本發(fā)明屬于基因檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一組分子信標(biāo)探針及引物對(duì)、vdr基因snps位點(diǎn)檢測(cè)方法。

背景技術(shù)：

維生素d受體(vitamindreceptor，vdr)是細(xì)胞表面結(jié)合1,25-二羥維生素d(1,25-dihyroxyvitamind，1,25(oh)2d，也叫鈣三醇，calcitriol)的受體。當(dāng)vdr與激素性質(zhì)的1,25(oh)2d結(jié)合而活化后，便進(jìn)入胞核內(nèi)，與視黃醇-x受體形成異二聚體結(jié)合到特定基因的激素反應(yīng)元件上，調(diào)節(jié)基因表達(dá)或轉(zhuǎn)錄抑制。因此，vdr也是一種核受體轉(zhuǎn)錄因子，即nr1i1(nuclearreceptorsubfamily1,groupi,member1)，其調(diào)節(jié)的基因涉及鈣磷代謝、細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖和凋亡，并進(jìn)而與骨骼健康、免疫反應(yīng)和腫瘤等過程相關(guān)。

vdr基因在人染色體上定位于12q13.11，具有500種以上的單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)和相應(yīng)基因型，其中，apa1、cdx2、ecorv、bsm1、fok1、taq1、tru9i是早期采用限制性酶切片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析發(fā)現(xiàn)的snps，并且在過去一段時(shí)間積累了大量關(guān)于它們和多種健康與疾病現(xiàn)象相關(guān)的報(bào)道。vdr的rna產(chǎn)物由9個(gè)外顯子構(gòu)成，apa1位點(diǎn)(rs7975232)位于第8號(hào)內(nèi)含子3’端，為[a/c]二態(tài)性，taq1位點(diǎn)(rs731236)位于第9號(hào)外顯子5’端，為[c/t]二態(tài)性，二者相距較近。其中，在外顯子上的taq1多態(tài)性并不改變對(duì)應(yīng)的異亮氨酸，為同義突變。但位于內(nèi)含子上的snps或位于外顯子上氨基酸不變的snps可能與mrna轉(zhuǎn)錄、剪接、密碼子翻譯效率等過程相關(guān)，因此，仍可能影響疾病風(fēng)險(xiǎn)。

對(duì)apa1和taq1多態(tài)性的分析顯示，二者與肺結(jié)核療效、高加索人骨折與銀屑病風(fēng)險(xiǎn)、胰島素抵抗、哮喘和遺傳過敏、腰椎病相關(guān)；taq1可能與男性帕金森病、漢族2型糖尿病合并脛前皮膚黑斑、骨密度、高體質(zhì)指數(shù)、系統(tǒng)性紅斑狼瘡預(yù)后等疾病風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)；apai與亞洲人的牙齦炎、我國(guó)北方和土耳其人的銀屑病、腎細(xì)胞癌和散發(fā)性前列腺癌有關(guān)。因此，對(duì)人群的這兩個(gè)snps進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)分析vdr與多種疾病風(fēng)險(xiǎn)和表型的相關(guān)性具有研究與預(yù)測(cè)價(jià)值。

雖然等位基因檢測(cè)的方法有數(shù)十種，但針對(duì)vdrapa1和taq1兩個(gè)snps的基因型分析，目前報(bào)道的方法主要是：聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)后的限制性酶切片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析(pcr-rflp)、taqman探針、高分辨率熔解曲線分析(hrm)、多重pcr結(jié)合標(biāo)簽陣列單堿基技術(shù)、時(shí)間飛行質(zhì)譜法、測(cè)序等。pcr-rflp雖然廉價(jià)，但其操作步驟繁瑣，且需要兩個(gè)獨(dú)立的rflp實(shí)驗(yàn)進(jìn)行基因分型，在分析大量樣本時(shí)，尤其費(fèi)時(shí)。以taqman探針不論混合還是單獨(dú)反應(yīng)分析這兩個(gè)snps，都需精心設(shè)計(jì)、測(cè)試多套探針，增加了試劑成本。hrm技術(shù)存在部分非典型曲線難以判斷的不足。時(shí)間飛行質(zhì)譜、測(cè)序等方法都依賴于昂貴的設(shè)備、封閉的試劑和較高的實(shí)驗(yàn)操作技術(shù)，甚至需要摸索建立適宜的檢測(cè)條件；且因其單次運(yùn)行所需試劑用量有最低要求，間歇與隨時(shí)開機(jī)運(yùn)行的成本較高。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的上述不足，提供一組分子信標(biāo)探針及引物對(duì)、vdr基因snps位點(diǎn)檢測(cè)方法，旨在解決現(xiàn)有vdr基因snps位點(diǎn)檢測(cè)步驟繁瑣、耗時(shí)、成本高的技術(shù)問題。

