggaacccctatttgtttatttttctaaatacattcaaatat4920

gtatccgctcatgagacaataaccctgataaatgcttcaataatattgaaaaaggaagag4980

tatgagtattcaacatttccgtgtcgcccttattcccttttttgcggcattttgccttcc5040

tgtttttgctcacccagaaacgctggtgaaagtaaaagatgctgaagatcagttgggtgc5100

acgagtgggttacatcgaactggatctcaacagcggtaagatccttgagagttttcgccc5160

cgaagaacgttttccaatgatgagcacttttaaagttctgctatgtggcgcggtattatc5220

ccgtattgacgccgggcaagagcaactcggtcgccgcatacactattctcagaatgactt5280

ggttgagtactcaccagtcacagaaaagcatcttacggatggcatgacagtaagagaatt5340

atgcagtgctgccataaccatgagtgataacactgcggccaacttacttctgacaacgat5400

cggaggaccgaaggagctaaccgcttttttgcacaacatgggggatcatgtaactcgcct5460

tgatcgttgggaaccggagctgaatgaagccataccaaacgacgagcgtgacaccacgat5520

gcctgtagcaatggcaacaacgttgcgcaaactattaactggcgaactacttactctagc5580

ttcccggcaacaattaatagactggatggaggcggataaagttgcaggaccacttctgcg5640

ctcggcccttccggctggctggtttattgctgataaatctggagccggtgagcgtgggtc5700

tcgcggtatcattgcagcactggggccagatggtaagccctcccgtatcgtagttatcta5760

cacgacggggagtcaggcaactatggatgaacgaaatagacagatcgctgagataggtgc5820

ctcactgattaagcattggtaactgtcagaccaagtttactcatatatactttagattga5880

tttaaaacttcatttttaatttaaaaggatctaggtgaagatcctttttgataatctcat5940

gaccaaaatcccttaacgtgagttttcgttccactgagcgtcagaccccgtagaaaagat6000

caaaggatcttcttgagatcctttttttctgcgcgtaatctgctgcttgcaaacaaaaaa6060

accaccgctaccagcggtggtttgtttgccggatcaagagctaccaactctttttccgaa6120

ggtaactggcttcagcagagcgcagataccaaatactgttcttctagtgtagccgtagtt6180

aggccaccacttcaagaactctgtagcaccgcctacatacctcgctctgctaatcctgtt6240

accagtggctgctgccagtggcgataagtcgtgtcttaccgggttggactcaagacgata6300

gttaccggataaggcgcagcggtcgggctgaacggggggttcgtgcacacagcccagctt6360

ggagcgaacgacctacaccgaactgagatacctacagcgtgagctatgagaaagcgccac6420

gcttcccgaagggagaaaggcggacaggtatccggtaagcggcagggtcggaacaggaga6480

gcgcacgagggagcttccagggggaaacgcctggtatctttatagtcctgtcgggtttcg6540

ccacctctgacttgagcgtcgatttttgtgatgctcgtcaggggggcggagcctatggaa6600

aaacgccagcaacgcggcctttttacggttcctggccttttgctggccttttgctcacat6660

gttctttcctgcgttatcccctgattctgtggataaccgtattaccgcctttgagtgagc6720

tgataccgctcgccgcagccgaacgaccgagcgcagcgagtcagtgagcgaggaagcgga6780

agagcgcccaatacgcaaaccgcctctccccgcgcgttggccgattcattaatgcagctg6840

gcacgacaggtttcccgactggaaagcgggcagtgagcgcaacgcaattaatgtgagtta6900

gctcactcattaggcaccccaggctttacactttatgcttccggctcgtatgttgtgtgg6960

aattgtgagcggataacaatttcacacaggaaacagctatgaccatgattacgccaagcg7020

cgcaattaaccctcactaaagggaacaaaagctggagctgcaagctt7067

<210>3

<211>960

<212>dna

<213>homosapiens

<400>3

ggggatggtgaaagcttttagcagagctctccctatccgtgatagaagatctccctatca60

gtgatagagatcgtcgactagtggatccgccaccatggtgagcaagggcgaggagctgtt120

caccggggtggtgcccatcctggtcgagctggacggcgacgtaaacggccacaagttcag180

cgtgtccggcgagggcgagggcgatgccacctacggcaagctgaccctgaagttcatctg240

caccaccggcaagctgcccgtgccctggcccaccctcgtgaccaccctgacctacggcgt300

gcagtgcttcagccgctaccccgaccacatgaagcagcacgacttcttcaagtccgccat360

gcccgaaggctacgtccaggagcgcaccatcttcttcaaggacgacggcaactacaagac420

ccgcgccgaggtgaagttcgagggcgacaccctggtgaaccgcatcgagctgaagggcat480

cgacttcaaggaggacggcaacatcctggggcacaagctggagtacaactacaacagcca540

caacgtctatatcatggccgacaagcagaagaacggcatcaaggtgaacttcaagatccg600

ccacaacatcgaggacggcagcgtgcagctcgccgaccactaccagcagaacacccccat660

cggcgacggccccgtgctgctgcccgacaaccactacctgagcacccagtccgccctgag720

caaagaccccaacgagaagcgcgatcacatggtcctgctggagttcgtgaccgccgccgg780

gatcactctcggcatggacgagctgtacaagtccggactcagatctatgccgtcggagaa840

gaccttcaagcagcgccgcaccttcgaacaaagagtagaagatgtccgacttattcgaga900

gcagcatccaaccaaaatcccggtgataatagaacggatacaagggtgagaagcagcttc960

<210>4

<211>39

<212>dna

<213>homosapiens

<400>4

cgcggatccgccaccatggtgagcaagggcgaggagctg39

<210>5

<211>37

<212>dna

<213>homosapiens

<400>5

ccgctcgagttacactgacaatttcatcccgaacgtc37