引用的相關(guān)申請根據(jù)35u.s.c.§119(e)，本申請要求2009年11月13日提交的美國臨時專利申請第61/261,278號；2010年1月4日提交的美國臨時專利申請第61/292,056號；及2010年8月26日提交的美國臨時專利申請第61/377,382號的權(quán)益，在此通過引用將每一臨時申請全文并入。關(guān)于序列表的聲明以代替紙件形式的純文本格式提供與本申請相關(guān)的序列表，并通過引用并入本說明書。含有所述序列表的該文本文件的名稱是120178_456pc_sequence_listing.txt。該文本文件的大小為33kb，其創(chuàng)建于2010年11月11日，并經(jīng)由efs-web與提交說明書的同時提交。發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及用于治療流感病毒感染的反義寡核苷酸和利用寡核苷酸的抗病毒治療方法。發(fā)明背景縱觀人類歷史，流感病毒是導(dǎo)致人類死亡率和發(fā)病率的一個主要原因。在世界范圍內(nèi)，甲型流感病毒感染每年引起數(shù)以百萬計的嚴(yán)重病例，導(dǎo)致多達(dá)500,000人喪生。流行性傳染病在嚴(yán)重程度方面變化很大但每隔一定時間就會發(fā)生并且總會導(dǎo)致顯著的死亡率和發(fā)病率，最頻繁地發(fā)生在老年人群中。盡管針對匹配的流行性感冒病毒株的疫苗可以預(yù)防60-80％的健康成年人中的疾病，但是保護(hù)率在高危人群中要低得多。而且，疫苗接種并不提供針對非預(yù)期病毒株的保護(hù)，諸如1997年在香港以及2003年和2004年在歐洲與東南亞爆發(fā)的h5和h7禽流感。目前的抗流感病毒藥物在它們提供保護(hù)及治療效果方面的能力是有限的(coxandsubbarao1999；coxandsubbarao2000)。甲型流感病毒為負(fù)極性的節(jié)段rna病毒。通過4個蛋白的復(fù)合體復(fù)制基因組節(jié)段：3個聚合酶多肽(pa、pb1和pb2)和np(核蛋白)。所有8個基因組節(jié)段的5’和3’末端的序列區(qū)域在一個基因型內(nèi)是高度保守的(straussandstrauss2002)。根據(jù)它們表面糖蛋白的抗原和遺傳特性，可將甲型流感病毒分型。迄今已經(jīng)鑒定了15個紅細(xì)胞凝集素(ha)與9個神經(jīng)氨酸苷酶(na)亞型。已經(jīng)從禽類宿主分離出了衍生所有已知的ha與na亞型的病毒，但是只有hlnl(1918)、h2n2(1957/58)以及h3n2(1968)亞型與人類中廣泛傳播的流行性傳染病相關(guān)(straussandstrauss2002)。自從1997年以來，當(dāng)時h5n1流感病毒傳播至人類并且殺死了18個感染者中的6個人，已經(jīng)有多重的禽流感病毒傳播至哺乳動物。直接傳播全部的病毒或通過哺乳動物株獲得來自于禽流感病毒的基因節(jié)段。在亞洲禽類h5n1病毒廣泛傳播的感染已引起了日益增加的關(guān)注：該亞型可實(shí)現(xiàn)人-人的傳播并且建立了種間傳播。通過病毒糖蛋白的不同形式(ha,na)確定不同類型的流感病毒能夠感染的物種。這提供了鳥類與人類間相當(dāng)大的不易克服的物種屏障。然而，豬卻提供了“混合罐”-能夠被這兩種類型的病毒所感染并因此而允許禽類病毒-人類的傳代。當(dāng)個體的豬細(xì)胞與禽類和人類的流感病毒共感染時，可以出現(xiàn)攜帶禽類ha基因型但是易于感染人類的重組形式。禽類ha可以感染豬但是不感染人類。在豬中，基因組節(jié)段包裝期間，創(chuàng)建帶有幾個禽類節(jié)段與人類ha和/或na節(jié)段的病毒是可能的(coxandsubbarao2000)。流感病毒感染人類和動物(例如豬、鳥、馬)而且可能引起急性呼吸性疾病。已經(jīng)有很多的生產(chǎn)有效針對流感病毒的疫苗的嘗試，然而沒有任何一個是完全成功的，尤其是在長期基礎(chǔ)上。這可能是由于，至少部分地，流感病毒基因組的節(jié)段的特征，其使得通過節(jié)段的再分配而有許多形式的存在是可能的。例如，已經(jīng)提出了存在著rna節(jié)段在動物與人類流感病毒間的相互交換，這可以導(dǎo)致在這兩種群體中引入新的抗原亞型。因此，由于新的亞型的出現(xiàn)(抗原“轉(zhuǎn)移”)，長期的疫苗接種方法就失敗了。此外，病毒的表面蛋白，紅細(xì)胞血凝素與神經(jīng)氨酸苷酶，不斷地經(jīng)歷較小的抗原變化(抗原“轉(zhuǎn)移”)。這種高程度的變異解釋了為什么針對特別的流感病毒所發(fā)展的的特異性免疫不能針對新的變體建立保護(hù)。因此，需要可選擇的抗病毒策略。盡管乙型和丙型流感病毒引起的臨床疾病比甲型流感病毒所引起的少，但是新的抗病毒藥物也應(yīng)該有益于抑制由這些因子所引起的感染。天然地發(fā)生在鳥類中的流感病毒被叫做禽流感(鳥流感)。鳥類在它們的腸道中攜帶病毒但通常不會被感染致病。然而，遷徙的鳥類可以攜帶鳥流感以感染馴養(yǎng)的雞、鴨和火雞，引起疾病甚至死亡。禽流感輕易不感染人類但是當(dāng)人類暴露非常頻繁時，諸如接觸馴養(yǎng)的鳥類，人類感染就會發(fā)生。1961年在南非的燕鷗中首先鑒定出危險的鳥流感(h5n1)并且鑒定為潛在地致死的流感形式。2003年下半年和2004年，八個亞洲國家發(fā)生了h5n1的爆發(fā)。這些國家在那段時間內(nèi)超過100,000,000只鳥類死亡或者被捕殺以便控制爆發(fā)。亞洲報道了開始于2004年6月的新的致死的h5n1的爆發(fā)，其目前正在進(jìn)行中。已在泰國、越南和柬埔寨觀察到約50％死亡率的人類h5n1感染。這些感染主要發(fā)生在接觸感染的家禽的人身上，但是有少數(shù)的h5n1人-人傳播的病例發(fā)生。自從1998年以來，三元重組株甲型流感病毒(h1)與來源于豬(ha、np、na、m以及ns)、人類(pb1)以及鳥類(pb2和pa)的節(jié)段一起在傳播。最近所述的新的豬起源的，是正在進(jìn)行中的國際性疾病爆發(fā)原因的甲型流感(2009h1n1)病毒(s-oiv)為三元重組株病毒，其包括已與歐亞的豬流感病毒的神經(jīng)氨酸苷酶(na)和基質(zhì)(m)節(jié)段重組的該早已存在的病毒的基因成分(s-oiv調(diào)查組,2009)。以前的甲型流感病毒(hi)三元重組株病毒偶爾傳播至人類但是沒有有效地在人-人間傳播，但是新的s-oiv可非常高效地在人-人間傳播。最近29個國家報道了3440個實(shí)驗(yàn)室確認(rèn)的s-oiv感染病例。疫情爆發(fā)開始于墨西哥，該國記載了總計1364個病例，導(dǎo)致了45例死亡(3.3％病例-致死率)。墨西哥以外，只報道了有3例死亡(0.1％病例-致死率)。此時并不清楚這種死亡率在地理位置上不平衡的原因。雖然目前的s-oiv對神經(jīng)氨酸苷酶抑制劑奧司地韋(oseltamivir)和扎那米韋(zanamivir)敏感，卻早已記載了季節(jié)性流感病毒進(jìn)化為賦予耐神經(jīng)氨酸苷酶抑制劑的變異。s-oiv將取代人類hi成為季節(jié)性流感病毒或s-oiv將與另一種病毒株重組以產(chǎn)生另一種新的變體？它將進(jìn)化變得更致命？從新病毒的鑒定到新疫苗的生產(chǎn)和配送的時間間隔將這些不確定性混合起來。而且，足夠的新病毒血凝素抗原可使大劑量免疫原和加強(qiáng)免疫方案的使用成為必要，這造成了必須迅速地引起保護(hù)性免疫的大規(guī)模預(yù)防接種的實(shí)際困難。鑒于這些考慮，存在著對創(chuàng)造新形式的預(yù)防和治療的迫切需求，尤其是對于s-oiv，理想地是帶有廣泛的抗各種流感病毒株、亞型以及類型的活性。存在對新形式的甲型流感治療的迫切需求,這是由于(a)已知的該病毒經(jīng)受連續(xù)的低水平抗原漂移及低頻率但是不可預(yù)知的導(dǎo)致大流行性疾病的主要抗原漂移的傾向，(b)疫苗接種的明顯失敗，即使當(dāng)病毒株適度匹配以預(yù)防相當(dāng)大比例的疫苗接受者的流感相關(guān)疾病，以及(c)對已批準(zhǔn)的流感療法形式(例如金剛烷衍生物以及新近地神經(jīng)氨酸苷酶抑制劑，奧司他韋)抵抗的頻率增加。鑒于流感病毒所引起的疾病的嚴(yán)重程度，存在著對治療流感病毒感染的新療法的即時需求?？紤]到缺乏有效的預(yù)防或療法，因此本發(fā)明的目標(biāo)是提供用于治療被流感病毒所感染的宿主的治療化合物和方法。發(fā)明概述本發(fā)明的實(shí)施方案包括，在一方面，可有效地抑制具有單鏈負(fù)義基因組的rna病毒在宿主細(xì)胞內(nèi)復(fù)制的抗病毒化合物，該rna病毒選自正黏液病毒科，包括甲型流感病毒、乙型流感病毒和丙型流感病毒屬。化合物可靶向于選自以下的區(qū)域內(nèi)的病毒rna序列：1)負(fù)義病毒rna節(jié)段的5’或3’末端的25個堿基；2)正義crna的5’或3’末端的末端25個堿基；3)流感病毒mrna的aug起始密碼子周圍的45個堿基，以及4)受到選擇性剪接的流感病毒mrna的剪接供體或受體位點(diǎn)周圍的50個堿基。在某一實(shí)施方案中，抗病毒化合物可包括寡核苷酸，其表征為：a)耐核酸酶的主鏈，b)12-40個核苷酸堿基，以及c)長度為至少10個堿基的靶向序列，其與選自以下的靶區(qū)域雜交：i)甲型流感病毒、乙型流感病毒和丙型流感病毒的負(fù)義病毒rna節(jié)段的5’或3’末端的25個堿基，諸如包含m1或m2的節(jié)段，ii)甲型流感病毒、乙型流感病毒和丙型流感病毒的正義crna的5’或3’末端的末端25個堿基；iii)流感病毒mrna的aug起始密碼子周圍的45個堿基，諸如m1或m2mrna；以及iv)受到選擇性剪接的甲型流感病毒、乙型流感病毒和丙型流感病毒mrna的剪接供體或受體位點(diǎn)周圍的50個堿基，諸如m1或m2mrna。寡核苷酸也可表征為：a)被哺乳動物的宿主細(xì)胞主動地攝取的能力，和/或b)與病毒的靶區(qū)域形成異源雙鏈體結(jié)構(gòu)的能力，其中所述的異源雙鏈體結(jié)構(gòu)為：i)由病毒和寡核苷酸化合物的正義或負(fù)義鏈組成，以及ii)以至少45℃的離解tm為特征。在另一方面，本發(fā)明的實(shí)施方案包括抑制感染的流感病毒在哺乳動物宿主細(xì)胞內(nèi)復(fù)制的抗病毒化合物，該流感病毒具有單鏈的、節(jié)段的、負(fù)義基因組并選自正黏液病毒科。化合物可以作為表征為上文所述元件的寡核苷酸給予受感染的宿主細(xì)胞?；衔锟山o予流感病毒感染的或處于流感病毒感染風(fēng)險中的哺乳動物個體?；衔锟捎赏ㄟ^不帶電荷的、含磷的亞基間鍵連接的嗎啉亞基組成，將一個亞基的嗎啉氮連接到鄰近亞基的5’環(huán)外碳原子。在一方面，亞基間鍵為磷二酰胺鍵，諸如具有以下結(jié)構(gòu)的那些：其中，y1＝o，z＝o，pj為嘌呤或嘧啶或通過堿基特異的氫鍵有效結(jié)合到多核苷酸中一個堿基上的等價的堿基配對基，以及x為烷基、烷氧基、硫代烷氧基或烷基氨基，例如，其中x＝nr2，其中每個r獨(dú)立地為氫或甲基?；衔锟捎赏ㄟ^以上所述的不帶電荷鍵所連接的嗎啉亞基組成，其中所述不帶電荷鍵被插入著帶正電荷鍵。帶正電荷的鍵的總數(shù)在2-不超過鍵總數(shù)的一半。帶正電荷的鍵具有以上的結(jié)構(gòu)，其中x為1-哌嗪?；衔锟砂ü押塑账釋?yīng)物部分的共價連接以及有效增強(qiáng)宿主細(xì)胞對化合物攝取的富精氨酸多肽，該寡核苷酸對應(yīng)物部分能夠形成帶有正義或負(fù)義的病毒rna鏈的此類異源雙鏈體結(jié)構(gòu)。示例性多肽包含如seqidno:115-128的所鑒定的序列之一。在一相關(guān)的方面，本發(fā)明的實(shí)施方案包括形成于下列之間的異源雙鏈體復(fù)合物：(a)負(fù)義病毒rna的5’或3’末端的25個堿基，和/或；(b)正義mrna的5’或3’末端的末端25個堿基，和/或；(c)病毒mrna的aug起始密碼子周圍的45個堿基，和/或；(d)受到選擇性剪接的流感病毒mrna的剪接供體或受體位點(diǎn)周圍的50個堿基，以及；(e)以下列為特征的寡核苷酸：(i)耐核酸酶的主鏈，(ii)能夠被哺乳動物的宿主細(xì)胞所攝取，(iii)包含12-40個核苷酸堿基，其中所述的異源雙鏈體復(fù)合物具有至少45℃的離解tm。在某一實(shí)施方案中，示例性寡核苷酸可由通過不帶電荷的、含磷的亞基間鍵連接的嗎啉亞基所組成，將一個亞基的嗎啉氮連接到鄰近亞基的5’環(huán)外碳原子?；衔锟删哂辛锥０锋I，例如以結(jié)構(gòu)：其中，y1＝o，z＝o，pj為通過堿基特異的氫鍵有效結(jié)合到多核苷酸中堿基上的嘌呤或嘧啶堿基配對基，以及x為烷基、烷氧基、硫代烷氧基或烷基氨基。在一優(yōu)選的化合物中，x＝nr2，其中每個r獨(dú)立地為氫或甲基?；衔镆部捎赏ㄟ^以上所述的不帶電荷鍵所連接的嗎啉亞基組成，所述不帶電荷鍵被插入著帶正電荷鍵。帶正電荷鍵的總數(shù)為2個-不超過鍵總數(shù)的一半。帶正電荷的鍵具有以上的結(jié)構(gòu)，其中x為1-哌嗪?；衔锟蔀閱为?dú)的寡核苷酸或寡核苷酸與能夠增強(qiáng)宿主細(xì)胞對化合物攝取的富精氨酸多肽的連接。示例性多肽具有如seqidno:115-128所鑒定的序列的其中之一。仍然在另一方面，本發(fā)明的實(shí)施方案包括反義寡核苷酸以及抑制流感病毒在哺乳動物宿主細(xì)胞中復(fù)制的相關(guān)方法，該流感病毒具有單鏈的、節(jié)段的、負(fù)義的rna基因組并且選自正黏液病毒科?；衔锟赏ㄟ^本文所述的病毒rna成分表征化。在某一實(shí)施方案中，細(xì)胞在個體中，通常為具有流感病毒感染的個體。在一些實(shí)施方案中，個體具有繼發(fā)性細(xì)菌感染，并且方法還包含單獨(dú)地給予細(xì)菌抗生素，或與抗病毒的反義寡核苷酸同時給予。在具體的實(shí)施方案中，繼發(fā)性細(xì)菌感染為鏈球菌(streptococcal)的肺炎感染(例如肺炎鏈球菌(streptococcuspneuomoniae))。在某一實(shí)施方案中，抗生素為β-內(nèi)酰胺。在具體的實(shí)施方案中，抗生素選自盤尼西林、阿莫西林、頭孢菌素、氯霉素以及克林霉素。還包括減少流感病毒復(fù)制的方法，其包含單獨(dú)地給予靶向編碼cd200或cd200受體的rna分子的反義寡核苷酸，或與一種或多種本文所述的抗病毒反義寡核苷酸同時給予。包含本文所述的抗病毒反義寡核苷酸以及藥學(xué)上可接受的載體的藥物組合物。在一些實(shí)施方案中，藥物組合物還包含細(xì)菌抗生素，諸如盤尼西林、阿莫西林、頭孢菌素、氯霉素或克林霉素。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，細(xì)菌抗生素為抑菌的。在一些實(shí)施方案中，藥物組合物還包含靶向編碼cd200或cd200受體的rna分子的反義寡核苷酸。為治療諸如甲型流感病毒的流感病毒，靶向序列可與區(qū)域雜交，該區(qū)域與如seqidno:1-11所鑒定的序列組的其中之一有關(guān)。優(yōu)選的靶向序列為與seqidno:4的負(fù)鏈靶標(biāo)或seqidno:2的正鏈靶標(biāo)互補(bǔ)的那些。靶向于這兩個區(qū)域的示例性反義磷二酰胺嗎啉基寡聚物(“pmo”)被各自地列為seqidno:23和seqidno:23。附圖簡要說明圖1a表示帶有磷二酰胺鍵的示例性嗎啉基寡聚物結(jié)構(gòu)；圖1b表示如圖1a中的嗎啉基寡聚物，但是其中主鏈鍵包含(哌嗪基)磷二酰胺鍵形式的帶正電荷的基團(tuán)；圖1c表示根據(jù)本發(fā)明的一個實(shí)施方案，富精氨酸肽與反義寡聚物的連接；圖1d-g表示示例性嗎啉基寡核苷酸的重復(fù)亞基節(jié)段，特指d至g。圖2表示pmoplustm形式的優(yōu)選的示例性本發(fā)明的反義化合物(ml/m2-augplus；seqidno:13)。3個(哌嗪基)磷二酰胺(pip-pda)鍵給予了凈正電荷，因此術(shù)語pmoplustm。圖3表示存在于感染的細(xì)胞中的三種不同流感病毒rna：vrna、mrna和vcrna以及靶向于本文所述的pmo的靶位置。圖4a表示來源于重要的流感病毒血清型：hlnl、hlnl(s-oiv)、h5n1、h3n2、h9n2以及h7n7的m1/m2節(jié)段的5’末端的60個核苷酸的序列保守性。圖4b表示分離群具有指定堿基的百分比，如對m1/m2-aug靶標(biāo)而言每個堿基后下標(biāo)號碼(seqidno:12)。圖5a-5b表示各自地相對于aug起始密碼子和vcrna的5’末端，本發(fā)明的靶向序列的位置。圖6表示在h3n2鼠科模型系統(tǒng)中利用本發(fā)明的m1/m2-aug靶向化合物(seqidno:12和13)的劑量依賴性病毒滴度下降。圖7a-7d表示m1/m2-aug(seqidno:12和13)處理的雪貂在被2009h1n1(s-oiv)流行的豬流感分離群感染后具有降低的臨床生命體征。圖7e表示s-oiv感染的與用本發(fā)明的m1/m2-aug化合物(seqidno:12和13)處理的雪貂導(dǎo)致了2.3對數(shù)的病毒滴度抑制。圖8a-c表示各自地靶向于病毒的harna、m1蛋白和m2蛋白表達(dá)上的剪接受體位點(diǎn)的ppmo的效果。圖9a-b表示靶向于病毒的harna和m2蛋白表達(dá)上的m1/m2-aug起始密碼子的反義lna寡聚物的效果。圖10a-b表示靶向于病毒的harna和m2蛋白表達(dá)上的m1/m2-aug起始密碼子和剪接受體位點(diǎn)的反義2’ome寡聚物的效果。圖11表示用靶向于m1/m2-aug起始密碼子在用ppmo處理的h1n1pr8感染的mdck細(xì)胞中抑制m1和m2蛋白表達(dá)。發(fā)明的詳細(xì)描述1.定義除非另有定義，本文所使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語都具有本領(lǐng)域技術(shù)人員通常理解的含義。盡管任一與本文所述的那些相似或等同的方法和材料都能夠用于本發(fā)明的實(shí)踐或試驗(yàn)，但優(yōu)選的方法和材料為所述的。出于本發(fā)明的目的，下列的術(shù)語為以下所定義的。