為實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下：

一方面，本發(fā)明提供一組用于檢測(cè)vdr基因snps位點(diǎn)的分子信標(biāo)探針，包括第一探針和第二探針，所述第一探針用于檢測(cè)vdr基因的多態(tài)性位點(diǎn)apa1，所述第二探針用于檢測(cè)vdr基因的多態(tài)性位點(diǎn)taq1；其中，所述第一探針包含第一核心序列5’-tgggc[a/c]cctcactgctca-3’，所述第二探針包含第二核心序列5’-ggatggcctc[a/g]atcagc-3’；

同時(shí)，所述第一探針和所述第二探針的長(zhǎng)度均為20-30bp，tm值均為62-65℃，所述第一探針的5’端和3’端分別用第一熒光分子和第一淬滅分子標(biāo)記，所述第二探針的5’端和3’端分別用第二熒光分子和第二淬滅分子標(biāo)記。

另一方面，本發(fā)明提供一組用于檢測(cè)vdr基因snps位點(diǎn)的分子信標(biāo)探針和引物對(duì)，所述分子信標(biāo)探針為上述分子信標(biāo)探針，所述引物對(duì)包括第一引物和第二引物，所述第一引物和所述第二引物的長(zhǎng)度均為17-25bp；且所述第一引物包含5’-gttgagt-3’，所述第二引物包含5’-ggatgtac-3’。

再一方面，本發(fā)明提供一種用于檢測(cè)vdr基因snps位點(diǎn)的試劑盒，包括上述分子信標(biāo)探針和引物對(duì)，還包括taqhs酶、dntps、pcr緩沖液。

最后，本發(fā)明提供一種vdr基因snps位點(diǎn)的檢測(cè)方法，包括如下步驟：

提取dna樣本；

將所述dna樣本與上述試劑盒配成pcr反應(yīng)體系，進(jìn)行pcr擴(kuò)增；

根據(jù)所述擴(kuò)增結(jié)果分析樣本中vdr基因snps位點(diǎn)。

本發(fā)明提供的該組分子信標(biāo)探針中，第一探針的核苷酸序列可覆蓋vdr基因的多態(tài)性位點(diǎn)apa1(rs7975232)，第二探針的核苷酸序列可覆蓋vdr基因的多態(tài)性位點(diǎn)taq1(rs731236)，這樣，僅需要qpcr儀和該兩條熒光標(biāo)記的探針，即可實(shí)現(xiàn)對(duì)大量樣本的vdr基因中該兩個(gè)重要多態(tài)性位點(diǎn)的分析，加上qpcr儀運(yùn)行成本和操作技術(shù)要求相對(duì)較低，這就大大降低了檢測(cè)成本和分析難度。

同時(shí)，設(shè)計(jì)一組與該兩條探針配套的引物對(duì)，一條(第一引物)位于apa1上游100bp范圍內(nèi)的特異性引物，另一條(第二引物)位于taq1下游100bp范圍內(nèi)的特異性引物。apa1上游100bp的適宜引物都有共同位置上7bp的片段5’-gttgagt-3’，taq1下游100bp的適宜引物都有共同位置上8bp的片段5’-ggatgtac-3’；這樣可實(shí)現(xiàn)對(duì)大量樣本的vdr基因中兩個(gè)重要多態(tài)性位點(diǎn)的分析。

該用于檢測(cè)vdr基因snps位點(diǎn)的試劑盒，因含有本發(fā)明特有的該組分子信標(biāo)探針和引物對(duì)，所以具有高效、靈敏、特異性強(qiáng)的特點(diǎn)，而且該試劑盒成本低、使用方便，僅需要qpcr儀可實(shí)現(xiàn)對(duì)大量樣本的vdr基因中兩個(gè)重要多態(tài)性位點(diǎn)的分析。

該vdr基因snps位點(diǎn)的檢測(cè)方法，因使用本發(fā)明特有的試劑盒，根據(jù)熒光信號(hào)在熔解曲線程序中出現(xiàn)的峰型判斷vdr不同的基因型。因此具有檢測(cè)步驟簡(jiǎn)單、耗時(shí)少、成本低的特點(diǎn)。

附圖說明

圖1為本發(fā)明實(shí)施例2中fam通道熒光信號(hào)原始數(shù)據(jù)圖；

圖2為本發(fā)明實(shí)施例2中fam通道熒光信號(hào)原始數(shù)據(jù)處理圖；

圖3為本發(fā)明實(shí)施例2中hex通道熒光信號(hào)原始數(shù)據(jù)圖；

圖4為本發(fā)明實(shí)施例2中hex通道熒光信號(hào)原始數(shù)據(jù)處理圖；

圖5為本發(fā)明實(shí)施例2中pcr檢測(cè)產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果圖；

