技術(shù)領(lǐng)域：

本發(fā)明屬于水產(chǎn)養(yǎng)殖技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種雜交海馬及其親本的鑒定引物和鑒定方法。

背景技術(shù)：
：

海馬(hippocampus)隸屬于海龍科，海馬屬(synagnathidae：hippocampus)，是國家二級保護動物，國際瀕危動物保護組織特定保護魚類(cites,2004)，廣泛分布于熱帶或亞熱帶的淺海海域，具有極高的經(jīng)濟價值，在我國素有南方人參之稱。在全球范圍內(nèi)，海馬資源分布不均，但主要分布在熱帶或亞熱帶的淺海中，如澳大利亞和新西蘭附近海域、東南亞海域和美洲東部沿海等都是重要的海馬棲息地。在已經(jīng)報道的33種海馬中，東南亞海域已經(jīng)發(fā)現(xiàn)27種；馬來西亞、印度尼西亞群島、菲律賓以及中國的南沙群島非常可能是目前國際海馬種類最多、數(shù)量最大的海域；而該海域由于季風(fēng)、洋流等自然條件復(fù)雜，海馬的種類鑒定及其系統(tǒng)進化一直是系統(tǒng)分類中的難題。

目前，海馬資源的最大威脅來自于傳統(tǒng)中藥的沖擊，由于過度捕撈和沿海海域污染等原因，野生海馬資源瀕臨枯竭。海馬養(yǎng)殖業(yè)的興起在一定程度上緩解了對野生海馬資源的捕撈壓力。海馬種間親緣關(guān)系較近，容易出現(xiàn)雜交現(xiàn)象。由于雜交海馬容易建立品系更為優(yōu)良的海馬，種間雜交的方法已被廣泛的應(yīng)用。

但由于雜交海馬通常同時具有兩種親本的形態(tài)特征，非常容易造成混淆，單純從形態(tài)上鑒定雜交海馬極其困難，因此本應(yīng)用通過借助分子檢測手段解決雜交海馬的鑒定問題。

技術(shù)實現(xiàn)要素：
：

本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)中的缺陷，提供一種雜交海馬及其親本的鑒定引物和鑒定方法。

本發(fā)明的第一個目的是提供一種雜交海馬及其親本的鑒定引物，所述的鑒定引物如下所示：

針對海馬核基因rag1：

rag1f：5’-gaagcggaccacgagtcact-3’(如seqidno.1所示)；

rag1r：5’-acagtttgttcgccgactcg-3’(如seqidno.2所示)；

針對海馬線粒體基因cytb：

cytbf：5’-ctacctgcaccatcaaacatctc-3’(如seqidno.3所示)；

cytbr：5’-cgaaaggtaagtcctcgttg-3’(如seqidno.4所示)。

本發(fā)明的第二個目的是提供一種雜交海馬及其親本的鑒定方法，包括以下步驟：

1)提取待測海馬的基因組dna為模板，利用上述的針對海馬核基因rag1的鑒定引物rag1f和rag1r進行pcr擴增；

2)將步驟1)擴增得到的pcr產(chǎn)物進行測序，若所得序列中無單核苷酸雜合位點，則可斷定待測海馬為純種的海馬個體；若所得序列中存在單核苷酸雜合位點，將pcr產(chǎn)物進行純化，將純化后的pcr產(chǎn)物連接到載體中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，挑取陽性克隆子進行測序，獲得兩種海馬核基因rag1等位基因的序列；

4)分別將步驟2)獲得的兩種海馬核基因rag1的等位基因序列在ncbi數(shù)據(jù)庫上進行同源性比對，若兩種海馬核基因rag1的等位基因序列與同一種海馬的同源性最高，則該待測海馬為純種的海馬個體；若兩種海馬核基因rag1的等位基因序列分別與兩種海馬的同源性最高，則該待測海馬為這兩種海馬的雜交個體；

5)當(dāng)待測海馬為雜交海馬時，以步驟1)提取的基因組dna為模板，利用上述的針對海馬線粒體基因cytb的鑒定引物cytbf和cytbr進行pcr擴增，將擴增得到的pcr產(chǎn)物進行測序，獲得該雜交海馬線粒體基因cytb的基因序列；

6)將步驟5)所得到線粒體基因cytb的基因序列在ncbi數(shù)據(jù)庫上進行同源性比對，與其同源性最高的海馬種類則為該雜交海馬的母本，推斷另一種海馬則為該雜交海馬的父本。

步驟1)和5)所述的pcr擴增，其反應(yīng)體系均優(yōu)選為：25μl，包括基因組dna50ng，10×pcr緩沖液2.5μl，25mmmgcl22μl，5u/μltaqdna聚合酶0.2μl，10mmdntps0.5μl，10μm正反向引物各0.5μl，余量為ddh2o。

步驟1)所述的pcr擴增，其反應(yīng)條件優(yōu)選為：94℃預(yù)變性4min；94℃變性20s，52℃退火20s，72℃延伸1min，35個循環(huán)；72℃延伸10min，最后12℃保存。