本文所用的冠詞“a(一)”和“an(一個)”指1個或多于1個(即至少1個)冠詞的主語。僅為舉例，“anelement(一個元件)”指1個元件或多于1個元件。本文所用的“大約”指數(shù)量、水平、數(shù)值、號碼、頻率、百分比、尺寸、大小、總數(shù)、重量或長度，其變化多達(dá)30,25,20,25,10,9,8,7,6,5,4,3,2或1％的參照的數(shù)量、水平、數(shù)值、號碼、頻率、百分比、尺寸、大小、總數(shù)、重量或長度。本文所用的“編碼序列”指貢獻(xiàn)基因的多肽產(chǎn)物編碼的任一核酸序列。例如術(shù)語“非編碼序列”指不貢獻(xiàn)基因的多肽產(chǎn)物編碼的任一核酸序列。本說明書自始至終，除非上下文另有要求，詞語“包含(comprise)”、“包含(comprises)”以及“包含(comprising)”將理解為意指包含陳述的步驟或成分，或步驟或成分的群組但是并不排除任一其他的步驟或成分，或步驟或成分的群組。本文所用的“由--組成(consistingof)”指包括并且限于，跟隨短語“由--組成(consistingof)”的無論什么。因此，短語“由--組成(consistingof)”表明所列舉的成分為必須的或強(qiáng)制的，并且沒有其他的成分可能存在。本文所用的“基本上由…組成(consistingessentiallyof)”指包括任一短語后所列舉的成分并且限于不干擾或促進(jìn)公開出版物中針對所列舉的成分的指定的活性或作用。因此，短語“基本上由…組成(consistingessentiallyof)”表明所列舉的成分為必須的或強(qiáng)制的，但是其他的成分為任選的并且可能或不可能取決于是否它們實(shí)質(zhì)地影響所列舉的成分的活性或作用。術(shù)語“互補(bǔ)的”和“互補(bǔ)性”指通過堿基配對規(guī)則所相關(guān)的多肽(即核苷酸的序列)。例如序列“a-g-t”與序列“t-c-a”互補(bǔ)。互補(bǔ)性可以為“部分的”，其中根據(jù)堿基配對規(guī)則只有一些核酸的堿基為匹配的。或者，核酸間可能存在“完全的”或“全部的”互補(bǔ)性?；パa(bǔ)性在核酸鏈間的程度對核酸鏈間雜交的功效和強(qiáng)度具有顯著的影響。雖然最佳的互補(bǔ)性經(jīng)常是理想的，但是一些實(shí)施方案可以包括一個或多個但是優(yōu)選6,5,4,3,2或1個不匹配，就靶rna而言。包括寡聚物中位于任何位置上的變體。在某一實(shí)施方案中，靠近寡聚物的終點(diǎn)的序列中的變體通常優(yōu)選內(nèi)含子中的變體，并且如果存在，變體通常在5’和/或3’末端的約6,5,4,3,2或1個核苷酸中。術(shù)語“細(xì)胞穿透肽”或“cpp”可互換地使用并且指陽離子細(xì)胞穿透肽，也稱作轉(zhuǎn)運(yùn)肽，載體肽或肽轉(zhuǎn)導(dǎo)域。如本文所示，肽具有誘導(dǎo)30％,40％,50％,60％,70％,80％,90％或100％給定的細(xì)胞培養(yǎng)群的細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞穿透的能力，包括所有在中間的整數(shù)，并且允許基于全身用藥在體內(nèi)多種組織中大分子易位。術(shù)語“反義寡聚物”或“反義化合物”或“反義寡核苷酸”或“寡核苷酸”可互換地使用并且指環(huán)狀亞基的序列，每個都帶有堿基配對基，通過亞基間鍵連接，該亞基間鍵允許堿基配對基與核酸中的靶序列(通常為rna)通過沃森-克里克(watson-crick)堿基配對雜交以形成靶序列內(nèi)的核酸：寡聚物異源雙鏈體。環(huán)狀亞基可基于核糖或另外的戊糖，或在某些實(shí)施方案中，嗎啉基團(tuán)(見下列的嗎啉基寡聚物的描述)。還考慮的是肽核酸(pna)，鎖核酸(lna)，2’-o-甲基寡核苷酸和rna干擾劑(sirna劑)以及其他的本領(lǐng)域中已知的反義劑。此類反義寡聚物可以被設(shè)計用于阻斷或抑制mrna翻譯或抑制天然的信使rna剪接處理或誘導(dǎo)靶向的mrna的降解，并且可以說是“導(dǎo)向”或“靶向”與其所雜交的靶序列。在某些實(shí)施方案中，靶序列包括一區(qū)域，該區(qū)域包括mrna的aug起始密碼子或預(yù)處理的mrna的3’或5’剪接位點(diǎn)，分支點(diǎn)。靶序列可以在外顯子內(nèi)或在內(nèi)含子內(nèi)。針對剪接位點(diǎn)的靶序列可包括mrna序列，該序列具有在預(yù)處理的mrna中的正常的剪接受體連接的其5’末端下游地1個-約25個堿基對。優(yōu)選的剪接位點(diǎn)靶序列為任一預(yù)處理的mrna的區(qū)域，該區(qū)域包括剪接位點(diǎn)，或完全地包含在編碼序列的外顯子內(nèi)，或跨越剪接受體或供體位點(diǎn)。更普遍地，寡聚物被稱為“靶向”生物學(xué)上相關(guān)的靶標(biāo)，諸如蛋白、病毒或細(xì)菌，當(dāng)它以上文所述的方式靶向靶標(biāo)的核酸時。包含基本上由，或由一個或多個seqidno:12-114組成的反義寡核苷酸。這些反義寡聚物的變體也包括在內(nèi)，其包括具有與任一seqidno:12-11480％,85％,90％,95％,97％,98％或99％(包括中間所有的整數(shù))序列同一性或序列同源性的變體寡聚物，和/或通過約1,2,3,4,5,6,7,8,9或10個核苷酸與這些序列不同的變體，優(yōu)選抑制細(xì)胞內(nèi)流感病毒復(fù)制的那些變體。任一或多個seqidno:12-114的寡核苷酸也包括在內(nèi)，其包含如本文所述的適當(dāng)數(shù)目的帶電荷的鍵，例如多達(dá)約1個/2-5個不帶電荷的鍵，諸如約4-5個/10個不帶電荷的鍵，和/或其包含也如本文所述的附加于其中的富精氨酸肽。術(shù)語“嗎啉基寡聚物”或“pmo”(氨基磷酸酯-或磷二酰胺嗎啉基寡聚物)指由嗎啉亞基結(jié)構(gòu)組成的寡核苷酸對應(yīng)物，其中(i)結(jié)構(gòu)通過含磷的鍵連接在一起，1個-3個原子長度，優(yōu)選2個原子長度，并且優(yōu)選不帶電荷的或陽離子的，將一個亞基的嗎啉氮連接到鄰近亞基的5’環(huán)外碳，并且(ii)每個嗎啉基環(huán)都具有嘌呤或嘧啶或等價的通過堿基特異的氫鍵有效地結(jié)合多核苷酸的堿基配對基。例如見圖1a中的結(jié)構(gòu)，其顯示了優(yōu)選的磷二酰胺鍵類型?？梢灾圃熳凅w至該鍵，只要它們不干擾結(jié)合或活性。例如，附加到磷的氧可以被硫取代(硫代磷二酰胺)。5’氧可以被氨基或低級烷基取代的氨基取代。附加到磷的懸垂的氮可以是未取代的、被低級烷基單基取代的或雙基取代的(任選地取代的)。下文還可見陽離子鍵的討論。嘌呤或嘧啶堿基配對基通常為腺嘌呤、胞嘧啶、鳥嘌呤、尿嘧啶、胸腺嘧啶或肌苷。嗎啉基寡聚物的合成、結(jié)構(gòu)以及結(jié)合特征詳述于美國專利申請第5,698,685,5,217,866,5,142,047,5,034,506,5,166,315,5,521,063和5,506,337號以及pct專利申請pct/us07/11435號(陽離子鍵)和pct專利申請us2008/012804號(改進(jìn)的合成)，在此通過引用將所有的專利申請并入。術(shù)語“寡核苷酸對應(yīng)物”指寡核苷酸其具有(i)修飾的主鏈結(jié)構(gòu)，例如不同于天然的寡核苷酸和多核苷酸中找到的標(biāo)準(zhǔn)的磷酸二酯鍵的主鏈，并且(ii)任選地，修飾的糖基，例如嗎啉基而不是核糖或脫氧核糖基。寡核苷酸對應(yīng)物支持能夠通過沃森-克里克(watson-crick)堿基配對氫鍵結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)的多核苷酸堿基的堿基，其中對應(yīng)物主鏈在某種程度上呈遞堿基以允許此類氫鍵以序列特異的方式在寡核苷酸對應(yīng)物分子與標(biāo)準(zhǔn)的多核苷酸中堿基間結(jié)合(例如單鏈的rna或單鏈的dna)。優(yōu)選的對應(yīng)物為具有基本上不帶電荷的、含磷的主鏈的那些。寡核苷酸對應(yīng)物中基本上不帶電荷的、含磷的主鏈為一個其中大多數(shù)的亞基鍵，例如50-100％間，通常至少60％-100％或75％或80％的它的鍵為不帶電荷的或基本上不帶電荷的并且包含單一的磷原子。反義寡核苷酸和寡核苷酸對應(yīng)物可包含約8個-40個亞基，通常約8個-25個亞基，并且優(yōu)選約12個-25個亞基。在某些實(shí)施方案中，寡核苷酸可以具有精確的對靶序列的序列互補(bǔ)性或近似于互補(bǔ)性，如下文所定義的。寡核苷酸的“亞基”指核苷酸(或核苷酸對應(yīng)物)單元。該術(shù)語可指帶有或不帶有附加的亞基間鍵的核苷酸單元，盡管，當(dāng)提及“帶電荷的亞基”時，電荷通常屬于亞基間鍵(例如磷酸或硫代磷酸鍵或陽離子鍵，如圖1b中所示)。嘌呤或嘧啶堿基配對基通常為腺嘌呤，胞嘧啶、鳥嘌呤、尿嘧啶、胸腺嘧啶或肌苷。還包括堿基諸如吡啶-4-酮，吡啶-2-酮，苯基，假尿嘧啶，2,4,6-trimell5thoxy苯，3-甲基尿嘧啶，二氫尿嘧啶核苷，萘基，氨基苯，5-烷基胞嘧啶核苷(例如5-甲基胞嘧啶核苷)，5-烷基尿嘧啶核苷(例如核糖胸腺嘧啶)，5-鹵代尿嘧啶核苷(例如5-溴尿嘧啶核苷)或6-硫唑嘌呤嘧啶或6-烷基嘧啶(例如6-甲基尿嘧啶核苷)，丙炔、辮苷，2-硫代尿嘧啶核苷，4-硫代尿嘧啶核苷，懷丁苷，wybutoxosine，4-乙酰替丁，5-(羧基羥甲基)尿嘧啶核苷，5-羧基甲基氨基甲基-3-硫代尿嘧啶核苷，5-羧基甲基氨基甲基尿嘧啶核苷，β-d-半乳糖基辮苷，1-甲基腺嘌呤核苷，1-甲基肌苷，2,2-二甲基鳥嘌呤核苷，3-甲基胞嘧啶核苷，2-甲基腺嘌呤核苷，2-甲基鳥嘌呤核苷，n6-甲基腺嘌呤核苷，7-甲基鳥嘌呤核苷，5-甲氧基氨基甲基-2-硫代尿嘧啶核苷，5-甲基氨基甲基尿嘧啶核苷，5-甲基羰基乙基尿嘧啶核苷，5-甲氧基尿嘧啶核苷，5-甲基-2-硫代尿嘧啶核苷，2-甲基硫代-n6-異戊烯基腺嘌呤核苷，β-d-甘露糖基辮苷，尿嘧啶核苷-5-羥乙酸，2-硫代胞嘧啶核苷，蘇氨酸衍生物以及其他(burginetal,1996,biochemistry,35,14090；uhlman&peyman,supra)。本文所用的“修飾的堿基”在這一方面意指核苷酸堿基除了腺嘌呤(a)、鳥嘌呤(g)、胞嘧啶(c)、胸腺嘧啶(t)以及尿嘧啶(u)，如以上所例證的；此類堿基可以用于反義分子中的任一位置。本領(lǐng)域中的技術(shù)人員應(yīng)理解取決于寡聚物的用途，ts和us為可互換的。例如，隨著其他的反義化學(xué)過程諸如更類似rna的2’-0-甲基反義寡核苷酸，t堿基可以顯示為u(例如見序列表)。“氨基酸亞基”或“氨基酸殘基”可指α-氨基酸殘基(-co-chr-nh-)或β-或其他的氨基酸殘基(例如-co-(ch2)nnchr-nh-)，其中r為側(cè)鏈(其可以包括氫)并且n為1-7，優(yōu)選1-4。術(shù)語“天然存在的氨基酸”指存在于自然界中發(fā)現(xiàn)的蛋白中的氨基酸，諸如蛋白質(zhì)的生物合成期間所利用的20(l)-氨基酸以及諸如4-羥基脯氨酸，羥基賴氨酸，鎖鏈素，異鎖鏈素，同型半胱氨酸，瓜氨酸和鳥氨酸。術(shù)語“非天然的氨基酸”指不存在于自然界中發(fā)現(xiàn)的蛋白中的那些氨基酸，實(shí)例包括β-丙氨酸(β-ala)，6-氨基己酸(ahx)以及6-氨基戊酸?！胺翘烊坏陌被帷鳖~外的實(shí)例包括但不限于(d)-氨基酸，正亮氨酸，正纈氨酸，對氟苯丙氨酸，乙硫氨基酪酸等，其為本領(lǐng)域中技術(shù)人員已知的。本文所用的“分離的”意指基本上或基本上游離于天然狀態(tài)下正常伴隨它的成分的物質(zhì)。例如“分離的多核苷酸”或“分離的寡核苷酸”，如本文所用的，指已純化或天然存在的狀態(tài)中移除位于它的側(cè)面的序列的多核苷酸，例如已移除通常鄰近該片段的序列的dna片段?！坝行Я俊被颉爸委熒嫌行У牧俊敝钢T如反義寡聚物或rna干擾劑(例如sirna)的治療化合物的量，給予哺乳動物個體單次劑量或一系列劑量的部分，其有效地產(chǎn)生理想的治療效果。對反義寡聚物而言，通常通過抑制所選的靶序列的翻譯或天然的剪接過程導(dǎo)致該效果。“有效量”，靶向感染的流感病毒，也涉及可降低感染病毒的復(fù)制率和/或病毒負(fù)荷，和/或與病毒感染相關(guān)癥狀的有效量。本文所用的“增強(qiáng)(enhance)”或“增強(qiáng)(enhancing)”，或“增加(increase)”或“增加(increasing)”，或“激發(fā)(stimulate)”或“激發(fā)(stimulating)”，通常指一個或反義或rnai化合物或組合物產(chǎn)生或引起細(xì)胞或個體內(nèi)，與無反義化合物或?qū)φ盏幕衔锵啾?，更?qiáng)的生理反應(yīng)(即下游效應(yīng))的能力?！霸黾拥摹被颉霸鰪?qiáng)的”量通常為“統(tǒng)計學(xué)意義的”量，并且可包括1.1,1.2,2,3,4,5,6,7,8,9,10,15,20,30,40,50或更多倍的(例如500,1000倍)(包括所有在1之間以及1以上的整數(shù)和小數(shù)點(diǎn))，例如1.5,1.6,1.7.1.8等)無反義化合物(制劑缺乏)或?qū)φ盏幕衔锼a(chǎn)生的量的增加。術(shù)語“降低”或“抑制”通?？缮婕氨景l(fā)明的一種或多種反義或rnai化合物“減少”諸如疾病的癥狀或本文所述的狀態(tài)，如根據(jù)診斷學(xué)領(lǐng)域中常規(guī)技術(shù)所測量的相關(guān)的生理或細(xì)胞的反應(yīng)的能力。本領(lǐng)域中技術(shù)人員對生理或細(xì)胞的反應(yīng)(體內(nèi)或體外)是明確的，并且可以包括流感病毒感染的癥狀或病理學(xué)的減弱，或病毒復(fù)制或病毒負(fù)荷的減弱。與通過無反義化合物或?qū)φ盏慕M合物所產(chǎn)生的反應(yīng)相比，反應(yīng)的“降低”可為“統(tǒng)計學(xué)意義的”，并且可以包括1％,2％,3％,4％,5％,6％,7％,8％,9％,10％,11％,12％,13％,14％,15％,16％,17％,18％,19％,20％,25％,30％,35％,40％,45％,50％,55％,60％,65％,70％,75％,80％,85％,90％,95％或100％降低，其包括這中間所有的整數(shù)。術(shù)語“靶序列”指針對寡核苷酸或反義制劑所導(dǎo)向的靶rna的一部分，即寡核苷酸通過互補(bǔ)序列的沃森-克里克(watson-crick)堿基配對與之雜交的序列。在某些實(shí)施方案中，靶序列可以為病毒的負(fù)鏈rna或病毒的mrna的連續(xù)區(qū)，或可以由病毒的基因組的或病毒的互補(bǔ)rna的5’與3’末端的序列組成。術(shù)語“靶向序列”或“反義靶向序列”指與rna基因組中的靶序列互補(bǔ)的(意思是，另外，基本上互補(bǔ)的)寡核苷酸或其他的反義制劑中的序列。反義化合物的整條序列或只有一部分可與靶序列互補(bǔ)。例如，在具有20-30個堿基的寡核苷酸中，約6個,7個,8個,9個,10個,11個,12個,13個,14個,15個,16個,17個,18個,19個,20個,21個,22個,23個,24個,25個,26個,27個,28個或29個可為與靶區(qū)域互補(bǔ)的靶向序列。通常，靶向序列由連續(xù)堿基組成，但是可選擇性地由非連續(xù)的序列組成，當(dāng)放置在一起時，例如自寡核苷酸的另一端，組成跨越靶序列的序列。可選擇靶序列和靶向序列，從而使得反義化合物的結(jié)合將在以下區(qū)域內(nèi)：1)負(fù)義病毒rna的5’或3’末端的25個堿基；2)正義mrna的5’或3’末端的末端30個堿基；3)病毒mrna的aug起始密碼子周圍的45個堿基，和/或4)受到選擇性剪接的病毒mrna的剪接供體或受體位點(diǎn)周圍的50個堿基。在某些實(shí)施方案中，靶區(qū)域可包括1)負(fù)義的病毒rna的m1或m2區(qū)域的5’或3’末端的25個堿基；2)正義的m1或m2mrna的5’或3’末端的末端30個堿基；3)m1或m2mrna的aug起始密碼子周圍的45個堿基，和/或4)m1或m2病毒mrna的剪接供體或受體位點(diǎn)周圍的50個堿基。在某些實(shí)施方案中，靶區(qū)域可包含aug密碼子和病毒rna的剪接供體位點(diǎn)周圍或參與病毒rna的剪接供體位點(diǎn)的堿基(例如m1或m2mrna)，諸如多嘧啶區(qū)或套索形成序列。在某些實(shí)施方案中，利用單一的反義寡聚物或rnai制劑以靶向aug起始密碼子與m1/m2rna近側(cè)的剪接供體序列(例如多嘧啶區(qū))可提供協(xié)同效應(yīng)，就降低靶蛋白表達(dá)，減少病毒復(fù)制或這兩者而言。當(dāng)雜交發(fā)生在反平行構(gòu)型中時，靶序列與靶向序列被描述為彼此“互補(bǔ)”。出于本發(fā)明的目的，靶向序列可具有與靶序列“近似的”或“實(shí)質(zhì)的”互補(bǔ)性但是還發(fā)揮功能，即它可以仍然為功能性“互補(bǔ)的”。在某些實(shí)施方案中，寡核苷酸可具有10個核苷酸與靶序列至多1個錯配，優(yōu)選地20個至多1個錯配?？蛇x擇地，寡核苷酸可具有與本文所述的示例性反義靶向序列至少90％序列同源性，并且優(yōu)選至少95％序列同源性。如果寡聚物與靶標(biāo)在生理狀態(tài)下雜交，并伴有基本上大于45℃，優(yōu)選至少50℃，通常60℃-80℃或更高的tm，那么寡核苷酸與靶多核苷酸“特異地雜交”。此類雜交優(yōu)選對應(yīng)嚴(yán)格的雜交狀態(tài)。給定的離子強(qiáng)度和ph下，tm為50％靶序列與互補(bǔ)的多核苷酸在該溫度下雜交的溫度。而且，此類雜交可以反義寡聚物與靶序列“近似的”或“實(shí)質(zhì)的”互補(bǔ)性以及精確的互補(bǔ)性出現(xiàn)?！巴葱浴敝赶嗤幕蛴杀Ｊ厝〈M成的氨基酸的百分比數(shù)字。同源性利用諸如gap的序列比較程序(deverauxetal,1984,nucleicacidsresearch12,387-395)可測定同源性。