其中，附圖標(biāo)記為：

1：一號(hào)樣本(多態(tài)性：a/c-t/t)；

2：二號(hào)樣本(多態(tài)性：c/c-t/t)；

3：三號(hào)樣本(多態(tài)性：a/c-c/t)；

4：四號(hào)樣本(多態(tài)性：a/a-c/t)；

5：五號(hào)樣本(多態(tài)性：a/a-t/t)；

6：六號(hào)樣本(多態(tài)性：a/a-c/c)。

具體實(shí)施方式

為了使本發(fā)明要解決的技術(shù)問題、技術(shù)方案及有益效果更加清楚明白，以下結(jié)合附圖和實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)說明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實(shí)施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。

一方面，本發(fā)明實(shí)施例提供了一組用于檢測(cè)vdr基因snps位點(diǎn)的分子信標(biāo)探針，包括第一探針和第二探針，所述第一探針用于檢測(cè)vdr基因的多態(tài)性位點(diǎn)apa1，所述第二探針用于檢測(cè)vdr基因的多態(tài)性位點(diǎn)taq1；其中，所述第一探針包含第一核心序列5’-tgggc[a/c]cctcactgctca-3’，所述第二探針包含第二核心序列5’-ggatggcctc[a/g]atcagc-3’；

同時(shí)，所述第一探針和所述第二探針的長(zhǎng)度均為20-30bp，tm值均為62-65℃，所述第一探針的5’端和3’端分別用第一熒光分子和第一淬滅分子標(biāo)記，所述第二探針的5’端和3’端分別用第二熒光分子和第二淬滅分子標(biāo)記。

本發(fā)明是基于分子信標(biāo)探針(molecularbeaconprobe)開發(fā)的一種同時(shí)檢測(cè)apa1和taq1兩個(gè)snps的熔解曲線分析技術(shù)。分子信標(biāo)探針是一種呈發(fā)夾莖環(huán)結(jié)構(gòu)的寡核苷酸探針，兩個(gè)末端標(biāo)記有熒光分子和淬滅分子，因探針兩端的核酸序列互補(bǔ)配對(duì)而使這兩個(gè)基團(tuán)緊密相鄰。熒光分子被激發(fā)后產(chǎn)生的光子被淬滅劑淬滅。定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的熔解曲線程序中，莖環(huán)結(jié)構(gòu)在加熱變性后展開呈線性，并在退火階段互補(bǔ)結(jié)合到目的序列上，使得熒光分子與淬滅分子分開，前者被激發(fā)出的熒光信號(hào)便可被qpcr儀記錄。由于dna雜交雙鏈堿基互補(bǔ)配對(duì)的密切程度(是否存在單堿基錯(cuò)配)會(huì)影響探針與目的序列雜交雙鏈的熔解溫度tm，因而snp的堿基情況便能被特定探針區(qū)分，即：探針與目的序列完全互補(bǔ)時(shí)，tm較高，隨著錯(cuò)配堿基的增多，tm會(huì)降低；對(duì)于二態(tài)性(僅有2種堿基變化)的snp位點(diǎn)，純合型二倍體為一個(gè)峰，雜合型二倍體呈現(xiàn)雙峰。本發(fā)明實(shí)施例提供的該組分子信標(biāo)探針中，第一探針的核苷酸序列可覆蓋vdr基因的多態(tài)性位點(diǎn)apa1(rs7975232)，第二探針的核苷酸序列可覆蓋vdr基因的多態(tài)性位點(diǎn)taq1(rs731236)，這樣，僅需要qpcr儀和該兩條熒光標(biāo)記的探針，即可實(shí)現(xiàn)對(duì)大量樣本的vdr基因中該兩個(gè)重要多態(tài)性位點(diǎn)的分析，加上qpcr儀運(yùn)行成本和操作技術(shù)要求相對(duì)較低，這就大大降低了檢測(cè)成本和分析難度。

具體地，本發(fā)明實(shí)施例中，該兩條探針的長(zhǎng)度為20-30bp，而“環(huán)”一般長(zhǎng)8-20個(gè)核苷酸，是與目標(biāo)序列互補(bǔ)的探針主體，tm值比qpcr的退火溫度高7-10℃，如推薦ta＝55℃，探針的tm便在62-65℃；“莖”一般長(zhǎng)5-7對(duì)核苷酸，可部分或全部由人為加入的堿基形成，cg堿基含量占75-100％，以使“莖”的tm比qpcr的ta高7-10℃，熒光分子一端不宜緊接g堿基，避免后者的熒光淬滅作用。在本發(fā)明一優(yōu)選實(shí)施例中，第一探針的核苷酸序列為seqidno:1：cttgggcccctcactgctcaag；第二探針的核苷酸序列為seqidno:2：cgcggatggcctcaatcagcgcg。該優(yōu)選的探針檢測(cè)效果最佳。