步驟5)所述的pcr擴增，其反應(yīng)條件優(yōu)選為：94℃預(yù)變性4min；94℃變性20s，55℃退火20s，72℃延伸1min，35個循環(huán)；72℃延伸10min，最后12℃保存。

本發(fā)明的第三個目的是提供上述的雜交海馬及其親本的鑒定引物在鑒定雜交海馬及其親本中的應(yīng)用。

核基因重組激活基因1(rag1)為單拷貝基因，包含著父母本的遺傳信息，可作為雜交物種鑒定的檢測基因，而線粒體細(xì)胞色素b(cytb)基因為母系遺傳基因，只含有母本的信息。因此，本發(fā)明結(jié)合海馬核基因rag1和線粒體基因cytb，設(shè)計并合成這兩個基因的通用引物，并借助ncbi中nr庫收錄的海馬相關(guān)序列的信息，建立了雜交海馬及其親本的鑒定方法，可快速、準(zhǔn)確鑒定雜交海馬及其父母本來源，從而為海馬的選育及開發(fā)利用提供參考依據(jù)。

附圖說明：

圖1是待測海馬rag1-1序列在ncbi中blastn的比對結(jié)果。

圖2是待測海馬rag1-2序列在ncbi中blastn的比對結(jié)果。

圖3是待測海馬cytb序列在ncbi中blastn的比對結(jié)果。

具體實施方式：

以下實施例是對本發(fā)明的進一步說明，而不是對本發(fā)明的限制。

實施例1：

1)選取深圳大鵬養(yǎng)殖場上的線紋海馬和吻海馬的雜交海馬，使用天根生物公司的海洋動物提取試劑盒提取基因組dna；

2)設(shè)計并合成海馬核基因rag1的通用引物，引物序列如下：

rag1f：5’-gaagcggaccacgagtcact-3’(如seqidno.1所示)；

rag1r：5’-acagtttgttcgccgactcg-3’(如seqidno.2所示)。

3)以步驟1)提取的基因組dna為模板，利用步驟2)的海馬核基因rag1的通用引物rag1f和rag1r進行pcr擴增。pcr擴增的反應(yīng)體系為：25μl，包括基因組dna50ng，10×pcr緩沖液2.5μl，25mmmgcl22μl，5u/μltaqdna聚合酶0.2μl，10mmdntps0.5μl，10μm正反向引物各0.5μl，余量為ddh2o。反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性4min；94℃變性20s，52℃退火20s，72℃延伸1min，35個循環(huán)；72℃延伸10min，最后12℃保存。擴增得到目的大小為919bp的pcr產(chǎn)物。

4)將步驟3)所得的pcr產(chǎn)物用步驟2)的海馬核基因rag1的通用引物直接測序，通過峰圖發(fā)現(xiàn)測序結(jié)果為雙峰，即所得序列中存在單核苷酸雜合位點，將pcr產(chǎn)物利用膠回收試劑盒純化，然后連接到pgem-t載體中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌dh5α感受態(tài)細(xì)胞，挑選陽性克隆子進行測序，獲得兩種海馬核基因rag1等位基因的序列，分別命名為rag1-1(如seqidno.5所示)和rag1-2(如seqidno.6所示)。

5)分別將步驟4)獲得的兩種海馬核基因rag1等位基因的序列登陸到ncbi網(wǎng)站進行blastn比對，發(fā)現(xiàn)rag1-1序列與線紋海馬(h.erectus)同源性最高(99％)，區(qū)別位點僅僅是上游引物一堿基不匹配導(dǎo)致的(圖1)，而rag1-2序列與吻海馬(h.reidi)同源性最高(99％)，區(qū)別位點僅僅是上游引物一堿基不匹配導(dǎo)致的(圖2)，因此證實該海馬為線紋海馬與吻海馬的雜交個體。

6)由于線粒體基因為母系遺傳，因此，可通過海馬的線粒體細(xì)胞色素b(cytb)基因的序列，判斷此雜交海馬的母本。進而設(shè)計并合成海馬線粒體基因cytb的通用引物，引物序列如下：

cytbf：5’-ctacctgcaccatcaaacatctc-3’(如seqidno.3所示)；

cytbr：5’-cgaaaggtaagtcctcgttg-3’(如seqidno.4所示)。

7)以步驟1)所得的基因組dna為模板，使用步驟6)的海馬線粒體基因cytb的通用引物cytbf和cytbr進行pcr擴增。pcr擴增的反應(yīng)體系為：25μl，包括基因組dna50ng，10×pcr緩沖液2.5μl，25mmmgcl22μl，5u/μltaqdna聚合酶0.2μl，10mmdntps0.5μl，10μm正反向引物各0.5μl，余量為ddh2o。反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性4min；94℃變性20s，55℃退火20s，72℃延伸1min，35個循環(huán)；72℃延伸10min，最后12℃保存。擴增得到目的大小為893bp的pcr產(chǎn)物，將pcr產(chǎn)物直接測序，獲得該雜交海馬線粒體基因cytb的基因序列(如seqidno.7所示)。