用這種方法，可通過缺口插入到比對中比較本文所引用的相似的或基本上不同的長度的那些，例如通過gap所用的比較算法測定此類缺口。如本文所用的，詳述“序列同一性”或例如，包含“序列50％相同的”，指基于核苷酸對核苷酸或氨基酸對氨基酸，通過比較窗，序列為相同的程度。因此，“序列同一性百分比”可通過在比較窗(comparisonwindow)中比較兩條最佳比對的序列來計算，測定兩條序列中存在相同的核苷酸堿基(例如a,t,c,g,i)或相同的氨基酸殘基(例如ala,pro,ser,thr,gly,val,leu,he,phe,tyr,trp,lys,arg,his,asp,glu,asn,gin,cys以及met)的位置的數(shù)量以產(chǎn)生匹配位置的數(shù)量，匹配位置的數(shù)量除以參照序列中位置的總數(shù)(即窗口大小)，并將結(jié)果乘以100產(chǎn)生序列同一性百分比。用于描述兩條或多條多核苷酸或多肽間序列關(guān)系的術(shù)語包括“參照序列”、“比較窗(comparisonwindow)”、“序列同一性”、“序列同一性百分比”以及“實(shí)質(zhì)同一性”?！皡⒄招蛄小睘橹辽?條或10條，但是時常15條-18條，經(jīng)常至少25個單體單元，包括核苷酸和氨基酸殘基長度。因?yàn)閮蓚€多核苷酸可各自包含(1)兩條多核苷酸間相似的序列(即只有完整的多核苷酸序列的一部分)以及(2)兩條多核苷酸間相異的序列，兩條(或多條)多核苷酸間序列比較通常通過在比較窗(comparisonwindow)內(nèi)比較序列以確定和比較序列相似性的局部區(qū)域?！氨容^窗”指至少6個、通常約50個-約100個、更通常約100個-約150個連續(xù)位置的概念上的節(jié)段，其中在將兩條序列進(jìn)行最佳比對后，可將序列可與相同數(shù)量連續(xù)位置的參照序列進(jìn)行比較。與用于兩條序列的最佳比對的參照序列(其并不包含添加或缺失)比較，比較窗可包含約20％或更小的添加或缺失(即缺口)。用于比對比較窗的序列的最佳比對可通過計算機(jī)執(zhí)行算法(威斯康辛遺傳學(xué)軟件包第7版中的gap、bestfit、fasta和tfasta,geneticscomputergroup(gcg),575sciencedrivemadison,wi,usa)或檢查以及通過任一所選擇的各種方法所產(chǎn)生的最好的比對(即通過比較窗導(dǎo)致最高的同源性百分比)來進(jìn)行。作為一個實(shí)例，參考文獻(xiàn)也通過altschuletal,1997,nucl.acidsres.25:3389公開了所創(chuàng)造的程序的blast家族。序列分析的詳細(xì)討論可以在ausubeletal,“currentprotocolsinmolecularbiology”的19.3單元，johnwiley&sonsinc,1994-1998,第15章(chapter15)中找到?！澳秃怂崦傅摹惫丫畚锓肿?寡聚物)指其主鏈為基本上耐核酸酶分裂，非雜交的或雜交的形式；通過體內(nèi)普遍的細(xì)胞外和細(xì)胞內(nèi)核酸酶；即在寡聚物暴露于體內(nèi)正常的核酸酶狀態(tài)下寡聚物表現(xiàn)出很少或無核酸酶分裂?！爱愒措p鏈體”指反義寡核苷酸與靶rna的互補(bǔ)部分間的雙鏈體?！澳秃怂崦傅漠愒措p鏈體”指通過反義寡聚物與它的互補(bǔ)靶標(biāo)結(jié)合所形成的異源雙鏈體，從而使得異源雙鏈體為基本上耐細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞外核酸酶的體內(nèi)降解，諸如核糖核酸酶(rnaeh)，其能夠切割雙鏈的rna/rna或rna/dna復(fù)合物?！吧婕鞍衦na的堿基特異的細(xì)胞內(nèi)結(jié)合事件”指反義寡核苷酸與細(xì)胞內(nèi)的靶rna序列的特異結(jié)合。此類結(jié)合的堿基特異性為序列依賴的。例如，單鏈的多核苷酸能夠特異地結(jié)合序列互補(bǔ)的單鏈的多核苷酸。本文所用的術(shù)語“體液”包含從個體獲得的各種樣品類型，其包括尿液、唾液、血漿、血液、脊髓液或其他的諸如皮膚細(xì)胞或皮屑的生物學(xué)來源的樣品，并且可指懸浮在其中的細(xì)胞或細(xì)胞片段，或液態(tài)介質(zhì)以及它的溶質(zhì)。術(shù)語“相對量”用于試驗(yàn)測量與對照測量間進(jìn)行比較之處。反應(yīng)中形成復(fù)合物的試劑的相對量為相比較與對照樣本反應(yīng)的量，與試驗(yàn)樣本反應(yīng)的量。對照樣本可在同一測定中單獨(dú)地運(yùn)行，或它可為同一樣品的一部分(例如組織切片中惡性區(qū)域周圍的正常組織)。個體或細(xì)胞的“治療”為作為改變個體或細(xì)胞中疾病或病理學(xué)的天然過程的方法所提供的任一類型的干預(yù)。治療包括但不限于，例如，藥物組合物，并且可預(yù)防性地或繼啟動病理學(xué)事件或接觸病因?qū)W因子之后進(jìn)行。治療包括任一對疾病的癥狀或病理學(xué)或流感病毒感染相關(guān)狀態(tài)有理想的影響。相對于被診斷為特殊病毒感染的患者，相關(guān)的術(shù)語“改進(jìn)的治療結(jié)果”可指病毒生長、或病毒負(fù)荷或可檢測的那種特殊病毒感染相關(guān)癥狀減慢或減少。還包括“預(yù)防的”治療，其可針對降低疾病或被治療的狀態(tài)的進(jìn)展率，延遲疾病或狀態(tài)的發(fā)作，或減弱它發(fā)作的嚴(yán)重程度?！爸委煛被颉邦A(yù)防”不一定預(yù)示著疾病或狀態(tài)，或其相關(guān)癥狀的徹底的根治，治愈或預(yù)防。當(dāng)制劑可以通過機(jī)制而不是被動擴(kuò)散穿過細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞。例如制劑可通過“主動轉(zhuǎn)運(yùn)”被轉(zhuǎn)運(yùn)，指制劑穿過哺乳動物細(xì)胞膜的轉(zhuǎn)運(yùn)，例如通過atp依賴的轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制，或通過“易化轉(zhuǎn)運(yùn)”，指反義制劑穿過細(xì)胞膜通過需要制劑與轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白結(jié)合，然后該轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白可使結(jié)合的制劑穿過膜的通道變得容易的轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制的轉(zhuǎn)運(yùn)。對主動轉(zhuǎn)運(yùn)和易化轉(zhuǎn)運(yùn)而言，寡核苷酸對應(yīng)物優(yōu)選具有如下文所定義的基本上不帶電荷的主鏈。可選擇地，反義化合物可配制成復(fù)合的形式，諸如具有與陽離子脂質(zhì)或脂質(zhì)體復(fù)合的陰離子主鏈的制劑，其可以通過內(nèi)吞機(jī)制被攝入到細(xì)胞內(nèi)。反義寡核苷酸也可以，例如在它的5’或3’末端，連接富精氨酸肽，諸如hivtat蛋白的部分、多聚精氨酸或連接精氨酸與其他的包括非天然的氨基酸、6-氨基己酸(ahx)以及β-丙氨酸(pala)的氨基酸組合。示例性的富精氨酸遞送肽被列為seqidno:115-128。這些示例性的富精氨酸的遞送肽促進(jìn)轉(zhuǎn)運(yùn)至如所述的靶宿主細(xì)胞內(nèi)(moulton,nelsonetal.2004)。因此，包括治療流感病毒感染的方法，通過給予需要其的個體一種或多種本發(fā)明的反義寡聚物(例如seqidno:12-114及其變體)，任選地作為藥物制劑的一部分或劑型。本文所用的“個體”可包括任一展現(xiàn)癥狀或處于展現(xiàn)癥狀的危險中的動物，其可用本發(fā)明的反義化合物治療，諸如具有或處于具有流感病毒感染的危險中的個體。合適的個體(患者)包括實(shí)驗(yàn)室動物(諸如小鼠、大鼠、兔子或豚鼠)、農(nóng)畜以及家畜或?qū)櫸?諸如貓或狗)。包括非人類的靈長類動物，優(yōu)選人類患者。還關(guān)注的是rna干擾(rnai)的替代方法，諸如涉及雙鏈rna分子或dsrna那些。術(shù)語“雙鏈的”意指兩個單獨(dú)的核酸鏈，其包含其中至少鏈的一部分為與氫鍵充分地互補(bǔ)并且形成雙鏈體結(jié)構(gòu)的部分。術(shù)語“雙鏈體”或“雙鏈體結(jié)構(gòu)”指雙鏈分子的區(qū)域，其中兩個單獨(dú)的鏈為基本上互補(bǔ)的，并且因此彼此雜交?！癲srna”指具有包含兩個互補(bǔ)的并且反向平行的核酸鏈的雙鏈體結(jié)構(gòu)(即正義鏈和反義鏈)的核糖核酸分子。并非所有的dsrna的核苷酸都必須顯示沃森-克里克(watson-crick)堿基對；兩個rna鏈可以基本上互補(bǔ)的。rna鏈可具有相同或不同數(shù)量的核苷酸。術(shù)語“dsrna”還包括“sirna”或小分子干擾核糖核酸(shortinterferingrna)。應(yīng)理解的是術(shù)語“核糖核苷酸”或“核苷酸”可以，在修飾的rna或核苷酸替代的情況下，也指修飾的核苷酸或一個或多個位置上的替代置換部分。因此，dsrna為或包括與靶rna至少部分地互補(bǔ)的區(qū)域。在某些實(shí)施方案中，dsrna與靶rna為完全地互補(bǔ)的。不需要dsrna與靶標(biāo)之間存在完美的互補(bǔ)性，但是對應(yīng)性必須足夠以使dsrna或其裂解產(chǎn)物能夠指導(dǎo)序列特異的沉默，諸如通過靶rna的rnai裂解。與靶標(biāo)鏈的互補(bǔ)性或同源性的程度在反義鏈中是最關(guān)鍵的。雖然有完美的互補(bǔ)性，尤其在反義鏈中，經(jīng)常理想的是一些實(shí)施方案能夠包括1個或多個但是優(yōu)選6,5,4,3,2或更少的與靶rna的錯配。錯配在末端區(qū)域中是最可接受的，并且如果存在，優(yōu)選在一個末端區(qū)域或區(qū)域，例如5’和/或3’末端的6,5,4或3個核苷酸內(nèi)。正義鏈僅需要與反義鏈基本上互補(bǔ)以維持總體的分子雙鏈的特征。如本文所用的，“修飾的dsrna”指dsrna分子，其包含至少一個改變從而使得它比識別同一靶rna的相同的dsrna分子更耐核酸酶(例如蛋白激酶)。修飾的dsrna可包括單鏈的核苷酸懸垂和/或至少1個取代的核苷酸。如本文所用的，“核苷酸懸垂”指未配對的核苷酸或當(dāng)一條rna鏈的3’末端延伸超過另一條互補(bǔ)鏈的5’末端，反之亦然時，從雙鏈體結(jié)構(gòu)突出的核苷酸?！捌降摹被颉捌侥┒恕币庵竏srna的末端不存在沒有配對的核苷酸，即沒有核苷酸懸垂。“平末端的”dsrna為雙鏈超過它的全長的dsrna，即分子的任一末端沒有核苷酸懸垂。如本文所用的術(shù)語“末端的堿基對”指雙鏈分子的雙鏈體區(qū)域的一個末端上的核苷酸堿基對。例如，如果dsrna或其他的分子為平末端的(即沒有核苷酸懸垂)，那么在分子兩端的最后的核苷酸堿基對為末端的堿基對。在dsrna或其他的分子在雙鏈體結(jié)構(gòu)的一端或兩端具有核苷酸懸垂的地方，即刻鄰近核苷酸懸垂的最后的核苷酸堿基對為在分子那一末端的末端的堿基對。還包括能夠表達(dá)本發(fā)明的寡聚物的，流感病毒靶向序列的載體遞送系統(tǒng)，諸如表達(dá)包含任一個或多個seqidno:12-114的如本文所述的多核苷酸序列及其變體的載體，或表達(dá)與任一個或多個seqidno:1-11的靶序列互補(bǔ)的多核苷酸序列的載體。包括表達(dá)sirna或其他的形成雙鏈體的rna干擾分子的載體。本文所用的“載體”或“核酸構(gòu)建體”意指多核苷酸分子，優(yōu)選dna分子，例如衍生于質(zhì)粒、噬菌體、酵母或病毒，多核苷酸可以插入或克隆到其中。載體優(yōu)選包含一個或多個唯一的限制性位點(diǎn)而且能夠在確定的包括靶細(xì)胞或組織或前體細(xì)胞或其組織的宿主細(xì)胞中自主復(fù)制，或可與確定的宿主的基因組積分的從而使得所克隆序列為可復(fù)制的。因此，載體可以為自主復(fù)制載體，即載體以染色體外實(shí)體存在，其復(fù)制不受染色體復(fù)制的支配，例如，線性或閉環(huán)質(zhì)粒，染色體外成分，微型染色體或人工染色體。載體可包含任一種用于保證自主復(fù)制的方法?？蛇x擇地，載體可以為一個，當(dāng)其被引入到宿主細(xì)胞中時，它融入到基因組中并且與它所融入的染色體一起復(fù)制。載體或核酸構(gòu)建體系統(tǒng)可以包含單一的載體或質(zhì)粒，兩個或多個載體或質(zhì)粒，其可共同包含全部dna以被引入到宿主細(xì)胞的基因組或轉(zhuǎn)位子中。載體的選擇通常取決于載體與其將被引入到的宿主細(xì)胞的相容性。在目前的情況下，載體或核酸構(gòu)建體優(yōu)選在諸如肌細(xì)胞的哺乳動物細(xì)胞中可操作地功能性的一個。載體還可以包括諸如抗生素或耐藥性基因或報告基因(即綠熒光蛋白，熒光素酶)的篩選標(biāo)記，其可以用于篩選或鑒定合適的轉(zhuǎn)化子或轉(zhuǎn)染子。示例性遞送系統(tǒng)可包括病毒的載體系統(tǒng)(即病毒介導(dǎo)的轉(zhuǎn)導(dǎo))，其包括但不限于逆轉(zhuǎn)錄病毒的(例如慢病毒)載體，腺病毒載體，腺相關(guān)的病毒載體以及皰疹病毒載體，除此以外本領(lǐng)域中已知的載體。如本文所用的術(shù)語“可操作地連接”意指在啟動子的調(diào)節(jié)控制下定位寡聚物編碼序列，然后其控制寡聚物的轉(zhuǎn)錄。野生型基因或基因產(chǎn)物為在群體中最頻繁地觀察到的那些，因此被任意地設(shè)計成“正常的”或“野生型”基因形式。“烷基”指包含碳和氫的完全飽和的單價基，其可為支鏈的、直鏈的或環(huán)狀的(環(huán)烷基)。烷基基團(tuán)的實(shí)例為甲基、乙基、正丁基、叔丁基、正庚基、異丙基、環(huán)丙基、環(huán)戊基、乙基環(huán)戊基以及環(huán)己基。通常優(yōu)選的為具有1個-6個碳原子的烷基基團(tuán)，稱為“低級烷基”，通過甲基、乙基、正丁基、異丁基、叔丁基、異戊基、正戊基以及異戊基示例。在一實(shí)施方案中，低級烷基指c1-c4烷基?！跋┗敝赴己蜌涞牟伙柡偷膯蝺r基，其可為支鏈的、直鏈的或環(huán)狀的。烯基基團(tuán)可為單不飽和的或多不飽和的。通常優(yōu)選的是具有1個-6個碳原子的烯基基團(tuán)，稱為“低級烯基”?！叭不敝赴?個-18個碳的不飽和的直鏈或支鏈的烴基，其包含至少一個碳與碳的三鍵。實(shí)例包括但不限于乙炔基、丙炔基、異丙炔基、丁炔基、異丁炔基、叔丁炔基、戊炔基以及己炔基。術(shù)語“低級炔基”指如本文所確定的包含2個-8個碳的炔基基團(tuán)?！碍h(huán)烷基”指單個的或多個的環(huán)狀的烷基。實(shí)例包括但不限于環(huán)丁基、環(huán)戊基、環(huán)己基、環(huán)庚基以及環(huán)辛基?！胺蓟敝溉〈幕蛭慈〈膯蝺r的芳基，通常具有單環(huán)(例如苯基)或兩個縮合的環(huán)(例如萘基)。該術(shù)語包括雜環(huán)芳基基團(tuán)，其為環(huán)中具有一個或多個氮、氧或硫原子的芳香環(huán)基團(tuán)，諸如呋喃基、吡咯基以及吲哚基。本文所用的“取代的”意指芳基中一個或多個環(huán)上的氫被諸如氟、氯或溴的鹵化物替換；被包含一個或兩個碳原子的低級烷基替換；被硝基、氨基、甲氨基、二甲氨基、甲氧基、鹵代甲氧基、鹵代甲基或鹵代乙基替換。優(yōu)選的取代基包括鹵素、甲基、乙基以及甲氧基。通常優(yōu)選的是具有單環(huán)的芳基?！胺纪榛敝竿榛瑑?yōu)選低級的(c1-c4，更優(yōu)選c1-c2)烷基，其進(jìn)一步地被芳基所取代；實(shí)例為芐基(ch2c6h5)以及苯乙基(-ch2ch2c6h5)。“硫代烷氧基”指通式-src的基，其中rc為如本文所定義的烷基基團(tuán)。術(shù)語“低級硫代烷氧基”指如本文所定義的包含1個-8個碳的烷氧基?！巴檠趸敝竿ㄊ?orda的基，其中rd為如本文所定義的烷基。術(shù)語“低級烷氧基”指如本文所定義的包含1個-8個碳的烷氧基。烷氧基的實(shí)例包括但不限于甲氧基和乙氧基?！巴檠趸榛敝溉我槐煌檠趸〈耐榛！棒驶敝?c(＝o)-基?！半呋敝竓2n(c＝nh2)ch-基?！鞍被敝?nh2基?！巴榘被敝竿ㄊ?nhrd或-nrdrd基，其中每個rd獨(dú)立地為如本文所定義的烷基。術(shù)語“低級烷氨基”指如本文所定義的包含1個-8個碳的烷氨基?！半s環(huán)”意指5-7元單價的或7-10元雙價的雜環(huán)，其為飽和的、不飽和的或芳香族的，并且其包含1個-4個雜原子，該雜原子獨(dú)立地選自氮、氧和硫，其中氮和硫雜原子可為任選地氧化的，并且氮雜原子可為任選地季胺化，其包括任一以上的雜環(huán)其中的雙環(huán)與苯環(huán)融合。雜環(huán)可經(jīng)由任一雜原子或碳原子被附加。優(yōu)選地，環(huán)原子包括3個-6個碳原子。此類雜環(huán)包括，例如吡咯烷、哌啶、哌嗪以及嗎啉。雜環(huán)包括如下文所定義的雜環(huán)芳基。因此，除了下文所列的雜環(huán)芳基以外，雜環(huán)還包括嗎啉基、吡咯烷酮基、吡咯烷基、哌啶基、哌嗪基、乙內(nèi)酰脲基、戊內(nèi)酰胺基、環(huán)氧乙烷基、氧雜環(huán)丁烷基、四氫呋喃基、四氫吡喃基、四氫嘧啶基、四氫噻喃基等?！半s環(huán)芳基”意指5-10元芳香族雜環(huán)并且具有至少一個選自氮、氧和硫的雜原子，包含至少1個碳原子，包括單環(huán)和雙環(huán)系統(tǒng)。代表性的雜環(huán)芳基為吡啶基、呋喃基、苯并呋喃基、苯硫基、苯并噻吩基、噻啉基、吡咯基、吲哚基、噁唑基、苯并噁唑基、咪唑基、苯并咪唑基、噻唑基、苯并噻唑基、異噁唑基、吡唑基、異噻唑基、噠嗪基、嘧啶基、吡嗪基、三嗪基、噌啉基、酞嗪基以及噻唑啉基。就烷基、烯基、芳基、芳烷基或烷芳基而言，術(shù)語“取代的”指用含雜原子的取代基替換氫原子，諸如，例如鹵素、羥基、烷氧基、巰基、烷巰基、氨基、烷氨基、亞氨基、含氧基(酮基)、硝基、氰基、或各種的酸或酯諸如羧基、磺酸或膦酸。