具體地，在本發(fā)明實(shí)施例中，第一熒光分子和第二熒光分子均為fam、hex、tet、vic、rox、cy5、cy3、joe、alex和cal中的任意一種，且第一熒光分子和第二熒光分子為不同的熒光分子；而第一淬滅分子和第二淬滅分子均為dab、bhq、eclipse和tamra中的任意一種。在本發(fā)明一優(yōu)選實(shí)施例中，第一熒光分子為fam，第二熒光分子為hex，第一淬滅分子和第二淬滅分子均為dab。

另一方面，本發(fā)明實(shí)施例還提供了一組用于檢測(cè)vdr基因snps位點(diǎn)的分子信標(biāo)探針和引物對(duì)，該分子信標(biāo)探針為本實(shí)施例上述分子信標(biāo)探針，而引物對(duì)包括第一引物和第二引物，該第一引物和第二引物的長(zhǎng)度均為17-25bp；且第一引物包含5’-gttgagt-3’，第二引物包含5’-ggatgtac-3’。

具體地，在本發(fā)明實(shí)施例中，第二引物與第一探針和所述第二探針在同一鏈上，且第二引物的tm值為62-65℃，第一引物的tm值為58-60℃。一優(yōu)選實(shí)施例中，第一引物為seqidno:3：gccgttgagtgtctgtgt；第二引物為seqidno:4：ggcggcagcggatgtacg。

又一方面，本發(fā)明實(shí)施例提供一種用于檢測(cè)vdr基因snps位點(diǎn)的試劑盒，包括本發(fā)明實(shí)施例的分子信標(biāo)探針和引物對(duì)，還包括taqhs酶、dntps、pcr緩沖液。該用于檢測(cè)vdr基因snps位點(diǎn)的試劑盒，因含有本發(fā)明特有的分子信標(biāo)探針和引物對(duì)，所以具有高效、靈敏、特異性強(qiáng)的特點(diǎn)，而且該試劑盒成本低、使用方便，僅需要qpcr儀可實(shí)現(xiàn)對(duì)大量樣本的vdr基因中兩個(gè)重要多態(tài)性位點(diǎn)的分析。

最后，本發(fā)明實(shí)施例提供一種vdr基因snps位點(diǎn)的檢測(cè)方法，包括如下步驟：

s01：提取dna樣本；

s02：將上述dna樣本與本發(fā)明實(shí)施例的試劑盒配成pcr反應(yīng)體系，進(jìn)行pcr擴(kuò)增；

s03：根據(jù)擴(kuò)增結(jié)果分析樣本中vdr基因snps位點(diǎn)。

該vdr基因snps位點(diǎn)的檢測(cè)方法，因使用本發(fā)明實(shí)施例特有的試劑盒，根據(jù)熒光信號(hào)在熔解曲線程序中出現(xiàn)的峰型判斷vdr不同的基因型，因此檢測(cè)步驟簡(jiǎn)單、耗時(shí)少、成本低的特點(diǎn)。

具體地，上述pcr擴(kuò)增為降落pcr擴(kuò)增。

具體地，上述dna樣本為人全血dna樣本。

本發(fā)明先后進(jìn)行過多次試驗(yàn)，現(xiàn)舉一部分試驗(yàn)結(jié)果作為參考對(duì)發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)描述，下面結(jié)合具體實(shí)施例進(jìn)行詳細(xì)說明。本說明書中的英文縮寫的全稱和中文內(nèi)容對(duì)應(yīng)如下：

1)1,25(oh)2d：1,25二羥羥維生素d，1,25-dihydroxyvitamind

2)dab：二甲氨基偶氮苯甲酰(一種熒光淬滅劑)，dabsyl

3)fam：羧基熒光素，carboxyfluorescein

4)hrm：高分辨率熔解曲線法，highresolutionmeltinganalysis

5)ncbi：美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心，nationalcenterforbiotechnologyinformation

6)pcr：聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，polymerasechainreaction

7)qpcr：定量pcr，quantitativepolymerasechainreaction

8)rflp：限制性酶切片段長(zhǎng)度多態(tài)性，restrictionfragmentlengthpolymorphism

9)snp(s)：?jiǎn)魏塑账岫鄳B(tài)性位點(diǎn)，singlenucleotidepolymorphism(s)