8)將步驟7)獲得的雜交海馬線粒體基因cytb的基因序列登陸到ncbi網(wǎng)站中blanstn比對，發(fā)現(xiàn)該序列與吻海馬(h.reidi)同源性最高(100％)(圖3)，因此該雜交海馬的母本為吻海馬，從而推斷其父本為線紋海馬。鑒定結(jié)果與已知結(jié)果一致。

實施例2：

以純種的線紋海馬為待測海馬，提取該純種的線紋海馬的基因組dna為模板，利用實施例1步驟2)的海馬核基因rag1的通用引物rag1f和rag1r進行pcr擴增，pcr擴增的反應(yīng)體系和反應(yīng)條件與實施例1步驟3)相同。對擴增得到的pcr產(chǎn)物直接測序，分析測序的峰圖，發(fā)現(xiàn)所得的測序序列的峰圖為單峰，即所得序列中無單核苷酸雜合位點，則可判定該待測海馬為純種的海馬個體。將獲得的序列登陸到ncbi網(wǎng)站進行blastn比對，發(fā)現(xiàn)該序列與線紋海馬(h.erectus)同源性最高(99％)，區(qū)別位點僅僅是上游引物一堿基不匹配導(dǎo)致的，判斷為純種的線紋海馬個體。鑒定結(jié)果與已知結(jié)果一致。

序列表

<110>中國科學(xué)院南海海洋研究所

<120>一種雜交海馬及其親本的鑒定引物和鑒定方法

<160>7

<210>1

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>1

gaagcggaccacgagtcact20

<210>2

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>2

acagtttgttcgccgactcg20

<210>3

<211>23

<212>dna

<213>人工序列

<400>3

ctacctgcaccatcaaacatctc23

<210>4

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>4

cgaaaggtaagtcctcgttg20

<210>5

<211>919

<212>dna

<213>線紋海馬（h.erectus）

<400>5

gaagcggaccacgagtcactcacagctgtcttggcgcccatggtcgccgagcgtaacgcg60

atgaaggagagcaggcttatcctgtccatagctggcctgcctcgatctttccgcttccac120

tttagagggtcgggatacgatgaaaagacggtacgtgaatttgagggcttggaagcctcc180

ggatccacttacgtctgcacactgtgtgattccagtcgagtggaggcctctaaaaatatg240

gtgctccactccgtcacacgcagtcatgaggagaacctggcacgttatgaaatctggcga300

accaacccattttctgagtcagtagaggaactgcgggacagagtcaaaggggtctctacc360

aagcccttcatagagacccattccacaattgatgcattgcattgtgagattggaaatgcc420

accgagttctacaaaattttccaggacgaaataggggaggtgtaccgaaaggaaaacccc480

agccgggaggaacgacgcagctggcgggcagccctagataaagaactgaggcataagctg540

aagctcaaacctgtgatgaggatgaatggcaactacgcccgtaagctaatgacccttgag600

gcggtgcaagtggtgtgtgagctggtcccctcggaggagaggagggaggccctgaggaag660

ctgatgaggttataccttcagatgaagcctgtgtggcgctccacctgcccagccaaggag720

tgtcctgaccaactttgctgctactcctttaactcccagagtttcgctgacctaatctcc780

actaccttcaaataccgctacaaaggtaaaataaccaactacctgcacaagaccctggcc840

cacgtccccgaaataatagagcgagatggatctatcggtgcctgggccagtgaggggaac900

gagtcggcgaacaaactgt919

<210>6

<211>919

<212>dna

<213>吻海馬（h.reidi）

<400>6

gaagcggaccacgagtcactcacagctgtcttggcgcccatggtcgcagagcgtaacgca60

ataaaggagagcaggcttatcctgtccatagctggcctgcctcgatctttccgcttccac120

tttagagggtcgggatacgatgaaaagatggtacgcgaatttgagggcttggaagcctca180

ggatccacttacgtctgcacactgtgtgattccagtcgagtggaggcctctaaaaatatg240

gtgctccactccgtcacacgcagtcatgatgagaacctggcacgttatgaaatctggcga300

accaacccattttctgagtctgtagaggaactgcgggacagagtcaaaggggtctctacc360

aagcccttcatagagacccattccacacttgatgcgttgcactgtgagattggaaatgcc420

accgaattctacaaaattttccaggacgaaattggggaggtgtaccgaaaggaaaatccc480

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gcagtgcaagtggtgtgtgagctggtcccctcggaggagaggagggaggccctgagggag660

ctgatgaggctgtaccttcagatgaagcctgtgtggcgctccacctgtccagccaaggag720

tgtcctgaccaactttgccgctactcctttaactcccagagtttcgctgacctaatctcc780

actaccttcaaataccgctacaaaggtaaaataaccaactacctgcacaagaccctggcc840

cacgtccccgaaataatagagcgagatggatctatcggtgcctgggccagtgaggggaac900

gagtcggcgaacaaactgt919

<210>7

<211>893

<212>dna

<213>吻海馬（h.reidi）

<400>7

ctacctgcaccatcaaacatctctgtatgatgaaacttcggatccttactaggattatgc60

ttaattgcccaaatccttacaggattatttctagcaatacactatacctcagatattgca120

accgcattctcttcagtaacacatatttgccgggacgtaaattacggttgactaattcgc180

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