特別地就烷基、烷氧基、硫代烷氧基或烷氨基而言，術(shù)語“取代的”指用含雜原子的取代基替換碳上的氫原子，諸如，例如鹵素、羥基、烷氧基、巰基、烷巰基、氨基、烷氨基、亞胺基、含氧基(酮基)、硝基、氰基、或各種的酸或酯諸如羧基、磺酸或膦酸。它也可以指用烷基、羰基或其他的含碳的基團(tuán)。在某些實(shí)施方案中，術(shù)語“任選地取代的烷基”、“任選地取代的烯基”、“任選地取代的烷氧基”、“任選地取代的硫代烷氧基”、“任選地取代的烷基氨基”、“任選地取代的低級烷基”、“任選地取代的低級烯基”、“任選地取代的低級烷氧基”、“任選地取代的低級硫代烷氧基”、“任選地取代的低級烷氨基”以及“任選地取代的雜環(huán)基”意指，當(dāng)被取代時，至少一個氫原子被取代基替換。在含氧取代基(＝0)的情況下，兩個氫原子被替換。就這一點(diǎn)而言，取代基包括：氘、任選地取代的烷基、任選地取代的烯基、任選地取代的炔基、任選地取代的芳基、任選地取代的雜環(huán)、任選地取代的環(huán)烷基、含氧基、鹵素、-cn、-orx、nrxry、nrxc(＝o)ry、nrxso2ry、-nrxc(＝o)nrxry、c(＝o)rx、c(＝o)orx、c(＝o)nrxry、-somrx以及-somnrxry，其中m為0,1或2，rx和ry為相同的或不同的，并且獨(dú)立地氫、任選地取代的烷基、任選地取代的烯基、任選地取代的炔基、任選地取代的芳基、任選地取代的雜環(huán)或任選地取代的環(huán)烷基并且所述的每個任選地取代的烷基、任選地取代的烯基、任選地取代的炔基、任選地取代的芳基、任選地取代的雜環(huán)并且任選地取代的環(huán)烷基取代基還可以被一個或多個含氧基、鹵素、-cn、-orx、nrxry、nrxc(＝o)ry、nrxso2ry、-nrxc(＝o)nrxry、c(＝o)rx、c(＝o)orx、c(＝o)nrxry、-somrx以及-somnrxry。能夠抑制流感病毒基因組復(fù)制的靶向序列的選擇如下文所討論的。靶病毒本發(fā)明的實(shí)施方案基于，部分地，以下發(fā)現(xiàn)：單鏈的、節(jié)段的、負(fù)義的rna病毒能夠通過將感染流感病毒的動物暴露于反義寡核苷酸化合物而獲得有效抑制，該反義寡核苷酸化合物(i)靶向1)負(fù)義的病毒rna的5’或3’末端的25個堿基；2)正義的mrna的5’或3’末端的末端30個堿基；3)病毒mrna的aug起始密碼子周圍的45個堿基，和/或；4)受到選擇性剪接的流感病毒mrna的剪接供體或受體位點(diǎn)周圍的50個堿基以及(ii)具有允許反義化合物與宿主細(xì)胞內(nèi)的病毒有效地相互作用的生理和藥代動力學(xué)特征。某些實(shí)施方案靶向具有(i)單鏈的，(ii)節(jié)段的以及(iii)負(fù)極性的rna病毒。靶向病毒還合成兩種不同的帶有正極性的負(fù)義的病毒體rna(vrna)基因組的互補(bǔ)版本：1)用作負(fù)義病毒體rna復(fù)制的模板的crna，以及2)用于病毒蛋白翻譯的互補(bǔ)的正義的rna(mrna)。圖3為顯示這些不同的rna種類和本發(fā)明中所述的反義pmo的靶標(biāo)定位的示例性示意圖。靶向病毒家族包括正黏液病毒(orthomyxoviridae)科的成員，其包括甲型流感病毒、乙型流感病毒以及丙型流感病毒屬。例如在教科書humanvirology,r.belshe,ed.,2ndedition,mosby,1991,attheuniversalvirusdatabaseoftheinternationalcommitteeontaxonomyofviruses(www.ncbi.nlm.nih.gov/ictvdb/index.htm)和人類病毒學(xué)教科書(例如見(straussandstrauss2002))可以找到正黏液病毒科的成員的各種物理學(xué)的、形態(tài)學(xué)的以及生物學(xué)的特征。正黏液病毒科病毒的一些關(guān)鍵的生物學(xué)特征如下文所述。甲型流感病毒、乙型流感病毒以及丙型流感病毒分別為甲型流感病毒、乙型流感病毒以及丙型流感病毒屬的唯一成員。這些病毒為膜包裹的病毒，它們的基因組為rna的節(jié)段的負(fù)義(負(fù)的)鏈((-)rna)。10個流感病毒基因存在于甲型與乙型株的單鏈的rna的8個節(jié)段，丙型株的7個節(jié)段上。節(jié)段大小不同(890個-2341個核苷酸長度)并且每個都是用于不同的mrna合成的模板。流感病毒病毒體包含從這些模板合成mrna所必需的病毒特異的核糖核酸聚合酶(rnapolymerases)，并且缺少此類特異的聚合酶時，流感病毒rna的負(fù)鏈沒有感染性。當(dāng)流感病毒mrna聚合酶從細(xì)胞的mrna或mrna前體的5’末端減少12個-15個核苷酸，并且使用借來的寡核苷酸作為引物時，mrna轉(zhuǎn)錄的啟動發(fā)生。該過程被稱為“帽搶(cap-snatching)”，因?yàn)樗紦?jù)了病毒mrna上的5’帽結(jié)構(gòu)。通常，mrna完成該過程編碼唯一的蛋白。m基因與ns基因病毒rna節(jié)段也編碼用于剪接mrna，這導(dǎo)致了產(chǎn)生兩個不同的蛋白用于這兩個節(jié)段的每個。流感病毒rna的復(fù)制發(fā)生在細(xì)胞核中并且涉及三種不同rna的合成。該過程的示意圖顯示于圖3中。初始細(xì)胞感染后，負(fù)鏈病毒體rna(vrna)被轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞核，該細(xì)胞核為利用通過來源于去帽的細(xì)胞的前體信使rna(pre-mrna)分子(即帽搶(cap-snatching))的編碼病毒的酶所裂解的5’末端的10個-13個核苷酸引物合成注定用于翻譯的rna(mrna)之處。每個mrna的合成繼續(xù)靠近基因組節(jié)段的末端，在該處遇到寡聚(u)延伸以及添加多聚(a)尾。專用的病毒mrna被轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞質(zhì)用于翻譯并且在充足的病毒蛋白被轉(zhuǎn)運(yùn)后回到細(xì)胞核后，啟動注定用于初期病毒體的vrna的合成。合成vrna的精確的抗基因組拷貝(成為crna)，其為基因組vrna的完美的互補(bǔ)并且用作用于新的vrna產(chǎn)生的模板。流感病毒復(fù)制期間所合成的不同rna示意性地顯示于圖3中。用于代表甲型流感病毒基因組節(jié)段的示例性病毒核酸靶序列的genbank登錄號列舉在下文的表1中。表1中的核苷酸序列號碼來源于針對正鏈rna的genbank登錄號。應(yīng)理解的是這些序列只是正黏液病毒科中其他序列的例證，這可能從文獻(xiàn)或?qū)＠Y源的可獲得的基因-序列數(shù)據(jù)庫中為可獲得的。鑒定為seqidno:l-11的下文的序列，也列舉在本說明書最后的序列表中。表1列舉了針對甲型流感病毒基因的靶標(biāo)，基因組節(jié)段7所編碼的m1與m2。表1中的靶序列代表：1)負(fù)義病毒rna(seqidno:4)的3’末端的25個堿基；2)正義mrna(seqidno:3)的5’末端的末端25個堿基；3)指示的流感病毒基因(seqidno:2)的aug起始密碼子周圍的45個堿基。所示的序列為5’-3’方向的正鏈(即抗基因組的或mrna)序列，除了seqidno:4以外，其為負(fù)鏈序列(即基因組的或病毒體rna)。很明顯地是當(dāng)靶標(biāo)為負(fù)鏈vrna時，靶向序列為表1中所列的序列的互補(bǔ)，除非另有說明，例如seqidno:4。m1與m2蛋白各自為病毒基質(zhì)蛋白和離子通道活性的組分。這兩種蛋白產(chǎn)生于利用相同的aug起始位點(diǎn)的vcrna節(jié)段7的選擇性剪接形式。m2蛋白為兩種當(dāng)前的抗流感病毒療法，金剛烷胺(amantadine)與金剛烷乙胺(rimantadine)的靶標(biāo)。m1/m2基因的用于aug起始密碼子區(qū)域(-20-+25相對于aug起始密碼子)的示例性靶序列表示為seqidno:2，其為列為seqidno:1的末端的60個核苷酸區(qū)域的子序列。m1/m2節(jié)段的3’末端的靶序列(25個核苷酸)表示為seqidno:3，其也是末端的60個核苷酸區(qū)域的子序列并且能夠靶向節(jié)段的正鏈(vcrna)與負(fù)鏈(vrna)。5’末端的序列(seqidno:3)可以成功地靶向如下文所示的seqidno:4的負(fù)鏈。seqidno:1-4來自于2009hin1病毒(s-oiv)并且衍生于病毒的示例性分離，該病毒可在genbank數(shù)據(jù)庫中登錄號gq332646下找到。其他參照的甲型流感病毒亞型的5’末端的60個核苷酸區(qū)域列舉于表1中，針對h1n1,h5n1,h3n2以及h2n2，分別為seqidno:5,6,7,8。利用上文所述的指導(dǎo)，相應(yīng)的aug和末端的靶區(qū)域可衍生于這些病毒序列。將m1/m2節(jié)段的剪接供體及受體區(qū)域作為靶標(biāo)也是可能的。剪接供體及剪接受體位點(diǎn)分別位于核苷酸51和740。關(guān)注利用本發(fā)明的反義化合物靶向于任一剪接點(diǎn)。而且，利用適當(dāng)?shù)卦O(shè)計的反義化合物(例如seqidno:12-16以及19-22)阻斷aug起始位點(diǎn)和剪接供體位點(diǎn)是可能的。下文顯示了針對2009h1n1(s-oiv)亞型的作為seqidno:10的剪接受體靶區(qū)域。針對h5n1亞型的相應(yīng)區(qū)域作為seqidno:9列舉于表1中，而且，應(yīng)關(guān)注的是利用本發(fā)明的化合物可以靶向于任一m1/m2節(jié)段的翻譯敏感的、剪接敏感的或復(fù)制敏感的區(qū)域。針對原型的h1n1亞型(puertorico/8/34)的參照的m1/m2(節(jié)段7)序列作為seqidno:11顯示于表1中，并且可以在genbank參照序列數(shù)據(jù)庫nc_002016下找到。相應(yīng)的m1/m2節(jié)段序列可自公眾可獲得的序列數(shù)據(jù)庫獲取。應(yīng)關(guān)注的是本發(fā)明的反義化合物可靶向于該節(jié)段的其他區(qū)域，期待可以鑒定額外的翻譯、剪接和/或復(fù)制敏感的靶區(qū)域。表1：示例性的流感病毒核酸靶序列圖4a顯示了來自于重要的甲型流感病毒亞型：h1n1,hlnl(s-oiv),h5n1,h3n2,h9n2以及h7n7的m1/m2節(jié)段的5’末端的60個核苷酸的保守。圖4b顯示了流感病毒的一個重要的血清型，h1n1(2009)，也稱為豬源性的甲型流感病毒(s-oiv)中的針對基于基因組序列的ncbi流感病毒數(shù)據(jù)庫的優(yōu)選的pmo(m1/m2-aug；seqidno:12)的每個堿基的靶序列的保守(baoy.,p.bolotov,d.dernovoy,b.kiryutin,l.zaslavsky,t.tatusova,j.ostell,andd.lipman.theinfluenzavirusresourceatthenationalcenterforbiotechnologyinformation.j.virol.2008jan；82(2):596-601)。大寫字母表示靶堿基并且緊挨著堿基的下標(biāo)表示如上述的序列所表示的，針對數(shù)據(jù)庫中h1n1(2009)分離的那個堿基的保守百分比。這些數(shù)據(jù)表明針對用于h1n1(2009)的m1/m2-aug靶標(biāo)，沒有堿基位顯示出任何有意義的變異。在某些實(shí)施方案中，反義靶向序列被設(shè)計為與表1中所列舉的一個或多個靶序列的區(qū)域雜交。挑選的反義靶向序列可以制造得短一些，例如約12個堿基，或更長，例如約40個堿基，并且包括少量的錯配，只要序列充分地互補(bǔ)以影響與靶標(biāo)雜交并且與病毒的rna形成具有45℃或更高的tm的異源雙鏈體的翻譯的、剪接和/或復(fù)制抑制。在某些實(shí)施方案中，靶標(biāo)與反義靶向序列間的互補(bǔ)性的程度足以形成穩(wěn)定的雙鏈體。反義寡聚物與靶rna序列的互補(bǔ)性區(qū)域可短至8個-11個堿基，但是優(yōu)選12個-15個堿基或更多，例如12個-20個堿基或12個-25個堿基，包括這些范圍間所有的整數(shù)。約14個-15個堿基的反義寡聚物通常足夠長以具有病毒基因組中唯一的互補(bǔ)序列。在某些實(shí)施方案中，要求互補(bǔ)堿基的最小長度以實(shí)現(xiàn)如下文所討論的必需的結(jié)合tm。在某些實(shí)施方案中，長至40個堿基的寡聚物可能是適合的，其中至少最小數(shù)量的堿基，例如10個-12個堿基，與靶序列互補(bǔ)。然后，通常細(xì)胞中促進(jìn)或主動攝取最佳的是寡聚物長度小于約30個堿基。就下文進(jìn)一步所述的pmo寡聚物而言，結(jié)合穩(wěn)定性與攝取的最佳的平衡發(fā)生在18個-25個堿基的長度。包括在內(nèi)有反義寡聚物(例如pna，lna，2’-ome)以及由約10個,11個,12個,13個,14個,15個,16個,17個,18個,19個,20個,21個,22個,23個,24個,25個,26個,27個,28個,29個,30個,31個,32個,33個,34個,35個,36個,37個,38個,39個或40個堿基組成的pmo寡聚物，其中至少約6個,8個,9個,10個,11個,12個,13個,14個,15個,16個,17個,18個,19個,20個,21個,22個,23個,24個,25個,26個,27個,28個,29個,30個,31個,32個,33個,34個,35個,36個,37個,38個,39個或40個連續(xù)的或非連續(xù)堿基與seqidno:1-11或其變體的靶序列互補(bǔ)。在某些實(shí)施方案中，反義寡聚物可與病毒核酸靶序列100％互補(bǔ)，或例如它可以包括錯配以適應(yīng)變體，只要寡聚物與病毒核酸靶序列間形成的異源雙鏈體足夠穩(wěn)定以耐受細(xì)胞核酸酶的作用以及可能發(fā)生在體內(nèi)的其他的降解模式。下文討論了不易受核酸酶裂解的寡聚物主鏈。錯配，如果存在，對雜交雙鏈體的末端區(qū)域比中間區(qū)域的不穩(wěn)定更小。所允許的錯配的數(shù)量取決于寡聚物的長度、雙鏈體中g(shù):c堿基對的百分比以及錯配在雙鏈體中的位置，根據(jù)易懂的雙鏈體穩(wěn)定性的原理。盡管此類反義寡聚物未必與病毒核酸靶序列100％互補(bǔ)，但是它對穩(wěn)定地及特異性結(jié)合靶序列是有效的，從而使得核酸靶標(biāo)的生物學(xué)活性，例如病毒蛋白的表達(dá)，被調(diào)整。寡聚物與靶序列間形成的雙鏈體的穩(wěn)定性為結(jié)合tm的功能以及雙鏈體對細(xì)胞酶裂解的敏感性。就互補(bǔ)的序列rna而言，可通過常規(guī)方法，諸如hamesetal,nucleicacidhybridization,irlpress,1985,pp.107-108所描述的那些或如miyadac.g.andwallacer.b.,1987,oligonucleotidehybridizationtechniques,methodsenzymol.vol.154pp.94-107中所描述的，測量反義化合物的tm。在某些實(shí)施方案中，就互補(bǔ)的序列rna而言，反義寡聚物可具有比體溫高的結(jié)合的tm，并且優(yōu)選高于約45℃或50℃。優(yōu)選處于60-80℃范圍或更高的tm，根據(jù)熟知的原理，就基于互補(bǔ)的rna雜交而言，可通過增加雙鏈體中c:g配對的堿基的比率和/或通過增加異源雙鏈體的長度(堿基對)增長寡聚物化合物的tm。同時，出于使細(xì)胞攝取最佳化的目的，限制寡聚物的大小應(yīng)是有利的。因此，顯示在25個堿基或更小的長度上高tm(45-50℃或更高的)的化合物通常優(yōu)選越過要求針對高tm值大于25個堿基那些。在某些實(shí)施方案中，諸如pmo寡聚物，可通過利用如圖1b中示例的不帶電荷的與陽離子的磷二酰胺的混合物增強(qiáng)寡聚物的反義活性。寡聚物中陽離子鍵的總數(shù)可自1-10(包括在中間所有的整數(shù))變化，并且可在寡聚物各處插入。優(yōu)選地，帶電荷的鍵的數(shù)量為至少2個并且不超過全部主鏈鍵的一半，例如在2個、3個、4個、5個、6個、7個或8個帶正電荷的鍵間，并且優(yōu)選通過至少1個、2個、3個、4個或5個不帶電荷的鍵沿著主鏈分隔每個帶電荷的鍵?？赏ㄟ^將寡聚物靶區(qū)域與5’末端報告基因(例如螢火蟲熒光素酶)融合在體外，然后測量融合基因mrna轉(zhuǎn)錄在無細(xì)胞翻譯測定中的翻譯的抑制測量各種寡聚物的反義活性。包含不帶電荷的與陽離子的鍵的混合物的寡聚物的抑制特性在無細(xì)胞翻譯測定中可增強(qiáng)大約5-100倍。優(yōu)選的本發(fā)明的反義寡聚物(m1/m2-aug)顯示為下文表2中seqidno:13，其以包含如圖1b和圖2中所例證的三種陽離子鍵，遍及寡聚物插入的形式呈現(xiàn)。靶向于m1/m2aug并且包含三個插入的陽離子鍵的一系列示例性反義寡聚物顯示為seqidno:34-47。下文的表2顯示了與甲型流感病毒互補(bǔ)的5’-3’方向的示例性靶向序列。所列舉的序列提供了一批靶向序列，根據(jù)上文所討論的常規(guī)分類規(guī)則，可自其中選擇靶向序列。盡管所列舉的靶向序列可用于任何反義對應(yīng)寡核苷酸化學(xué)(例如pna、lna或2’-ome)，表2中的序列優(yōu)選用作pmo反義寡聚物。seqidno:12-22,25-29以及34-47與病毒的正鏈(mrna或vcrna)反義而seqidno:23和24與負(fù)鏈(vrna)反義。因此，例如在選擇靶向m1/m2編碼節(jié)段(甲型流感病毒的節(jié)段7)的負(fù)鏈的3’末端中，可以選擇seqidno:4或有效阻斷負(fù)鏈的3’末端的功能的序列的一部分。seqidno:12-29以及34-47靶向甲型流感病毒亞型h1n1(s-oiv)的m1/m2節(jié)段而seqidno:30-33靶向如所示的pb1或np節(jié)段。表2.