10)ta：退火溫度，annealingtemperature

11)tm：熔解溫度，meltingtemperature

12)vdr：維生素d受體，vitamindreceptor；斜體vdr表示其基因。

實(shí)施例1

1)獲得目標(biāo)snps基本信息

從文獻(xiàn)獲知vdrapa1的snp代碼為rs7975232、vdrtaq1的snp代碼為rs731236，從美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心(nationalcenterforbiotechnologyinformation，ncbi)網(wǎng)站的snp數(shù)據(jù)庫(kù)查詢這兩個(gè)snps位點(diǎn)信息如下：

vdrapa1，rs7975232[homosapiens]：

aaggcacaggagctctcagctgggc[a/c]cctcactgctcaatcccaccacccc；

vdrtaq1，rs731236[homosapiens]：

ctggggtgcaggacgccgcgctgat[c/t]gaggccatccaggaccgcctgtcca；

將上述兩段序列輸入nucleotideblast在線程序(database＝humanrefseqgenesequence，optimizefor＝或somewhatsimilarsequences(blastn))，與之匹配的片段位于ng_008731.1上的65003-64952(反向)和65032-65083，鏈接進(jìn)入ng_008731.1的網(wǎng)頁(yè)，獲取64952-65083兩側(cè)適度(兩個(gè)snps兩側(cè)各100bp)擴(kuò)展的dna片段(如下所示)，用于后續(xù)的引物和探針設(shè)計(jì)。從如下序列中可知，apa1和taq1二者間隔79bp，可采用一對(duì)引物擴(kuò)增同時(shí)含這兩個(gè)位點(diǎn)的dna片段，并在同一個(gè)反應(yīng)體系中采用兩種不同的熒光探針分析這兩個(gè)二態(tài)性的snps。

2)探針與引物設(shè)計(jì)

本實(shí)施例中，分子信標(biāo)探針和引物的設(shè)計(jì)總結(jié)為以下法則：

①“環(huán)”一般長(zhǎng)8-20個(gè)核苷酸，是與目標(biāo)序列互補(bǔ)的探針主體，tm值比qpcr的退火溫度高7-10℃，如推薦ta＝55℃，探針的tm便在62-65℃；

②探針上兩端距離臨近的snp應(yīng)至少有3個(gè)堿基能與目的dna片段完全互補(bǔ)(即snp不應(yīng)在靠近兩端的3個(gè)堿基范圍內(nèi))，或至少2個(gè)c或g堿基與目的dan序列互補(bǔ)，以保證待測(cè)位點(diǎn)與探針不互補(bǔ)時(shí)，探針兩端有一定的結(jié)合能力；

③“莖”一般長(zhǎng)5-7對(duì)核苷酸，可部分或全部由人為加入的堿基形成，cg堿基含量占75-100％，以使“莖”的tm比qpcr的ta高7-10℃，熒光分子一端不宜緊接g堿基，避免后者的熒光淬滅作用；

④5’末端標(biāo)記熒光分子(熒光報(bào)告基團(tuán))，3’末端標(biāo)記淬滅分子(熒光淬滅基團(tuán))；

⑤整個(gè)分子信標(biāo)探針全長(zhǎng)一般20-30個(gè)核苷酸，不能與引物形成可以引發(fā)擴(kuò)增的穩(wěn)定二聚體，且探針和引物與目的dna的互補(bǔ)結(jié)合區(qū)域沒有重疊部分；

⑥引物擴(kuò)增目的dna片段的產(chǎn)物長(zhǎng)度宜在200bp以內(nèi)，最好短于150bp；

⑦對(duì)應(yīng)于同一條dna單鏈上的引物和探針具有相近的tm值，且高于另一條引物的tm5-8℃；

⑧引物符合上述要求外，再符合其余的引物設(shè)計(jì)常規(guī)法則。

其中，⑤⑥⑦三條法則連同后文qpcr反應(yīng)體系(見后文表5)中提高探針及其互補(bǔ)鏈引物濃度(即：提高探針互補(bǔ)鏈產(chǎn)量的非對(duì)稱pcr)的策略，都有助于增強(qiáng)探針與目標(biāo)鏈結(jié)合的競(jìng)爭(zhēng)優(yōu)勢(shì)。類似地，也可根據(jù)正義鏈的互補(bǔ)dna鏈為模板設(shè)計(jì)探針。

以在線軟件ncbiprimer-blast和primer3在apa1上游100bp范圍內(nèi)搜索上游引物、在taq1下游100bp范圍內(nèi)搜索下游引物，產(chǎn)物片段長(zhǎng)200bp以內(nèi)，對(duì)引物的位置做初步檢索。以vdr的正義dna鏈為模板，代表性候選引物如表1所示。

表1

¹粗體下劃線或灰色涂抹字母代表同一引物群中，至少兩個(gè)以上的引物的共有位置上的片段。上游引物群ii的共同片段也存在于表2；下游引物群ii中的灰色涂抹部分是與表2中下游引物的共同位置片段。