示例性反義靶向序列反義寡核苷酸化合物如上文詳述的，反義寡核苷酸(術(shù)語“反義”指靶向病毒的正義鏈rna或負(fù)義或負(fù)鏈的化合物)通常包含靶向于區(qū)域的堿基序列，該區(qū)域包括下列的一個或多個：1)負(fù)義病毒rna的5’或3’末端的25個堿基；2)正義vcrna的5’或3’末端的末端30個堿基；3)病毒mrna的aug起始密碼子周圍的45個堿基，和/或4)受到選擇性剪接的流感病毒mrna的剪接供體或受體位點(diǎn)周圍的50個堿基。另外，當(dāng)將其給予宿主細(xì)胞，例如，在受感染的哺乳動物個體中時，寡聚物能夠，諸如通過降低靶蛋白表達(dá)(例如m1或m2或兩者)，通過減少病毒復(fù)制，或通過降低靶蛋白表達(dá)(例如m1或m2或兩者)以及減少病毒復(fù)制有效地靶向感染病毒。當(dāng)寡聚物化合物(a)具有被哺乳動物細(xì)胞主動攝取的能力，和(b)一旦被攝取，就與靶rna形成帶有高于約45℃的tm的雙鏈體時，通常就滿足該要求。在某些實(shí)施方案中，寡聚物主鏈可基本上不帶電荷的，并且優(yōu)選可被公認(rèn)為是用于活化或促進(jìn)穿過細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)的基質(zhì)。寡聚物與靶rna形成穩(wěn)定的雙鏈體的能力也與寡聚物主鏈的其他特征有關(guān)，其包括就靶標(biāo)而言反義寡聚物的互補(bǔ)性的長度和程度，g:c與a:t堿基匹配的比率以及任一錯配的堿基的位置。反義寡聚物耐細(xì)胞核酸酶的能力可促進(jìn)存活以及制劑至細(xì)胞質(zhì)的最終的遞送。利用pmo主鏈化學(xué)，本發(fā)明的示例性反義寡聚物靶向序列列舉于上文的表2中。利用可選擇的化學(xué)方法，靶向序列列舉于下文的表3和4，分別用于pna和lna化學(xué)方法。通常，由于它們與pmo和2’o-me寡聚物比較有相對高的靶標(biāo)結(jié)合能力，pna和lna化學(xué)方法利用更短的靶向寡聚物。肽核酸(pna)為dna的對應(yīng)物，其中主鏈在結(jié)構(gòu)上與脫氧核糖主鏈同型，由n-(2-氨乙基)甘氨酸單元組成，嘧啶或嘌呤堿基附加于其上。包含天然的嘧啶與嘌呤堿基的pna服從沃森-克里克堿基配對規(guī)則與互補(bǔ)的寡核苷酸雜交以及在堿基配對識別方面模擬dna(egholm,buchardtetal.1993)。pna的主鏈通過肽鍵而不是磷酸二酯鍵所形成，這使得它們非常適于反義應(yīng)用(見下文的結(jié)構(gòu))。主鏈為不帶電荷的，這導(dǎo)致pna/dna或pna/rna雙鏈體展現(xiàn)出比正常的熱穩(wěn)定性更高。pna不被核酸酶或蛋白酶所識別?？衫帽绢I(lǐng)域中已知的技術(shù)合成地產(chǎn)生pna。pna為dna對應(yīng)物，其中聚酰胺主鏈取代了dna傳統(tǒng)的磷酸核糖環(huán)，如下文所例證的。盡管存在著基團(tuán)結(jié)構(gòu)與天然的結(jié)構(gòu)的變化，但是pna在雙鏈形式中能夠序列特異地結(jié)合dna或rna。pna的特征包括與互補(bǔ)的dna或rna的高結(jié)合親和力，單個的堿基錯配所引起的不穩(wěn)定效應(yīng)，耐核酸酶和蛋白酶，與dna或rna不依賴于鹽濃度的雜交以及與同型dna所形成的三鏈體。panagenetm已研發(fā)了它的btspna單體(bts；苯并噻唑-2-磺?；?的發(fā)明專利以及寡聚過程的發(fā)明專利。利用btspna單體的pna寡聚過程由脫保護(hù)、連接以及帽化的重復(fù)循環(huán)組成。該技術(shù)的示例性發(fā)明專利包括美國專利申請第6,969,766,7,211,668,7,022,851,7,125,994,7,145,006以及7,179,896號。教導(dǎo)pna化合物制備的代表性美國專利包括但不限于美國專利申請第5,539,082；5,714,331；以及5,719,262號，在此通過引用將每一個并入本文。pna化合物的進(jìn)一步的教導(dǎo)可在nielsenetal,science,254:1497-1500,1991中找到。用于實(shí)踐本發(fā)明的示例性pna化合物列舉于下文的表3中。基本上可根據(jù)本文所引用的參考文獻(xiàn)中闡明的程序制備這些寡核苷酸。表3.示例性pna反義靶向序列本發(fā)明的寡核苷酸化合物也可包含“鎖核酸”亞基(lna)。lna的結(jié)構(gòu)可在，例如wengel,etal,chemicalcommunications(1998)455；tetrahedron(1998)54:3607和accountsofchem.research(1999)32:301)；obika,etal.,tetrahedronletters(1997)38:8735；(1998)39:5401以及bioorganicmedicinalchemistry(2008)16:9230中找到。非限制的示例性lna結(jié)構(gòu)如下文所例證：本發(fā)明的化合物可包含一個或多個lna；在一些情況下，化合物可完全地由lna組成。用于合成單獨(dú)的lna核苷亞基以及它們整合到寡核苷酸的方法是本領(lǐng)域中已知的：美國專利申請第7,572,582,7,569,575,7,084,125,7,060,809,7,053,207,7,034,133,6,794,499以及6,670,461號。典型的亞基間鍵包括磷酸二酯和硫代磷酸部分；可選擇地，可應(yīng)用含非磷的鍵。優(yōu)選的實(shí)施方案為包含其中每個lna亞基被dna亞基分隔的化合物的lna。還優(yōu)選的化合物由交互的lna與dna亞基組成，其中亞基間鍵為硫代磷酸的?；旧细鶕?jù)上文所引用的參考文獻(xiàn)中闡明的程序制備下列的化合物。包含lna亞基(lna為大寫的，dna為小寫的并且序列讀取為5’-3’)的示例性化合物顯示于下列的表4中。表4.示例性lna反義靶向序列優(yōu)選的寡聚物結(jié)構(gòu)應(yīng)用通過如上文所述的不帶電荷的鍵連接的產(chǎn)生堿基配對部分的基于嗎啉基的亞基。特別優(yōu)選的為基本上不帶電荷的磷二酰胺連接的嗎啉基寡聚物。嗎啉基寡核苷酸，其包括反義寡聚物，例如詳述于共同擁有的美國專利申請第5,698,685,5,217,866,5,142,047,5,034,506,5,166,315,5,185,444,5,521,063以及5,506,337號和pct申請us2008/012804號，在此通過引用將所有的專利申請清楚地并入?；趩徇鴣喕哪承┨匦园ǎ和ㄟ^穩(wěn)定的、不帶電荷的主鏈鍵被連接在寡聚物形式中的能力；支持核苷酸堿基(例如腺嘌呤、胞嘧啶、鳥嘌呤或尿嘧啶)的能力從而使得所形成的多聚物可以與互補(bǔ)堿基的靶核酸雜交，其包括具有高tm，甚至短至10個-14個堿基的寡聚物的靶rna；寡聚物被主動轉(zhuǎn)運(yùn)至哺乳動物細(xì)胞的能力；以及寡聚物：rna異源雙鏈體耐受核糖核酸酶降解的能力。具有含磷的主鏈鍵的嗎啉基寡核苷酸的實(shí)例例證于圖1a-1c。特別優(yōu)選的是磷二酰胺連接的嗎啉基寡核苷酸，如圖1b中所示，其根據(jù)本發(fā)明的一方面，被修飾以包含位于優(yōu)選地10％-15％它的主鏈鍵上的帶正電荷的基團(tuán)，包括例如反義寡核苷酸詳述于(summertonandweller,1997)以及共同擁有的美國專利申請第5,698,685,5,217,866,5,142,047,5,034,506,5,166,315,5,185,444,5,521,063和5,506,337號，pct申請第us2008/012804號，所有這些通過引用并入。帶有帶電荷的主鏈鍵和/或修飾的末端基團(tuán)的包括反義寡核苷酸的示例性嗎啉基寡核苷酸，詳述于pct專利申請us2007/011435號，未決的美國臨時專利申請61/349,783號以及未決的美國臨時專利申請61/361,878號，在此通過引用將每一個全文并入。基于嗎啉基的亞基的特性包括：1)通過穩(wěn)定的、不帶電荷的或帶正電荷的主鏈鏈連接在寡聚物形式的能力；2)支持核苷酸堿基(例如腺嘌呤、胞嘧啶、鳥嘌呤、胸腺嘧啶、尿嘧啶以及次黃嘌呤)的能力從而使得所形成的多聚物可以與互補(bǔ)堿基的靶核酸雜交，包括靶rna、相對短的寡核苷酸(例如10個-15個堿基)中高于約45℃的tm值；3)寡核苷酸被主動或被動地轉(zhuǎn)運(yùn)到哺乳動物細(xì)胞的能力；以及4)反義寡核苷酸：rna異源雙鏈體分別耐受核糖核酸酶和核糖核酸酶降解的能力。用于所要求主題的反義寡核苷酸的示例性主鏈結(jié)構(gòu)包括圖1d-1g中所示的嗎啉亞基類型，其每個都通過不帶電荷的或帶正電荷的含磷的亞基鍵連接。圖1d顯示了含磷的鍵，其形成了五個原子重復(fù)單元的主鏈，其中嗎啉基環(huán)通過1-原子磷酰胺鍵連接。圖1e顯示了產(chǎn)生6-原子重復(fù)單元主鏈的鍵。在該結(jié)構(gòu)中，連接5’嗎啉基碳至磷酸基團(tuán)的原子y可為硫、氮、碳或優(yōu)選地氧。來自于磷的x部分懸垂可為氟、烷基或取代的烷基、烷氧基或取代的烷氧基、硫代烷氧基或取代的硫代烷氧基、或未取代的、單取代的或雙取代的氮，其包括環(huán)狀結(jié)構(gòu)，諸如嗎啉或哌啶。烷基、烷氧基以及硫代烷氧基優(yōu)選地包括1個-6個碳原子。z部分為硫或氧，并且優(yōu)選氧。圖1f和1g中所示的鍵為設(shè)計用于7-原子單元-長度的主鏈。結(jié)構(gòu)1f中，x部分為如結(jié)構(gòu)1e中，并且y部分可為亞甲基、硫或優(yōu)選地氧。結(jié)構(gòu)1g中，x與y部分為如結(jié)構(gòu)1e中。特別優(yōu)選的嗎啉基寡核苷酸包括由圖1e中所示的形式的嗎啉亞基結(jié)構(gòu)組成的那些，其中x＝nh2、n(ch3)2或1-哌嗪或其他的帶電荷的基團(tuán)，y＝0，并且z＝0。如上所述，根據(jù)本發(fā)明的一方面，基本上不帶電荷的寡核苷酸可被修飾以包括帶電荷的鍵，例如多達(dá)約1個/每2個-5個不帶電荷的鍵，諸如約4-5個/每10個不帶電荷的鍵。在某些實(shí)施方案中，當(dāng)約25％主鏈鍵為陽離子的時，可見到反義活性的最佳的改進(jìn)。在某些實(shí)施方案中，可見到帶有少量，例如10-20％陽離子的鍵或其中陽離子鍵的數(shù)量在50-80％范圍內(nèi)，諸如約60％的增強(qiáng)。額外進(jìn)行的支持本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)表明所見到的帶有附加的陽離子的主鏈電荷可，在一些情況下，通過分配靠近反義寡核苷酸的“中心區(qū)”主鏈鍵的大多數(shù)電荷，例如在帶有8個陽離子的主鏈鍵的20個單體的寡核苷酸中，具有集中于10個最里面的鍵的至少70％這些帶電荷的鍵，進(jìn)一步地增強(qiáng)。在某些實(shí)施方案中，可通過逐步地固相合成，應(yīng)用上文所引用的參考文獻(xiàn)中詳述的方法以及下文關(guān)于具有混合物或不帶電荷的和陽離子的主鏈鍵的寡核苷酸的合成制備反義化合物。在一些情況下，理想的是添加額外的化學(xué)部分至反義化合物，例如以增強(qiáng)藥代動力學(xué)或促進(jìn)化合物的捕獲或檢測。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)的合成方法，此類部分通?？晒矁r附加至寡聚物的末端。例如，聚乙二醇部分或其他的親水聚合物例如一個具有10個-100個單體的亞基的添加可用于增加溶解度。一個或多個帶電荷的基團(tuán)，例如陰離子的帶電荷的基團(tuán)諸如有機(jī)酸，可增強(qiáng)細(xì)胞攝取。報告基因部分，諸如熒光素或放射性標(biāo)記的基團(tuán)，可出于檢測的目的而被附加其上。可選擇地，附加于寡聚物的報告基因標(biāo)記可為配體，諸如抗原或生物素，能夠結(jié)合標(biāo)記的抗體或鏈霉親和素。在選擇用于反義化合物附加或修飾的部分中，通常理想的是選擇為生物相容性的并且很可能被沒有不良副作用的個體所耐受的基團(tuán)的化學(xué)化合物。如上文所述，某些反義化合物可被構(gòu)建成包含精選數(shù)量的被上文所述類型的不帶電荷的鍵插入的陽離子鍵。亞基間鍵，不帶電荷的和陽離子的，優(yōu)選為含磷的鍵，其具有以下結(jié)構(gòu)：其中w為s或o，并且優(yōu)選為o，x＝nr1r2或or6，y＝o或nr7，以及每個所述的寡聚物中的鍵選自：(a)不帶電荷的鍵(a)，其中r1、r2、r6和r7各自獨(dú)立地為選自氫和低級烷基；(b1)陽離子鍵(b1)，其中x＝nr1r2，y＝o，并且nr1r2代表任選地取代的哌嗪基，從而使得r1r2＝-chrchrn(r3)(r4)chrchr-，其中每個r獨(dú)立地為h或ch3，r4為h、ch3或電子對，以及r3選自h、低級烷基，例如ch3、c(＝nh)nh2、z-l-nhc(＝nh)nh2和[c(o)chr'nh]mh，其中z為c(o)或直鍵，l為任選的長度達(dá)18個原子，優(yōu)選長度達(dá)12個原子并且更優(yōu)選長度達(dá)8個原子的連接體，具有選自烷基、烷氧基和烷氨基的鍵。r’為天然存在的氨基酸或其1個或2個碳同系物的側(cè)鏈，以及m為1-6，優(yōu)選1-4；(b2)陽離子鍵(b2)，其中x＝nr1r2，y＝o，r1＝h或ch3，并且r2＝lnr3r4r5，其中l(wèi)、r3和r4如上文所定義的，r5為h、低級烷基或低級(烷氧基)烷基；以及(b3)陽離子鍵(b3)，其中y＝nr7，x＝or6，r7＝lnr3r4r5，其中l(wèi)、r3、r4和r5如上文所定義的，r6為h或低級烷基；以及至少一個所述的鍵選自陽離子鍵(b1)、(b2)和(b3)。在某些實(shí)施方案中，寡聚物可包括至少兩個連續(xù)類型(a)的鍵(即不帶電荷的鍵)。在另一實(shí)施方案中，寡聚物中至少5％鍵為陽離子鍵(即類型(b1)、(b2)或(b3))；例如，10％-60％并且優(yōu)選地20-50％鍵可為陽離子鍵。在一實(shí)施方案中，至少一個鍵為類型(b1)，其中優(yōu)選地，每個r為h，r4為h、ch3或電子對，r3選自h、低級烷基，例如ch3、c(＝nh)nh2以及c(o)-l-nhc(＝nh)nh2。r3的后兩個實(shí)施方案提供了胍基部分，每個各自直接附加至哌嗪環(huán)或連接體基團(tuán)l懸垂。為了便于合成，r3中可變的z優(yōu)選如所示的c(o)(羰基)。如上文所述，連接體基團(tuán)l包含選自烷基(例如-ch2-ch2-)、烷氧基(-c-o-)以及烷氨基(例如-ch2-nh-)的主鏈中的鍵，前提條件是l中的末端原子(例如鄰近羰基或氮的那些)為碳原子。盡管支鏈鍵(例如-ch2-chch3-)是可能的，連接體優(yōu)選無支鏈的。在一實(shí)施方案中，連接體為碳?xì)浠衔镞B接體。此類連接體可具有結(jié)構(gòu)-(ch2)n-，其中n為1-12，優(yōu)選2-8并且更優(yōu)選2-6。嗎啉亞基具有結(jié)構(gòu)：其中pi為堿基配對的部分并且上文所述的鍵將(i)的氮原子連接至鄰近亞基的5’碳。堿基配對的部分pi可以為相同的或不同的，并且通常被設(shè)計為提供結(jié)合靶核酸的序列。上文(b1)、(b2)和(b3)類型的鍵的實(shí)施方案用于連接嗎啉亞基可用圖表例證如下：優(yōu)選地，所有寡聚物中的陽離子鍵為相同的類型，即所有都是類型(b1)，所有都是類型(b2)或所有都是類型(b3)。在另一實(shí)施方案中，陽離子鍵選自如下文所示的鍵(b1’)和(b1”)，其中(b1”)在本文中被稱作“pip”鍵以及(b1”)在本文中被稱作“gux”鍵：在上文的結(jié)構(gòu)中，w為s或o，并且優(yōu)選o；r1與r2均獨(dú)立地選自氫和低級烷基，并且優(yōu)選甲基；a代表氫或(b1’)和(b1”)中一個或多個碳原子上的互不干擾的取代基。優(yōu)選地，哌嗪環(huán)中的環(huán)碳原子為未取代的；然而，它們可以包括互不干擾的取代基，諸如甲基或氟。優(yōu)選地，至多一個或兩個碳原子為如此取代的。在另一實(shí)施方案中，至少10％鍵為類型(b1’)或(b1”)；例如，10％-60％并且優(yōu)選20％-50％鍵可為類型(b1’)或(b1”)。在某些實(shí)施方案中，寡聚物不包含上文類型(b1’)的鍵?？蛇x擇地，寡聚物不包含類型(b1)的鍵，其中每個r為h，r3為h或ch3并且r4為h、ch3或電子對。嗎啉亞基也可通過基于非磷的亞基間鍵連接，如下文所進(jìn)一步所述的，其中至少一個鍵被如上文所述的懸垂的陽離子基團(tuán)修飾?？墒褂闷渌墓押塑账釋?yīng)物鍵，其在它們未修飾的狀態(tài)中為不帶電荷的但是其也可帶有懸垂的胺取代基。例如，嗎啉環(huán)上的5’氮原子可應(yīng)用于磺酰胺鍵或脲鍵(其中磷分別被碳或硫替換)并且以對應(yīng)于上文結(jié)構(gòu)(b3)中5’氮原子的形式被修飾。提供了具有任何數(shù)量的陽離子鍵的寡聚物，其包括完全地陽離子連接的寡聚物。然而，優(yōu)選地，寡聚物為部分帶電荷的，例如具有10％-80％。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，約10％-60％，并且優(yōu)選20％-50％鍵為陽離子的。在一實(shí)施方案中，沿著主鏈插入陽離子鍵。部分帶電荷的寡聚物優(yōu)選包含至少兩個連續(xù)的不帶電荷的鍵；即，寡聚物優(yōu)選沿著其全長不具有嚴(yán)格的交替模式。還考慮具有陽離子鍵塊和不帶電荷的鍵塊的寡聚物。例如，不帶電荷的鍵的中心塊與陽離子鍵塊從側(cè)面連接或反之亦然。在一實(shí)施方案中，寡聚物具有大約等長5’，3’和中心區(qū)，并且中心區(qū)內(nèi)陽離子鍵的百分比大于約50％，優(yōu)選大約約70％。用于反義應(yīng)用的寡聚物通常長度范圍在約10個-約40個亞基，更優(yōu)選約10個-30個亞基并且通常為15個-25個堿基。例如，本發(fā)明的具有對于反義化合物有用的長度的19個-20個亞基的寡聚物理想地可具有2個-10個，例如4個-8個陽離子鍵以及剩余的不帶電荷的鍵。具有14個-15個亞基的寡聚物理想地可具有2個-7個，例如3個、4個或5個陽離子鍵以及剩余的不帶電荷的鍵。每個嗎啉環(huán)結(jié)構(gòu)支持堿基配對部分以形成堿基配對部分的序列，其通常設(shè)計為與細(xì)胞或被治療的個體中選擇的反義靶標(biāo)雜交。堿基配對部分可為天然dna或rna(例如a,g,c,t或u)或諸如次黃嘌呤(次黃嘌呤核苷的堿基組分)或5-甲基胞嘧啶的對應(yīng)物中找到的嘌呤或嘧啶。肽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的反義化合物可包括連接至富精氨酸肽轉(zhuǎn)運(yùn)部分的寡核苷酸，該肽轉(zhuǎn)運(yùn)部分有效增強(qiáng)化合物至細(xì)胞的轉(zhuǎn)運(yùn)。轉(zhuǎn)運(yùn)部分可附加至寡聚物的末端，例如如所示的，在圖1c中。肽轉(zhuǎn)運(yùn)部分優(yōu)選地包含6個-16個選自x’亞基、y’亞基以及z’亞基的亞基，其中(a)每個x’亞基獨(dú)立地代表賴氨酸、精氨酸或精氨酸對應(yīng)物，所述的對應(yīng)物為包含r1n＝c(nh2)r2結(jié)構(gòu)的側(cè)鏈的陽離子的氨基酸，其中r1為h或r；r2為r、nh2、nhr或nr2，其中r為低級烷基或低級烯基并且還可包括氧或氮；r1與r2可共同來自于一個環(huán)；并且側(cè)鏈經(jīng)由r1或r2連接至所述的氨基酸；(b)每個y’亞基獨(dú)立地代表中性氨基酸-c(o)-(chr)n-nh-，其中n為2-7并且每個r獨(dú)立地為h或甲基；以及(c)每個z’亞基獨(dú)立地代表具有中性烷基側(cè)鏈的氨基酸；其中肽包含被(x’y’x’)p、(x’y’)m、(x')m以及(x’z’z’)p其中之一所代表的序列，其中p為2-5并且m為2-9。某些實(shí)施方案包括各種獨(dú)立地選自(x’yx’)p、(x’y’)m、(x’)m和/或(x’z’z’)p的組合物，例如其包括具有序列(x’yx’)、(x’z’z’)、(x’y’x’)和/或(x’z’z’)(seqidno:129)的肽。在選擇的實(shí)施方案中，對每個x’而言，側(cè)鏈部分為胍基，如氨基酸亞基精氨酸(arg)中。在另一實(shí)施方案中，每個y’為-co-(ch2)n-chr-nh-，其中n為2-7并且r為h。例如，當(dāng)n為5并且r為h時，y’為6-氨基己酸亞基，本文縮寫為ahx；當(dāng)n為2并且r為h時，y’為β-丙氨酸亞基，本文縮寫為b。某些實(shí)施方案涉及具有不同中性氨基酸組合的載體肽，例如其包括包含序列-rahxrrbrrahxrrbrahxb-(seqidno:124)的肽，該肽包含β-丙氨酸和6-氨基己酸。該類型的優(yōu)選的肽包括包含被單一的y’亞基相間的精氨酸二聚物，其中y’優(yōu)選ahx。實(shí)例包括具有通式(ry’r)p或通式(rry’)p的肽，其中y’優(yōu)選ahx。在一實(shí)施方案中，y’為6-氨基己酸亞基，r為精氨酸并且p為4。某些實(shí)施方案包括各種直線的至少兩個(ry’r)p與(rry’)p的組合，例如包括具有序列(ry’r)(rry’)(ry’r)(rry’)(seqidno:130)或(rry’)(ry’r)(rry’)(seqidno:131)的例證的肽。關(guān)注其他的組合。在另一例證的實(shí)施方案中，每個z’為苯丙氨酸并且m為3或4。連接的肽優(yōu)選經(jīng)由連接體ahx-b連接至寡聚物的末端，其中ahx為6-氨基己酸亞基并且b為β-丙氨酸亞基，例如如圖1c中所示。肽與寡聚物間的可選擇的連接體包括甘氨酸和半胱氨酸。這些與相關(guān)的連接體可通過酰胺鍵或二硫鍵連接。在選擇的實(shí)施方案中，對每個x’而言，側(cè)鏈部分獨(dú)立地為選自由胍基12-氨基二氫嘧啶基、2-氨基三氫嘧啶基、2-氨基嘧啶基以及2-氨基嘧啶酮基組成的基團(tuán)，并且它優(yōu)選選自胍基和脒基。在一實(shí)施方案中，側(cè)鏈部分為胍基，如在氨基酸亞基精氨酸(arg)中。在某些實(shí)施方案中，y’亞基可為連續(xù)的，在其中x’亞基插入至y’亞基，或個別地散布在x’亞基間。在某些實(shí)施方案中，連接的亞基可在y’亞基間。在一實(shí)施方案中，y’亞基位于轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的末端；在其他的實(shí)施方案中，它們通過x’亞基從側(cè)鏈連接。在進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，每個y’為-co-(ch2)n-chr-nh-，其中n為2-7并且r為h。例如，當(dāng)n為5并且r為h時，y’為6-氨基己酸亞基，本文縮寫為ahx。在該基團(tuán)的選擇的實(shí)施方案中，每個x’包含胍基側(cè)鏈部分，如在精氨酸亞基中。該類型優(yōu)選的肽包括包含單一的y’亞基相間的精氨酸二聚物的那些，其中y’優(yōu)選ahx。實(shí)例包括具有通式(ry’r)4(seqidno:132)或通式(rry’)4(seqidno:133)的肽，其中y’優(yōu)選ahx。在后一種情況下，核酸對應(yīng)物優(yōu)選連接至末端的y’亞基，優(yōu)選位于c末端，例如如圖1c中所示。一個示例性連接體具有結(jié)構(gòu)ahxb，其中ahx為6-氨基己酸亞基并且b為β-丙氨酸亞基。可選擇的連接體包括半胱氨酸和甘氨酸。本文所述的轉(zhuǎn)運(yùn)部分已顯示了相對于在附加的轉(zhuǎn)運(yùn)部分不存在的情況下寡聚物的攝取以及相對于通過缺乏疏水性亞基y’的附加的轉(zhuǎn)運(yùn)部分，極大地增強(qiáng)附加的寡聚物進(jìn)入細(xì)胞。此類增強(qiáng)的攝取優(yōu)選被化合物至哺乳動物細(xì)胞的攝取中至少兩倍的增加并且優(yōu)選四倍的的增加，相對于通過缺乏疏水性亞基y’的附加的轉(zhuǎn)運(yùn)部分的制劑的攝取，所證實(shí)。相對于未連接的化合物，攝取優(yōu)選增強(qiáng)至少20倍，并且更優(yōu)選40倍。轉(zhuǎn)運(yùn)部分的另一個優(yōu)勢是它的穩(wěn)定反義化合物與它的靶核酸序列間雙鏈體的預(yù)期能力，大概借助帶正電荷的轉(zhuǎn)運(yùn)部分與帶負(fù)電荷的核酸間靜電相互作用。轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白中帶電荷的亞基的數(shù)量少于14個，如上文所述，并且優(yōu)選8個-11個。富精氨酸肽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的使用(即細(xì)胞穿透肽)在實(shí)踐本發(fā)明的某些實(shí)施方案中特別有用。某些肽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白已顯示出高效遞送反義化合物至包括造血細(xì)胞與肌細(xì)胞的初始細(xì)胞(marshall,odaetal.2007；jearawiriyapaisarn,moultonetal.2008；wu,moultonetal.2008)。而且，與其他的已知的諸如penetratin和tat肽的肽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白比較，本文所述的肽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，當(dāng)與反義pmo連接時，展現(xiàn)出改變幾個基因轉(zhuǎn)錄的剪接的增強(qiáng)的的能力(marshall,odaetal.2007)。這些研究中示例性肽包括p007(seqidno:118),cp04057(seqidno:123)以及cp06062(seqidno:124)。示例性肽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，包括連接體(b、ahxb、c或g)，如下文表5中所給予的。在某些實(shí)施方案中，表5中所列舉的示例性肽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白可以通過二硫鍵或酰胺鍵連接至pmo。表5.示例性肽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白肽序列(n末端至c末端)seqidno：rtatrrrqrrkkrc115r9f2grrrrrrrrrffc116r5f2r4crrrrrffrrrrc117(rahxr)4ahxb；(p007)rahxrrahxrrahxrrahxrahxb118r8crrrrrrrrc119rqcrrrrrrrrrc120r8grrrrrrrrg121r9grrrrrrrrrg122(rahxr)5ahxb(cp04057)rahxrrahxrrahxrrahxrrahxrahxb123(rahxrrbr)2ahxb；(cp06062)rahxrrbrrahxrrbrahxb124(rar)4f2crarrarrarrarffc125(rgr)4f2crgrrgrrgrrgrffc126r9f2grrrrrrrrrffg127r9f2xbrrrrrrrrrffahxb128rna干擾劑也可通過各種基于rna干擾的方法靶向于本文所述的流感病毒靶區(qū)域(例如m1、m2；seqidno:1-11)。rna干擾(rnai)為進(jìn)化上保守的基因剪接機(jī)制，最初在秀麗隱桿線蟲(nematodecaenorhabditiselegans)的研究(leeetal.，cell75：843，1993；reinhartetal.，nature403：901,2000)中發(fā)現(xiàn)。通過引入dsrna至表達(dá)適當(dāng)?shù)姆肿訖C(jī)械(molecularmachinery)的細(xì)胞，然后降解相應(yīng)的內(nèi)源性mrna而觸發(fā)rna干擾。機(jī)制涉及dsrna轉(zhuǎn)換至短的rna，該短的rna引導(dǎo)核糖核酸酶至同源的mrna靶標(biāo)(例如通過ruvkun,science2294:797,2001所總結(jié)的)。在某些實(shí)施方案中，本文所提供的方法可利用雙鏈的核糖核(dsrna)分子如調(diào)制子，用于減少流感病毒復(fù)制，諸如通過m1或m2蛋白表達(dá)干擾。dsrna通常包含兩條單一的鏈。dsrna的一條鏈包含基本上與靶基因或靶區(qū)域的一部分相同的核苷酸序列(“有意義的”鏈)而另一條鏈(“互補(bǔ)的”或“反義”鏈)包含基本上與靶區(qū)域的一部分互補(bǔ)的序列。鏈足以互補(bǔ)雜交以形成雙鏈體結(jié)構(gòu)。在某些實(shí)施方案中，互補(bǔ)的rna鏈可小于30個核苷酸，小于25個核苷酸的長度，或甚至19個-24個核苷酸的長度。在某些方面，互補(bǔ)的核苷酸序列可為20個-23個核苷酸的長度或22個核苷酸的長度。在某些實(shí)施方案中，至少一條rna鏈包含1個-4個核苷酸長度的核苷酸懸垂。在其他的實(shí)施方案中，dsrna還可包含至少一個化學(xué)上修飾的核苷酸。在某些方面，包含1個-4個核苷酸的單鏈懸垂的dsrna可包含一個其中單鏈懸垂的未配對的核苷酸包含嘌呤堿基的分子，該未配對的核苷酸直接鄰近末端的核苷酸對。在其他的方面，dsrna兩個末端上最后一個互補(bǔ)的核苷酸對為g-c對或至少最后四個末端的核苷酸對的兩個為g-c對。本發(fā)明的某些實(shí)施方案可包含微rna(micro-rna)。微rna代表一大組生物體中天然產(chǎn)生的小rna，其中一些調(diào)節(jié)靶基因的表達(dá)。微rna由大約70個核苷酸單鏈的發(fā)卡狀前體轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物通過dicer構(gòu)成(v.ambrosetal.currentbiology13:807,2003)。微rna并不翻譯成蛋白，但是反而結(jié)合特異的信使rna，從而阻斷翻譯。據(jù)認(rèn)為微rna堿基對與它們的靶標(biāo)不嚴(yán)密地以抑制翻譯。某些微rna可被轉(zhuǎn)錄為發(fā)卡狀rna前體，其然后通過dicer酶被處理成它們的成熟形式。在某些實(shí)施方案中，調(diào)節(jié)劑或rnai寡核苷酸為單鏈的。在其他的實(shí)施方案中，調(diào)節(jié)劑或rnai寡核苷酸為雙鏈的。某些實(shí)施方案也可應(yīng)用短的干擾rna(sirna)。在某些實(shí)施方案中，雙鏈的寡核苷酸的第一條鏈比第二條鏈包含多兩個核苷殘基。在其他的實(shí)施方案中，第一條鏈和第二條鏈具有相同數(shù)量的核苷；然而，第一條鏈和第二條鏈為抵消的從而使得在第一條和第二條鏈上的兩個末端的核苷與互補(bǔ)鏈上的殘基為不配對的。在某些情況下，不配對的兩個核苷為胸腺嘧啶核苷。當(dāng)調(diào)節(jié)劑包含sirna時，制劑應(yīng)包括與靶區(qū)域足夠同源的區(qū)域，并且在核苷酸方面具有足夠的長度，從而使得sirna制劑或其片段可以介導(dǎo)靶rna的下調(diào)。應(yīng)懂得術(shù)語“核糖核苷酸”或“核苷酸”可以，在修飾的rna或核苷酸替代的情況下，也指修飾的核苷酸或一個或多個位置上的替代置換部分。因此，sirna制劑為或包括一個至少部分地與靶rna互補(bǔ)的區(qū)域。不需要sirna制劑與靶標(biāo)間存在完美的互補(bǔ)性，但是對應(yīng)性必須足以使sirna制劑或其裂解產(chǎn)物能夠引導(dǎo)序列特異的剪接，諸如通過靶rna的rnai裂解?；パa(bǔ)性或與靶鏈的同源性的程度為反義鏈中最關(guān)鍵的。雖然特別在反義鏈中有完美的互補(bǔ)性，還是經(jīng)常要求一些實(shí)施方案包括一個或多個但是優(yōu)選10,8,6,5,4,3,2或更少的錯配，就靶rna而言。末端區(qū)域中的錯配是最可以接受的，并且如果存在的話，優(yōu)選在末端區(qū)域中，例如5端和/或3’末端的6,5,4或3個核苷酸內(nèi)。有意義鏈只需要與反義鏈足夠地互補(bǔ)性以維持分子的總體雙鏈特征。另外，sirna調(diào)節(jié)劑可被修飾或包括核苷替代。sirna制劑的單一鏈區(qū)域可被修飾或包括核苷替代，例如未配對的區(qū)域或發(fā)卡狀區(qū)域，例如連接兩個互補(bǔ)的區(qū)域的區(qū)域可以具有修飾或核苷替代。使一個或多個sirna制劑的3’-或5’-末端穩(wěn)定的修飾，例如耐受核酸外切酶或有利于反義sirna制劑進(jìn)入risc也是有用的。修飾可以包括c3(或c6,c7,c12)氨基鍵，巰基鍵、羰基鍵、非核苷酸間隔區(qū)(c3、c6、c9、c12、脫堿基的、三甘醇、六乙二醇)、特殊的生物素或熒光素試劑，其盡可能是亞磷酰胺并且具有另一個dmt保護(hù)的羥基以允許rna合成期間多重連接。sirna劑可包括，例如，長到可以觸發(fā)干擾素反應(yīng)(其可被dicer所裂解(bernsteinetal,nature,409:363-366,2001)并且進(jìn)入risc(rnai誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體)的分子，除了足夠短的它們不觸發(fā)干擾素反應(yīng)的分子(其分子也可被dicer裂解和/或進(jìn)入risc)以外，例如允許進(jìn)入risc的大小一樣的分子，例如類似于dicer裂解產(chǎn)物的分子。短到它們不觸發(fā)干擾素反應(yīng)的分子在本文被稱為sirna劑或較短的rnai劑。如所用的“sirna劑或較短的rnai劑”指足夠短的sirna劑，其在人體細(xì)胞中不誘導(dǎo)有害的干擾素反應(yīng)，例如，它具有小于60個但是優(yōu)選地小于50個、40個或30個核苷酸對的雙鏈的區(qū)域。sirna調(diào)節(jié)劑或其裂解產(chǎn)物可以下調(diào)靶基因，例如，通過誘導(dǎo)rnai，就靶rna而言，優(yōu)選諸如m1或m2的流感病毒靶rna。sirna調(diào)節(jié)劑的每條鏈可以等于或小于35個,30個,25個,24個,23個,22個,21個或20個核苷酸長度。鏈優(yōu)選至少19個核苷酸長度。例如，每條鏈可在21個-25個核苷酸長度。優(yōu)選的sirna劑具有17個,18個,19個,29個,21個,22個,23個,24個或25個核苷酸對的雙鏈體區(qū)域，以及一個或多個懸垂，優(yōu)選2個-3個核苷酸的一個或兩個3個懸垂。除了靶rna同源性和下調(diào)靶基因的能力以外，sirna調(diào)節(jié)劑可具有一個或多個下列的特性：盡管有甚至非常大量或所有核苷的修飾，它可具有在適當(dāng)?shù)娜S框架中顯示堿基(或修飾的堿基)的反義鏈，以便能夠形成正確的堿基對并且形成與同源的靶rna的雙鏈體結(jié)構(gòu)，其足以允許下調(diào)靶標(biāo)，例如通過靶rna的裂解；盡管有甚至非常大量或所有核苷的修飾，它仍然具有“rna樣”特性，即它可具有rna分子的總體結(jié)構(gòu)、化學(xué)以及物理學(xué)特性，即使不是唯一地或甚至部分地基于核苷酸的內(nèi)容物。例如，sirna劑可包含，例如，有意義的和/或反義鏈，其中所有的核苷酸糖都包含，例如取代2代羥基的2’氟。該含脫氧核苷酸的制劑仍然可期待展現(xiàn)rna樣的特性。雖然不希望被理論所束縛，當(dāng)被附加至核糖的c2的位置時，帶負(fù)電荷的氟優(yōu)選軸向定位。氟的空間優(yōu)選性轉(zhuǎn)而又促進(jìn)糖采用c3’末端折疊。這與在rna分子中所觀察到的折疊模式是一樣的，并且產(chǎn)生rna特征的a族類型螺旋。而且，既然氟為良好的氫鍵結(jié)合受體，那么它可以參與相同的氫鍵結(jié)合與水分子的相互作用，該相互作用為穩(wěn)定rna結(jié)構(gòu)。通常優(yōu)選地是2’糖位置上的修飾部分將能夠進(jìn)入到氫鍵，其核苷酸的oh部分比脫氧核苷酸的h部分更表征化。本文所用的“單鏈的rnai劑”為由單一的分子所組成的rnai劑?？砂ㄍㄟ^鏈內(nèi)配對所形成的雙鏈體區(qū)域，例如它可以為或包括發(fā)卡狀或盤手柄狀結(jié)構(gòu)。