根據(jù)上述信息，再以primerpremier5軟件在第一個(gè)snp上游3bp以外的97bp范圍內(nèi)設(shè)計(jì)上游引物，在第二個(gè)snp下游3bp以外的97bp范圍內(nèi)設(shè)計(jì)下游引物，引物長(zhǎng)度預(yù)設(shè)(21±4)bp，產(chǎn)物長(zhǎng)度預(yù)設(shè)100-200bp，搜索嚴(yán)格程度從“非常高(veryhigh)”開始，其余參數(shù)為默認(rèn)值，直到“中等(morderate)”才出現(xiàn)5對(duì)引物，這些引物對(duì)的信息如表2所示。

表2

¹以apa1上游100bp的堿基為1開始計(jì)算位置，后同。

²以tmutilityv1.3軟件計(jì)算的tm值，條件為：引物0.2μm、目的dna0.2μm、mg²⁺2.0mm、總dntp0.8mm。

從表1和表2可見，apa1上游和taq1下游各100bp范圍內(nèi)，均有可能出現(xiàn)適宜的引物對(duì)。結(jié)合表1、表2的信息和引物、探針設(shè)計(jì)的要求，考慮將表2中的f2和r2組成引物對(duì)，在primerpremier5中手動(dòng)調(diào)整和評(píng)估，得到的引物分別命名為vdr-f1和vdr-r1，見表3。

3)最佳探針與引物的理論篩選

由于下游引物tm為64.65℃，高于上游引物。根據(jù)上述探針與引物設(shè)計(jì)法則⑦，則探針與下游引物位于同一條鏈，即在負(fù)義鏈上設(shè)計(jì)探針，且探針與下游引物的tm接近。以primerpremier5軟件手動(dòng)選擇分別覆蓋apa1位點(diǎn)(對(duì)應(yīng)64952-65083序列中的第101位堿基)和taq1位點(diǎn)(對(duì)應(yīng)64952-65083序列中的第181位堿基)的探針。以primerexpress3.0的引物探針測(cè)試工具(primerprobetesttool)對(duì)引物對(duì)和探針進(jìn)行分析，從自身發(fā)夾(hairpin)、自身二聚體(selfdimers)和交叉二聚體(crossdimers)的形成情況濾除欠佳的組合，針對(duì)待檢的兩個(gè)位點(diǎn)，可獲得多條供選擇的探針。得到引物序列和有待二級(jí)結(jié)構(gòu)分析的探針見表3。

表3

¹下劃線或灰色涂抹的堿基是與表1、表2中上游或下游引物具有相同位置的片段，中括號(hào)內(nèi)堿基為snps。

²以tmutilityv1.3軟件計(jì)算的tm值，條件為：oligo0.2μm、目的dna0.2μm、mg²⁺2.0mm、總dntp0.8mm；探針的tm計(jì)算不含兩端手動(dòng)加入的堿基(小寫字母)。

³探針3’端連接dab熒光淬滅分子；apa1-p的5’端連接fam熒光分子，taq1-p的5’端連接hex熒光分子。探針與下游引物對(duì)應(yīng)于同一條dna鏈。

對(duì)分別覆蓋apa1和taq1的探針，在其末端加入可以形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)的適當(dāng)堿基，利用在線分析工具dnafoldingform進(jìn)行“莖環(huán)”結(jié)構(gòu)的質(zhì)量評(píng)估。在特定熔解曲線分析條件下，分子構(gòu)象合理而穩(wěn)定(自由能差值dg<0)的分子信標(biāo)探針，其預(yù)測(cè)的二級(jí)結(jié)構(gòu)主要滿足以下條件：①有正確的“莖”結(jié)構(gòu)，保證熒光分子和淬滅分子空間靠近；②不宜出現(xiàn)7對(duì)以上堿基互補(bǔ)的“莖”結(jié)構(gòu)。如不滿足上述條件，需調(diào)整探針位置或/和構(gòu)成“莖”的堿基。由于一條熒光探針的價(jià)格大約在900-1200元，因此，盡可能用軟件和多方面信息手段對(duì)其事先做比較、評(píng)價(jià)，挑選最優(yōu)的一條合成。本發(fā)明擬用熔解曲線分析的ta為40℃、na⁺50mm、mg²⁺2mm，該條件下，用dnafoldingform在線軟件分析結(jié)果，表3中分子信標(biāo)探針的合理而穩(wěn)定的二級(jí)結(jié)構(gòu)分析如下：其中小寫字母為手動(dòng)加入的堿基。