單鏈的rnai調(diào)節(jié)劑優(yōu)選反義，就靶分子而言。單鏈的rnai劑應(yīng)足夠長從而使得它可以進(jìn)入risc并且參與risc介導(dǎo)的靶mrna的裂解。單鏈的rnai劑為至少14個，更優(yōu)選至少15個、20個、25個、29個、35個、40個或50個核苷酸長度。優(yōu)選小于200個、100個或60個核苷酸長度。發(fā)卡狀rnai調(diào)節(jié)劑可具有等于或至少17個,18個,19個,29個,21個,22個,23個,24個或25個核苷酸對的雙鏈體區(qū)域。雙鏈體區(qū)域可優(yōu)選等于或小于200個、100個或50個核苷酸長度。某些針對雙鏈體區(qū)域的范圍為15個-30個、17個-23個、19個-23個以及19個-21個核苷酸對長度。發(fā)卡可具有單鏈的懸垂或末端未配對的區(qū)域，優(yōu)選3懸并且優(yōu)選發(fā)卡的反義側(cè)。在某些實(shí)施方案中，懸垂為2個-3個核苷酸長度。根據(jù)本文所提供的方法所利用的某些調(diào)節(jié)劑可包含rnai寡核苷酸諸如嵌合的寡核苷酸或“嵌合體”，其包含兩個或多個化學(xué)上的不同區(qū)，每個都由至少一個單體單元，即就寡核苷酸化合物而言一個核苷酸組成。這些寡核苷酸通常包含至少一個區(qū)域，其中寡核苷酸被修飾以便賦予寡核苷酸增強(qiáng)的對核酸酶降解的耐受性，增強(qiáng)的細(xì)胞攝取和/或增強(qiáng)的對靶核酸的結(jié)合親和力。因此，經(jīng)常用較短的寡核苷酸獲取可比較的結(jié)果，當(dāng)使用嵌合的寡核苷酸時，與硫代磷酸的寡脫氧核苷酸比較。嵌合的寡核苷酸可形成兩個或多個如上文所述的寡核苷酸、修飾的寡核苷酸、寡核苷酸和/或寡核苷酸模擬體的復(fù)合結(jié)構(gòu)。此類寡核苷酸在本領(lǐng)域中也被稱為雜交體或博弈體。教導(dǎo)此類雜交結(jié)構(gòu)制備的代表性美國專利申請包括但不限于美國專利申請5,013,830,5,149,797,5,220,007,5,256,775,5,366,878,5,403,711,5,491,133,5,565,350,5,623,065,5,652,355,5,652,356,5,700,922以及5,955,589號，在此通過引用將每一專利申請并入。在某些實(shí)施方案中，嵌合的寡核苷酸為rna-dna，dna-rna，rna-dna-rna，dna-rna-dna或rna-dna-rna-dna，其中寡核苷酸長度在5個-60個核苷酸。在本發(fā)明的一方面，諸如rnai劑的調(diào)節(jié)劑涉及包含至少一個系于改變的或非天然的核堿基的配體的寡核苷酸。大量的化合物可具有改變的堿基的功能。改變的堿基的結(jié)構(gòu)對于改變的堿基不應(yīng)基本上阻止寡核苷酸與它的例如mrna的靶標(biāo)結(jié)合具有重要的意義。在某些實(shí)施方案中，改變的堿基為二氟代基、硝基吡咯基、硝基咪唑基、硝基吲哚基、萘炔基、蒽基、吡啶基、喹啉基、芘基或任一本文所述的非天然的核堿基的二階基。在某些實(shí)施方案中，非天然的核堿基為二氟代基、硝基吡咯基或硝基咪唑基。在某些實(shí)施方案中，非天然的核堿基為二氟代基。廣泛多樣的配體為本領(lǐng)域中已知的并且可經(jīng)得起本發(fā)明的檢驗(yàn)。例如，配體可為類固醇、膽汁酸、脂質(zhì)、葉酸、吡哆酸、b12、核黃素、生物素、芳香族化合物、多環(huán)化合物、冠醚、嵌入劑、剪切分子、蛋白結(jié)合劑或碳水化合物。在某些實(shí)施方案中，配體為類固醇或芳香族化合物。在某些實(shí)施方案中，配體為膽甾醇基。在其他的實(shí)施方案中，出于改進(jìn)細(xì)胞的靶向及攝取的目的，rnai劑為系于配體的寡核苷酸。例如，rnai劑可系于抗體或其抗原結(jié)合片段。作為額外的實(shí)例，rnai劑可系于諸如多肽或多肽片段的特異的配體結(jié)合分子，該配體結(jié)合分子特異地結(jié)合特定的細(xì)胞表面受體。在其他的實(shí)施方案中，調(diào)節(jié)劑包含非天然的核堿基。在某些實(shí)施方案中，非天然的核堿基為二氟代基、硝基咪唑基、硝基吲哚基或硝基吡咯基。在某些實(shí)施方案中，本文所提供的調(diào)節(jié)劑涉及雙鏈的寡核苷酸序列，其中只有兩條鏈的一條包含非天然的核堿基。在某些實(shí)施方案中，本文所用的調(diào)節(jié)劑涉及雙鏈的寡核苷酸序列，其中兩條鏈獨(dú)立地包含至少一個非天然的核堿基。在某些情況下，天然出現(xiàn)在核苷中的核糖部分被己糖替換。在某些方面，己糖為阿洛糖、阿卓糖、葡萄糖、甘露糖、古羅塘、艾杜糖、半乳糖、塔羅糖或其衍生物。在一優(yōu)選的實(shí)施方案中，己糖為右型己糖。在某些情況下，天然出現(xiàn)在核苷中的核糖部分被多環(huán)的異烷基環(huán)或環(huán)己烯基替換。在某些情況下，多環(huán)的異烷基為環(huán)中含有一個氧原子的二環(huán)。在某些情況下，多環(huán)的異烷基為二環(huán)的(2.2.1)庚烷、二環(huán)的(3.2.1)辛烷或二環(huán)的(3.3.1)壬烷。在某些實(shí)施方案中，寡核苷酸的主鏈已被修飾以改進(jìn)寡核苷酸化合物的治療或診斷的特性。在某些實(shí)施方案中，寡核苷酸的至少一個堿基或至少一個糖已被修飾以改進(jìn)寡核苷酸化合物的治療或診斷的特性。當(dāng)寡核苷酸為雙鏈時，這兩條鏈為互補(bǔ)的，部分互補(bǔ)的或嵌合的寡核苷酸。預(yù)想用于本發(fā)明的方法所使用的修飾的rnai劑的實(shí)例包括含修飾的主鏈或非天然的核苷內(nèi)鍵的寡核苷酸。如此處所定義的，具有修飾的主鏈或核苷內(nèi)鍵的寡核苷酸包括主鏈中保留一個磷原子的那些以及主鏈中沒有磷原子的那些。它們的糖內(nèi)主鏈中沒有磷原子的修飾的寡核苷酸也可被認(rèn)為是寡核苷酸。下文描述了特有的寡核苷酸化學(xué)修飾。不一定需要給定化合物中所有的位置都被一致地修飾，并且實(shí)際上，不只一個的下列修飾可并入至單一的寡核苷酸化合物或甚至其單一的核苷酸。修飾的核苷內(nèi)鍵或主鏈的實(shí)例包括，例如，硫代磷酸酯、嵌合的硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、磷酸三酯、氨烷基磷酸三酯、包括3’烯基磷酸酯和嵌合的磷酸酯的甲基及其他的烷基磷酸酯、次磷酸酯、包括3’氨基磷酰胺酯的磷酰胺酯以及氨烷基磷酰胺酯、巰代磷酰胺酯、巰代烷基磷酰胺酯、巰代烷基磷酸三酯以及具有正常的3’-5’鍵的硼烷磷酸、這些的2’-5’連接的對應(yīng)物以及具有反相極性的那些，其中鄰近的核苷單元對連接為3’-5’至5’-3’或2’-5’至5’-2’。還包括各種鹽、混合的鹽以及游離酸的形式。教導(dǎo)上述含磷原子鍵制備的代表性美國專利申請包括但不限于美國專利申請第3,687,808,4,469,863,4,476,301,5,023,243,5,177,196,5,188,897,5,264,423,5,276,019,5,278,302,5,286,717,5,321,131,5,399,676,5,405,939,5,453,496,5,455,233,5,466,677,5,476,925,5,519,126,5,536,821,5,541,306,5,550,111,5,563,253,5,571,799,5,587,361,5,625,050以及5,697,248號，在此通過引用將每一個專利申請并入。其中不包括磷原子的修飾的核苷內(nèi)鍵或主鏈(即寡核苷酸)的實(shí)例具有通過短鏈烷基或環(huán)烷基的糖內(nèi)鍵、混合的雜原子與烷基或環(huán)烷基糖內(nèi)鍵、或一個或多個短鏈雜原子的或雜環(huán)的糖內(nèi)鍵所形成的主鏈。這些包括具有嗎啉鍵(部分地形成于核苷的糖部分)的那些；硅氧烷主鏈；硫化物、亞砜和砜主鏈；甲乙?；蛶€代甲乙酰基主鏈；甲烯甲乙?；蛶€代甲乙?；麈湥缓N的主鏈；氨基磺酸酯主鏈；亞甲基亞氨基和亞甲基肼基主鏈；磺酸酯和磺酰胺主鏈；氨基主鏈以及具有混合的n、o、s的其他主鏈和3/4組分部分。教導(dǎo)上述的寡核苷酸制備的代表性美國專利申請包括但不限于美國專利申請第5,034,506,5,166,315,5,185,444,5,214,134,5,216,141,5,235,033,5,264,562,5,264,564,5,405,938,5,434,257,5,466,677,5,470,967,5,489,677,5,541,307,5,561,225,5,596,086,5,602,240,5,610,289,5,602,240,5,608,046,5,610,289,5,618,704,5,623,070,5,663,312,5,633,360,5,677,437以及5,677,439號，在此通過引用將每一個專利申請并入。在寡核苷酸模擬物的其他實(shí)例中，糖與核苷內(nèi)鍵，即核苷單元的主鏈可被新的基團(tuán)替換。保持核堿基單元與適當(dāng)?shù)暮怂岚谢衔镫s交。此類的一個寡核苷酸，已顯示具有極好的雜交特性的寡核苷酸模擬物被稱為肽核酸(pna)。pna化合物中，寡核苷酸的糖主鏈被含氨基的主鏈，特別是氨基乙基甘氨酸主鏈替換。保留后面的核堿基并且直接或間接地結(jié)合主鏈的酰胺部分的原子。教導(dǎo)pna化合物制備的代表性美國專利申請包括但不限于美國專利申請第5,539,082,5,714,331以及5,719,262號，在此通過引用將每一個專利申請并入。pna化合物的更進(jìn)一步的教導(dǎo)可以在nielsenetal.,science,1991,254,1497中找到。本發(fā)明還包括應(yīng)用核糖酶的寡核苷酸。催化高度特異的核糖核酸內(nèi)切酶活性的合成的rna分子及其衍生物被稱為核糖酶(通常見美國專利申請第5,543,508號-haseloffetal以及美國專利申請第5,545,729號-goodchildetal)。通過rna分子它們自己催化裂解反應(yīng)。天然存在的rna分子中，自催化的裂解的位點(diǎn)位于rna二級結(jié)構(gòu)的高度保守的區(qū)域內(nèi)(buzayanetal.,proc.natl.acad.sci.u.s.a.83:8859-62,1986；forsteretal,cell.50:9-16,1987)。天然存在的自身催化的rna分子已被修飾以產(chǎn)生核糖酶可靶向于特定的帶有高度特異性的細(xì)胞的或病原的rna分子。因此，核糖酶出于相同的通用用途，用作反義寡核苷酸(即特異基因的表達(dá)的調(diào)節(jié))以及，像寡核苷酸，為具有單鏈的重要的一部分的核酸。在某些情況下，用于供本文所提供的方法的使用的rnai劑可通過非配體基團(tuán)被修飾。許多非配體的分子已與寡核苷酸連接以便增強(qiáng)寡核苷酸的活性，細(xì)胞定位，細(xì)胞靶向或細(xì)胞攝取并且用于進(jìn)行此類的連接的程序在科學(xué)文獻(xiàn)中可獲得的。此類非配體部分已包括脂質(zhì)部分，諸如膽固醇(letsingeretal,proc.natl.acad.sci.usa,86:6553-56,1989)、膽酸(manoharanetal.,bioorg.med.chem.lett.4:1053,1994)、硫醚、例如己基-5-三苯甲基(manoharanetal.,ann.n.y.acad.sci.,660:306,1992；manoharanetal,bioorg.med.chem.let.,3:2765,1993)、巰基膽固醇(oberhauseretal.,nucl.acidsres.,20:533,1992)、脂肪鏈、例如十二基或十一基殘基(saison-behmoarasetal.,emboj.10:111,1991；kabanovetal,febslett.259:327,1990；svinarchuketal.,biochimie.75:49,1993)、磷脂、例如二-十六基-外消旋-丙三醇或三乙胺l,2-雙-o-十六基-外消旋-甘油酸-3-氫-磷酸酯(manoharanetal.,tetrahedronlett,36:3651,1995；sheaetal,nucl.acidsres.18:3777,1990)，多胺或聚乙二醇鏈(manoharanetal,nucleosides&nucleotides.14:969,1995)或金剛烷乙酸(manoharanetal.,tetrahedronlett.36:3651,1995)，棕櫚基部分(mishraetal.,biochim.biophys.acta.1264:229,1995)或十八烷基胺或己胺-羰基-羥膽甾醇部分(crookeetal.,j.pharmacol.exp.ther.277:923,1996)。教導(dǎo)此類寡核苷酸連接制備的代表性美國專利申請已列舉在上文。典型的連接協(xié)議涉及產(chǎn)生序列的一個或多個位置上的氨基鍵的寡核苷酸的合成。然后利用適當(dāng)?shù)钠ヅ涞幕蚧罨脑噭被c連接的分子起作用。可與仍然結(jié)合于固相載體的寡核苷酸或溶液相中核苷酸的下列的裂解進(jìn)行連接反應(yīng)。通過hplc連接的寡核苷酸的純化通常提供純化的連接。諸如rnai寡核苷酸的調(diào)節(jié)劑的額外的實(shí)例可在美國專利申請第2007/0275465,2007/0054279,2006/0287260,2006/0035254,2006/0008822號找到，通過引用將這些專利申請并入。抑制流感病毒復(fù)制上文詳述的反義化合物在抑制正黏液病毒科的單鏈的、負(fù)義的、節(jié)段的rna病毒的復(fù)制中有用。在一實(shí)施方案中，此類抑制為有效治療被這些病毒感染的宿主細(xì)胞。因此，方法包含，在一實(shí)施方案中，用有效抑制特定的病毒復(fù)制的反義制劑接觸被病毒感染的細(xì)胞。在該實(shí)施方案中，在合適的藥物載體中給予被給定的病毒感染的、例如人類或家畜的哺乳動物個體反義制劑。值得關(guān)注的是反義寡核苷酸阻止rna病毒在宿主中生長。rna病毒可在數(shù)量上降低或被對宿主的正常生長或發(fā)育幾乎沒有或無損害效應(yīng)去除。在如實(shí)例所述的本發(fā)明中，磷酰二胺嗎啉基寡核苷酸(pmo)，設(shè)計用于與甲型流感病毒的m1/m2基因節(jié)段(即節(jié)段7)雜交，被評估它們在兩個動物模型中抑制流感病毒產(chǎn)生的能力。pmo與短的富精氨酸肽連接以促進(jìn)進(jìn)入細(xì)胞或被做成含陽離子鍵的pmoplustm化合物?；衔锇邢蛴趍1基質(zhì)蛋白(m1)的aug翻譯起始位點(diǎn)和離子通道蛋白(m2)，這兩個利用m1/m2mrna的可選擇的剪接形式，表達(dá)于相同的aug起始密碼子。本發(fā)明的m1/m2-aug靶向的反義化合物導(dǎo)致如實(shí)施例1中所述的病毒滴度在h3n2的小鼠模型中的抑制。本發(fā)明的m1/m2-aug靶向的化合物也證明了如實(shí)施例2中所述的減少的流感感染的臨床體征以及降低的洗鼻液中的在2009h1n1(s-oiv)全國流行的豬流感的雪貂模型中的病毒滴度。因此，本文示例的反義寡核苷酸和rnai劑可用于病毒感染所引起的那些治療中，主要地是由正黏液病毒科的單鏈的、負(fù)義的、節(jié)段的rna病毒所引起的那些治療中。本發(fā)明的實(shí)施方案也包括組合療法和相關(guān)的組合物。例如，本文提供的抗病毒的(即病毒靶向的)反義寡核苷酸和rnai劑可用于宿主分子靶向的反義寡核苷酸或rnai劑的組合。就這一點(diǎn)而言，宿主免疫應(yīng)答基因和/或它的受體的反義或rnai靶向可用于改進(jìn)免疫應(yīng)答并且因此預(yù)防或降低隨后的感染，無論病毒的還是細(xì)菌的(例如繼發(fā)性細(xì)菌感染)。作為一個實(shí)例，已表明cd200/r-/-小鼠沒有發(fā)展到流感病毒感染繼發(fā)的敗血癥。cd200為固有性免疫應(yīng)答的負(fù)調(diào)節(jié)劑，通常導(dǎo)致固有性免疫應(yīng)答下調(diào)。因此，某些治療方法可包括給予反義和/或rnai劑靶向編碼cd200和/或cd200受體的宿主rna分子(例如見hatherlyetal,eurjimmunol.34:1688-94,2004)與給予任一或多個本文所述的流感病毒靶向的反義劑的組合(同時地或單獨(dú)地)。還包括的是包含靶向cd200和/或cd200受體的反義或rnai劑的組合物(例如靶向于它的aug起始密碼子或剪接位點(diǎn))與如本文所述的靶向流感病毒的反義或rnai劑的組合。這些方法和組合可用于治療獨(dú)立的流感病毒感染和/或與流感病毒感染相關(guān)繼發(fā)性細(xì)菌感染(例如鏈球菌肺炎(streptococcalpneumonia))。本發(fā)明的實(shí)施方案也包括用于治療病毒感染(例如流感病毒感染)伴隨繼發(fā)性細(xì)菌感染的組合療法。1918-1919年流感大流行中死亡案例的大多數(shù)很可能起因于由普通的上呼吸道細(xì)菌所引起的繼發(fā)性細(xì)菌肺炎，諸如鏈球菌肺炎，并且最近的來源于2009年h1n1大流行的證據(jù)顯示繼發(fā)性細(xì)菌感染依然為死亡的重要原因(例如見louieetal,clininfectdisease.50:e59-62,2010；jainetah,nengljmed.361:1935-44,2009；jamiesonetal,cellhostmicrobe.7:103-14,2010)。對鏈球菌肺炎的護(hù)理標(biāo)準(zhǔn)包括抗生素。主要的抗生素包括諸如盤尼西林(penicillin)和阿莫西林(amoxicillin)的殺菌的β-內(nèi)酰胺劑，二線制劑包括頭孢菌素(cephalosporins)以及三線制劑包括氯霉素(chloramphenicol)或克林霉素(clindamycin)。因此，本發(fā)明的實(shí)施方案包括與一種或多種抑菌的或殺菌的抗生素(例如盤尼西林、阿莫西林、頭孢菌素、氯霉素、克林霉素)給藥(同時地或單獨(dú)地)與本文所提供的一種或多種流感病毒靶向的反義或rnai劑組合相關(guān)方法和組合物，主要用于治療或處理流感病毒感染相關(guān)繼發(fā)性細(xì)菌感染。