可見，表3中的探針序列符合設(shè)計(jì)要求，以該設(shè)計(jì)的探針要求探針合成公司在apa1-p的5’端連接fam熒光分子、taq1-p的5’端連接hex熒光分子，二者3’端均連接dab熒光淬滅分子。經(jīng)過上述篩選得到的引物和探針對(duì)應(yīng)于qpcr擴(kuò)增片段(185bp)的位置如下：qpcr擴(kuò)增產(chǎn)物全長(zhǎng)185bp，灰色涂抹的堿基為上游引物序列和下游引物反向互補(bǔ)序列，方框內(nèi)的堿基為探針對(duì)應(yīng)位置(互補(bǔ))，中括號(hào)內(nèi)的堿基為多態(tài)性位點(diǎn)。

此外，表1-表3中的全部引物(或其互補(bǔ)序列)和探針(或其互補(bǔ)序列)也可通過適當(dāng)組合、評(píng)估，人工增減堿基，以達(dá)到本發(fā)明的目的，這里不再一一分析、驗(yàn)證，具體地，凡是具有表3中相同性能的引物和探針都在本發(fā)明保護(hù)范圍內(nèi)。

實(shí)施例2

1)dna樣本制備：根據(jù)全血dna提取試劑盒(如北京天根生物技術(shù)有限公司的全血dna提取試劑盒，貨號(hào)dp318-03)的操作說明提取待檢測(cè)的dna樣本，用微量分光光度計(jì)(如ge公司的nanovueplus)檢測(cè)樣本在280nm和260nm波長(zhǎng)下的比值和由此吸光度值計(jì)算的dna濃度。

2)qpcr實(shí)驗(yàn)測(cè)試引物和探針：按表4中的qpcr成分配制反應(yīng)試劑，并按表5中的qpcr反應(yīng)程序進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)。三個(gè)推薦策略是：①熱啟動(dòng)dna聚合酶，確保引物、探針分別與互補(bǔ)鏈雜交的特異性；②非對(duì)稱產(chǎn)物擴(kuò)增，提高一側(cè)引物濃度以提高分子信標(biāo)探針互補(bǔ)鏈的產(chǎn)量。③降落pcr(touch-down)程序提高擴(kuò)增的特異性。

本實(shí)驗(yàn)的qpcr儀為roche480ii，用該儀器同時(shí)檢測(cè)apa1和taq1組成的6種基因型(具體見表6的六個(gè)樣本，實(shí)際情況不限于在此舉例的6種組合)，檢測(cè)apa1位點(diǎn)的第一探針熒光信號(hào)檢測(cè)波長(zhǎng)為465-510nm(fam通道)，檢測(cè)taq1位點(diǎn)的第二探針熒光信號(hào)檢測(cè)波長(zhǎng)為533-580nm(hex通道)，檢測(cè)結(jié)果如圖1-圖4所示。圖1為本實(shí)施例中fam通道熒光信號(hào)原始數(shù)據(jù)圖；圖2為本實(shí)施例中fam通道熒光信號(hào)原始數(shù)據(jù)處理圖；圖3為本實(shí)施例中hex通道熒光信號(hào)原始數(shù)據(jù)圖；圖4為本實(shí)施例中hex通道熒光信號(hào)原始數(shù)據(jù)處理圖，圖中6個(gè)標(biāo)號(hào)分別對(duì)應(yīng)六個(gè)不同樣本檢測(cè)到的熒光信號(hào)曲線。

從圖1-圖4可知，本實(shí)施例的vdr基因snps位點(diǎn)檢測(cè)方法，只需要根據(jù)熒光信號(hào)在熔解曲線程序中出現(xiàn)的峰型，即可判斷vdr的基因型是哪一種。對(duì)圖1和圖2檢測(cè)的apa1位點(diǎn)，一、三號(hào)樣本為a/c型，二號(hào)樣本為c/c型，四、五、六號(hào)樣本為a/a型；對(duì)圖3和圖4檢測(cè)的taq1位點(diǎn)，一、二、五號(hào)樣本為t/t型，三、四號(hào)樣本為c/t型，六號(hào)樣本為c/c型，結(jié)果見表6。因此，整個(gè)檢測(cè)過程步驟簡(jiǎn)單、耗時(shí)少、成本低，在臨床與預(yù)防醫(yī)學(xué)的分子流行病學(xué)相關(guān)工作中非常實(shí)用。

表4

¹taq熱啟動(dòng)酶(takarataq^tmhotstartversion)試劑盒，貨號(hào)r007a，takara(大連)公司，含：takarataqhs酶、10×pcrbuffer(mg²⁺plus)和dntpmixture(各2.5mm)。

²分子信標(biāo)探針與下游引物對(duì)應(yīng)于同一條dna鏈上，分子信標(biāo)探針濃度和上游引物的用量高于下游引物，確保在與上游引物pcr產(chǎn)物互補(bǔ)結(jié)合過程中，探針比下游引物pcr產(chǎn)物更具競(jìng)爭(zhēng)優(yōu)勢(shì)，從而使探針互補(bǔ)的dna鏈有較高的產(chǎn)量，并能在qpcr儀的檢測(cè)結(jié)果中呈現(xiàn)出與各種基因型一一對(duì)應(yīng)的熒光信號(hào)峰型。

表5

¹表中各中文名詞對(duì)應(yīng)于roche480iiqpcr操作軟件的英文依次如下：程序名稱(programname)；分析模式(analysismode)；循環(huán)數(shù)(cycles)；目標(biāo)溫度(target)；時(shí)間(hold)；斜率(ramprate)；第二目標(biāo)溫度(sectarget)；步長(zhǎng)(stepsize)；信號(hào)采集次數(shù)(acquisitions)；采集模式(acquisitionmode)；預(yù)變性(pre-incubation)；無(wú)(none)；降落pcr(touch-down)；擴(kuò)增(amplification)；定量(quantification)；單次(single)；熔解曲線(meltingcurve)；連續(xù)(continuous)；冷卻(cooling)。

²儀器設(shè)置：檢測(cè)模式(detectionformat)為多色探針(multicolorhydro-probe)；定制(customize)：熒光(fluos,465-510和533-580)；模塊規(guī)格(blocksize)：96孔；反應(yīng)體積(reactionvolume)：25μl。

³表格中的“—”表示無(wú)需設(shè)置。

⁴連續(xù)監(jiān)測(cè)40-80℃升溫區(qū)間的熒光信號(hào)，分子信標(biāo)探針從發(fā)夾結(jié)構(gòu)打開，并結(jié)合到互補(bǔ)dna鏈上，熒光信號(hào)達(dá)到最大值。隨著溫度升高，有錯(cuò)配的探針-dna雜交鏈會(huì)在較低溫度下解鏈，形成熔解曲線峰值；而匹配程度高的探針-dna雜交鏈會(huì)在較高溫度下解鏈。

表6

3)將上述六個(gè)樣本pcr產(chǎn)物送往商業(yè)服務(wù)公司進(jìn)行測(cè)序，以驗(yàn)證分子信標(biāo)qpcr的分型結(jié)果。6種基因型的樣本各3個(gè)測(cè)序的結(jié)果與本發(fā)明技術(shù)分析的結(jié)果一致。圖5將6種基因型的結(jié)果各列舉了一例：圖中指示apa1位點(diǎn)(a/c)的互補(bǔ)堿基，即t/t、g/g或t/g，指示taq1位點(diǎn)(c/t)，即c/c、t/t或c/t。根據(jù)測(cè)序結(jié)果直觀判斷這六個(gè)樣本apa1和taq1兩個(gè)snps組合的基因型，其結(jié)果與本技術(shù)發(fā)明所獲得圖1-圖4結(jié)果的判斷一致，即同為表6所總結(jié)的基因型。

在研究vdr基因與人群多種慢性病的關(guān)系時(shí)，分析其apa1(rs7975232)和taq1(rs731236)的基因型是一項(xiàng)重要內(nèi)容。利用本發(fā)明實(shí)施例的方法，我們?cè)治隽松钲谑心橙巳?369名志愿者的這兩個(gè)snps進(jìn)行了分析，這兩個(gè)snps基因型分布的hardy-weinberg平衡檢驗(yàn)證實(shí)樣本具有良好代表性。表7列舉了現(xiàn)有文獻(xiàn)中報(bào)道的我國(guó)人群和印度人、英國(guó)人中vdrapa1、taq1兩個(gè)snps的基因型頻率，以及我們應(yīng)用本實(shí)施例檢測(cè)到的基因型頻率。結(jié)果顯示：本發(fā)明實(shí)施例檢測(cè)到的結(jié)果與此前我國(guó)人群對(duì)照組的研究數(shù)據(jù)一致(p>0.05)，并顯著不同于其他人種的情況(p<0.05)，說明本技術(shù)在應(yīng)用上有效。

表7

¹apa1與同一文獻(xiàn)中的對(duì)照組比較，p<0.05。

²taq1與同一文獻(xiàn)中的對(duì)照組比較，p<0.05。

以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)所作的任何修改、等同替換和改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。

sequencelisting

<110>深圳市慢性病防治中心

<120>分子信標(biāo)探針及引物對(duì)、vdr基因snps位點(diǎn)檢測(cè)方法

<160>4

<170>patentinversion3.3

<210>1

<211>22

<212>dna

<213>人工合成

<400>1

cttgggcccctcactgctcaag22

<210>2

<211>23

<212>dna

<213>人工合成

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<211>18

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<213>人工合成

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<212>dna

<213>人工合成

<400>4

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