作為另一個實(shí)例，本發(fā)明的反義寡核苷酸和rnai劑可與其他的諸如磷酸奧司他韋的流感病毒靶向的療法組合給予(同時地或單獨(dú)地)。在某些方面，一種或多種反義寡核苷酸(例如avi-7100)與奧司他韋的組合可以相對于奧司他韋單獨(dú)的或抗病毒的反義寡核苷酸單獨(dú)的使用，獲得在降低流感病毒滴度和/或其他的流感病毒感染的癥狀(例如肺泡炎、侵潤性免疫細(xì)胞)方面的協(xié)同效應(yīng)。還包括包含奧司他韋與本文所述的靶向流感病毒的抗病毒的反義寡核苷酸或rnai劑組合的組合物。在具體的實(shí)施方案中，這些組合物和方法可以用于治療否則耐受奧司他韋的流感病毒感染。感染因子的鑒定通過本領(lǐng)域中已知的方法，例如血清學(xué)的或培養(yǎng)的方法可檢測引起感染的特定病毒。血清學(xué)鑒定應(yīng)用病毒樣品或自生物學(xué)樣本分離的培養(yǎng)物，例如個體的唾液糞便、尿液、腦脊液、血液等。通常通過本領(lǐng)域中技術(shù)人員常規(guī)應(yīng)用的方法，例如elisa或蛋白印跡法(westernblot)進(jìn)行用于病毒檢測的免疫測定。另外，針對特定的病毒株或物種的單克隆抗體為商購可獲得的。培養(yǎng)方法可用于分離以及鑒定特定的病毒類型，通過應(yīng)用包括但不限于比較特征，諸如各種培養(yǎng)狀態(tài)下生長速度和形態(tài)學(xué)的技術(shù)。用于鑒定受感染的個體中病毒感染因子的另一個方法應(yīng)用來自于生物學(xué)樣本的分離的rna，隨后利用特異的pcr引物擴(kuò)增核酸，該引物將疑似的病毒因子作為靶標(biāo)，例如季節(jié)性h1n1流感病毒，大流行的h1n1s-oiv，h5n1禽流感或h3n2豬流感。制劑和給藥在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了適于本文所述的反義寡聚物的治療遞送的制劑或組合物。因此，在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了藥學(xué)上可接受的組合物，其包含一種或多種本文所述的寡聚物治療上有效的量，與一種或多種藥學(xué)上可接受的載體(添加劑)和/或稀釋劑配制在一起。雖然本發(fā)明的寡聚物單獨(dú)給藥是可能的，但是優(yōu)選地是給予作為藥物制劑的化合物(組合物)。用于核酸分子遞送的方法例如，描述于akhtaretal.,1992,trendscellbio.,2:139；以及反義寡核苷酸療法的遞送策略(deliverystrategiesforantisenseoligonucleotidetherapeutics),ed.akhtar；sullivanetal.,pctwo94/02595中。利用這些和其他的協(xié)議用于幾乎任一核酸分子的遞送，包括本發(fā)明的分離的寡聚物。如下文所詳述的，本發(fā)明的藥物組合物可特異地配制以固體或液體的形式給藥，包括適合于下列的那些：(1)口服給藥，例如，浸液(水的或無水的溶液或懸浮液)，片劑，例如靶向于口腔的、舌下的以及全身吸收的那些，丸劑、粉劑、顆粒劑、應(yīng)用于舌頭的糊劑；(2)胃腸外給藥，例如通過皮下的、肌肉內(nèi)的、靜脈內(nèi)的或硬膜外注射，例如作為無菌的溶液或懸浮液或緩釋制劑；(3)局部應(yīng)用，例如作為乳劑、膏劑或控釋的應(yīng)用于皮膚的膜貼或噴霧；(4)陰道內(nèi)地或直腸內(nèi)地，例如作為陰道藥栓、乳劑或泡沫；(5)舌下給藥；(6)經(jīng)眼睛地；(7)經(jīng)皮膚地；或(8)經(jīng)鼻地。本文所用的短語“藥學(xué)上可接受的”通常指那些化合物、材料、組合物和/或劑型，其在充分的醫(yī)療判斷范圍內(nèi)適用于接觸人和動物的組織而沒有過多的毒性、刺激、過敏反應(yīng)或其他的問題或并發(fā)癥，具有合理的效益/風(fēng)險比。本文所用的短語“藥學(xué)上可接受的載體”意指藥學(xué)上可接受的物質(zhì)、組合物或媒介，諸如液體或固體的填充劑、稀釋劑、賦形劑、生產(chǎn)輔料(例如潤滑劑、滑石鎂、硬脂酸鈣或鋅或硬脂酸)或參與運(yùn)載或轉(zhuǎn)運(yùn)個體的化合物從一個器官或身體的一部分至另一個器官或身體另一部分的灌封物質(zhì)的溶劑。每個載體必須為“可接受的”，從其與制劑的其他成分相容的并且對患者無害的意義上說。用作藥學(xué)上可接受的載體的物質(zhì)的一些實(shí)例包括但不限于：(1)糖，諸如乳糖、葡萄糖以及蔗糖；(2)淀粉，諸如玉米淀粉和馬鈴薯淀粉；(3)纖維素以及它的衍生物，諸如羧甲基纖維素鈉、乙基纖維素以及醋酸纖維素；(4)粉狀的黃芪膠；(5)麥芽；(6)明膠；(7)滑石；(8)賦形劑，諸如可可脂和栓劑蠟；(9)油類，諸如花生油、棉籽油、紅花油、芝麻油、橄欖油、玉米油以及大豆油；(10)二醇類，諸如丙二醇；(11)多元醇，諸如甘油、山梨醇、甘露醇以及聚乙二醇；(12)酯類，諸如乙基油酸酯和月桂酸乙酯；(13)瓊脂；(14)緩沖劑，諸如氫氧化鎂和氫氧化鋁；(15)褐藻酸；(16)無熱原的水；(17)生理鹽水；(18)林格氏溶液；(19)乙醇；(20)ph緩沖溶液；(21)聚酯、聚碳酸酯和/或聚酸酐；以及(22)藥物制劑中應(yīng)用的其他的無毒的可相容的物質(zhì)。適于與本發(fā)明的反義寡聚物配制的制劑的額外的非限制性實(shí)例包括：連接核酸的peg、連接核酸的磷脂、含親脂性部分的核酸、硫代磷酯、可以增強(qiáng)藥物進(jìn)入各種組織的p-糖蛋白抑制劑(諸如普朗尼克p85(pluronicp85))；可生物降解的聚合物，諸如用于植入后緩釋遞送的聚乳酸-聚羥基乙酸微球(emerich,dfetal,celltransplant.8:47-58,1999)alkermes,inc.cambridge,mass.；裝載的納米粒子，諸如由聚氰基丙烯酸正丁酯組成的那些，其可以遞送藥物穿過血腦屏障并且可以改變神經(jīng)元攝取機(jī)制(progneuropsychopharmacolbiolpsychiatry,23,941-949,1999)。本發(fā)明也表征了包含表面修飾的脂質(zhì)體的組合物的使用，該脂質(zhì)體包含聚(乙烯乙二醇)脂質(zhì)(peg修飾的，支鏈的或無支鏈的或其組合，或長循環(huán)脂質(zhì)體或隱性脂質(zhì)體)。本發(fā)明的寡聚物也可以包含共價地附加的各種分子量的peg分子。這些制劑提供了一種用于增加藥物在靶組織中積聚的方法。該類藥物載體耐受單核吞噬系統(tǒng)(nps或res)的調(diào)理素作用以及消除，從而能夠促進(jìn)更長的血液循環(huán)時間以及增強(qiáng)組織暴露于封裝的藥物(lasicetal.chem.rev.1995,95,2601-2627；ishiwataetal.,chem.pharm.bull.1995,43,1005-1011)。此類脂質(zhì)體已顯示了在腫瘤中選擇性積聚，大概通過在新形成血管的靶組織中外溢和捕獲(lasicetal.,science.267:1275-1276,1995；okuetal.,biochim.biophys.acta.1238:86-90,1995)。長循環(huán)的脂質(zhì)體增強(qiáng)dna和rna的藥代動力學(xué)及藥效學(xué)，特別是與已知的積聚于mps組織中的常規(guī)的陽離子脂質(zhì)體比較(liuetal.j.biol.chem.42:24864-24870,1995；choietal.,國際的pct出版物wo96/10391號；anselletal,國際的pct出版物wo96/10390號；hollandetal.,國際的pct出版物wo96/10392號)。長循環(huán)的脂質(zhì)體也很可能保護(hù)藥物免受核酸酶降解至更大的程度，與陽離子脂質(zhì)體比較，基于它們避免在諸如肝臟和脾臟的新陳代謝活躍的mps組織中積聚的能力。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明包括制備用于遞送的寡聚物組合物，如美國專利申請第6,692,911,7,163,695及7,070,807號所述。就這一點(diǎn)而言，在一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了在包含賴氨酸與組氨酸的共聚物(hk)的組合物中的本發(fā)明的寡聚物，如美國專利申請第7,163,695,7,070,807及6,692,911號所述，單獨(dú)的或與peg(例如支鏈的或無支鏈的peg或兩者的混合物)的組合，與peg及靶向部分或任一上述的與交聯(lián)劑組合。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了組合物中的反義寡聚物，該組合物包含葡萄糖酸修飾的聚組氨酸或葡萄糖基的-聚組氨酸/轉(zhuǎn)鐵蛋白-聚賴氨酸。本領(lǐng)域中技術(shù)人員也應(yīng)意識到帶有類似于his與lys特性的氨基酸可在組合物中被取代。本文所述的某些寡聚物的實(shí)施方案包含基本的功能性基團(tuán)，諸如氨基或烷氨基，并且因此能夠形成帶有藥學(xué)上可接受的酸的藥學(xué)上可接受的鹽。術(shù)語“藥學(xué)上可接受的鹽”在此方面指本發(fā)明的化合物相對無毒的、無機(jī)的及有機(jī)的酸加成鹽。這些鹽可以在給藥媒介原位或劑型生產(chǎn)過程中制備，或通過分別以其帶有合適的有機(jī)酸或無機(jī)酸的游離堿形式與本發(fā)明純化的化合物起反應(yīng)并且在隨后的純化期間分離因此形成的鹽。代表性鹽包括氫溴酸鹽、鹽酸鹽、硫酸鹽、硫酸氫鹽、磷酸鹽、硝酸鹽、醋酸鹽、戊酸鹽、油酸鹽、棕櫚酸鹽、硬脂酸鹽、月桂酸鹽、苯甲酸鹽、乳酸鹽、磷酸鹽、甲苯磺酸鹽、檸檬酸鹽、馬來酸鹽、延胡索酸鹽、琥珀酸鹽、酒石酸鹽、萘酸鹽、甲磺酸鹽、葡庚糖酸鹽、乳糖酸鹽以及十二烷基磺酸鹽等(例如見bergeetal..pharm.sci.66:1-19,1977)。個體的寡聚物的藥學(xué)上可接受的鹽包括化合物的常規(guī)無毒的鹽或季銨鹽，例如來自于無毒的有機(jī)酸或無機(jī)酸。例如，此類常規(guī)的無毒的鹽包括衍生于無機(jī)酸的那些，諸如鹽酸鹽、氫溴酸的、硫酸的、氨基磺酸、磷酸、硝酸等；自有機(jī)酸制備的鹽，諸如醋酸的、丙酸的、琥珀酸的、甘醇酸的、硬脂酸的、乳酸的、蘋果酸的、酒石酸的、檸檬酸的、抗壞血酸的、棕櫚酸的、順丁烯二酸的、草酰乙酸的、苯乙酸的、谷氨酸的、苯甲酸的、水楊酸的、磺胺酸的、2-乙酸基苯甲酸的、反丁烯二酸的、甲苯亞磺酸的、甲磺酸的、乙烷二磺酸的、草酸的、異硫酸的等。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的寡聚物可包含一個或多個酸性的功能基團(tuán)，并且因此能夠形成帶有藥學(xué)上可接受的堿基的藥學(xué)上可接受的鹽。術(shù)語“藥學(xué)上可接受的鹽”在這些情況下指本發(fā)明的化合物相對無毒的、無機(jī)的及有機(jī)的堿加成鹽。這些鹽同樣在給藥媒介原位或劑型生產(chǎn)過程中制備，或通過分別以游離酸形式與純化的化合物起反應(yīng)，該游離酸帶有諸如羥化物、藥學(xué)上可接受的金屬陽離子的碳酸鹽或碳酸氫鹽的合適的堿，帶有氨，或帶有藥學(xué)上可接受的有機(jī)的一級、二級或三級胺。代表性堿或堿土鹽包括鋰、鈉、鉀、鈣、鎂以及鋁鹽等。對堿加成鹽的形成有用的代表性有機(jī)胺包括乙胺、二乙胺、乙二胺、乙醇胺、二乙醇胺、哌嗪等(例如見bergeetah,supra)。濕潤劑、乳化劑和諸如十二烷基硫酸鈉與硬脂酸鎂的潤滑劑以及著色劑、脫模劑、涂層劑、甜味劑、香精香料劑、防腐劑和抗氧化劑也可以存在于組合物中。藥學(xué)上可接受的抗氧化劑的實(shí)例包括：(1)水溶性抗氧化劑，諸如抗壞血酸、半胱氨酸鹽酸鹽、硫酸氫鈉、焦亞硫酸鈉、亞硫酸鈉等；(2)油溶性抗氧化劑，諸如抗壞血酸棕櫚酸酯、丁基羥基苯甲醚(bha)、丁羥甲苯(bht)、卵磷脂、丙基沒食子酸、α-生育酚等；以及(3)金屬螯合劑，諸如檸檬酸、乙二胺四乙酸(edta)、山梨醇、酒石酸、磷酸等。本發(fā)明的制劑包括適用于口服、經(jīng)鼻的、局部的(包括口腔的和舌下的)、直腸的、陰道的和/或胃腸外給藥的那些。制劑可常規(guī)以單位劑型存在并且可通過任一藥學(xué)領(lǐng)域熟知的方法制備。可以與載體物質(zhì)組合以產(chǎn)生單一的劑型的活性成分的量因被治療的宿主、給藥的特別模式而不同?？梢耘c載體物質(zhì)組合以產(chǎn)生單一的劑型的活性成分的量通常為產(chǎn)生治療效果的化合物的量。通常，出于100％，該量范圍從約0.1％-約99％活性成分，優(yōu)選從約5％-約70％，最優(yōu)選從約10％-約30％。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的制劑包含選自環(huán)糊精、纖維素、脂質(zhì)體、膠束形成劑的賦形劑，例如膽汁酸與聚合物載體，例如聚酯與聚酸酐；以及本發(fā)明的寡聚物。在某些實(shí)施方案中，上述的制劑提供口服地生物相容性的本發(fā)明的寡聚物。這些制劑或組合物的制備方法包括將本發(fā)明的寡聚物與載體以及任選地一種或多種配合成分開始聯(lián)系起來的步驟。通常，通過統(tǒng)一緊密地將本發(fā)明的化合物與液體載體或細(xì)小分散的固體載體或這兩者開始聯(lián)系起來，然后，如有必要，形成產(chǎn)物來制備制劑。本發(fā)明適用于口服給藥的制劑可呈現(xiàn)以下形式：膠囊、扁囊劑、丸劑、片劑、錠劑(利用香味基礎(chǔ)，通常是蔗糖與阿拉伯膠或黃芪膠)、粉劑、顆粒劑、或作為水性或非水性液體中的溶液或懸浮液、或作為水包油或油包水的液體乳劑、或作為酏劑或糖漿、或作為錠劑(利用惰性基礎(chǔ)，諸如明膠和甘油，或蔗糖和阿拉伯膠)和/或作為漱口藥等，每個都包含預(yù)定量的本發(fā)明的化合物作為活性成分。本發(fā)明的寡聚物也可以大藥丸、藥糖劑或糊劑給藥。在本發(fā)明用于口服給藥的固體劑型(膠囊、片劑、丸劑、糖衣丸、粉劑、顆粒劑、錠劑等)中，活性成分可與一種或多種藥學(xué)上可接受的載體混合，諸如檸檬酸鈉或磷酸氫鈣，和/或任一下列的：(1)填充劑或增量劑，諸如淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露醇和/或硅酸；(2)結(jié)合劑，諸如，例如羧甲基纖維素、褐藻酸鹽、明膠、聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖和/或阿拉伯膠；(3)濕潤劑，諸如甘油；(4)崩解劑，諸如瓊脂、碳酸鈣、馬鈴薯或木薯淀粉、褐藻酸、某些硅酸鹽以及碳酸鈉；(5)溶液緩凝劑，諸如石蠟；(6)吸收加速劑，諸如季銨化合物以及表面活性劑，諸如泊咯沙姆和十二烷基硫酸鈉；(7)濕潤劑，諸如，例如鯨蠟醇、單硬脂酸甘油酯以及非離子表面活性劑；(8)吸收劑，諸如高嶺土和膨潤土；(9)潤滑劑，諸如滑石、硬脂酸鈣、硬脂酸鎂、固體的聚乙二醇、十二烷基硫酸鈉、硬脂酸鋅、硬質(zhì)酸鈉、硬脂酸及其混合物；(10)著色劑；以及(11)控釋劑，諸如交聯(lián)聚維酮或乙基纖維素。在膠囊、片劑以及丸劑的情況下，藥物組合物也可包含緩沖劑。利用諸如乳糖或牛奶糖以及高分子量的聚乙二醇等賦形劑，相似類型的固體組合物也可用作軟殼及硬殼的明膠膠囊中的填充劑。片劑可通過壓縮或塑模來制造，任選地帶有一個或多個配合成分。可利用結(jié)合劑(例如明膠或羧丙基甲基纖維素)、潤滑劑、惰性稀釋劑、防腐劑、崩解劑(例如羧甲淀粉鈉或交聯(lián)的羧甲基纖維素鈉)、表面活性劑或分散劑制備壓縮的片劑。通過在合適的機(jī)器中塑模被惰性液體稀釋劑弄濕的粉末狀的化合物的混合物制造塑模的片劑。本發(fā)明藥物組合物的片劑以及其他的固體劑型，諸如糖錠、膠囊、丸劑以及顆粒劑，可任選地被包衣和殼刻痕或制備，諸如腸溶衣和其他的藥物配制領(lǐng)域中熟知的包衣。它們也可被配制以便提供活性成分慢的或控制的釋放，在其中利用，例如不同比例的羥丙基甲基纖維素以提供理想的釋放行為、其他的聚合物基質(zhì)、脂質(zhì)體和/或微球體。它們可被配制用于快速釋放，例如冷凍干燥。例如可通過細(xì)菌濾器過濾或通過以無菌的固體組合物形式摻入殺菌劑來對它們殺菌，該無菌的固體組合物在使用前就溶入無菌水或其他的無菌的可注射的介質(zhì)。這些組合物也可任選地包含乳濁劑并且可具有它們只或優(yōu)選地在胃腸消化道的某一部分任選地以延遲的方式釋放活性成分的組合物。可以使用的植入組合物的實(shí)例包括聚合物和蠟?；钚猿煞忠部沙尸F(xiàn)微膠囊化的形式，任選地帶有一種或多種上文所述的賦形劑。本發(fā)明化合物用于口服給藥的液體劑型包括藥學(xué)上可接受的乳劑、微乳劑、溶液、懸浮液、糖漿以及酏劑。除了活性成分以外，液體劑型可包含本領(lǐng)域中常用的惰性稀釋劑，諸如，例如水或其他的溶劑，增溶劑和乳化劑，諸如乙醇、異丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苯甲醇、苯甲酸芐酯、丙二醇、1,3-丁二醇、油(尤其是棉籽、花生、玉米、胚芽、橄欖、蓖麻以及芝麻油)、甘油、四氫呋喃甲醇、聚乙二醇、山梨聚糖的脂肪酸酯以及其混合物。除了惰性稀釋劑之外，口服地組合物也可包括佐劑，諸如濕潤劑、乳化及懸浮劑、甜味劑、香精、著色劑、香料以及防腐劑。懸浮液，除了活性化合物以外，還可包含懸浮劑，例如乙氧基異十八醇、聚氧乙烯山梨糖醇及山梨糖醇酯、微晶纖維素、間氫氧化鋁、膨潤土、瓊脂和黃芪膠、以及其混合物。用于直腸或陰道給藥的制劑可以栓劑呈現(xiàn)，可通過將一個或多個本發(fā)明化合物與一個或多個合適的無刺激性的賦形劑或例如包含可可脂、聚乙二醇、栓劑蠟或水楊酸鹽的載體混合制備栓劑，其在室溫下為固體，體溫下為液體，因此，將在直腸或陰道腔中融化并且釋放活性化合物。用于局部或經(jīng)皮膚給藥的如本文所提供的寡聚物的制劑或劑型包括粉末、噴霧劑、膏劑、糊劑、乳膏劑、洗劑、凝膠劑、溶液、貼片以及吸入劑?；钚怨丫畚锟稍跓o菌狀態(tài)下與藥學(xué)上可接受的載體，任一可能需要的防腐劑、緩沖劑或推進(jìn)劑混合。除了本發(fā)明的活性化合物以外，膏劑、糊劑、乳膏劑和凝膠可包含賦形劑，諸如動物和植物油脂、油、蠟、石蠟、淀粉、黃芪膠、纖維素衍生物、聚乙二醇、硅酮、膨潤土、硅酸、滑石和氧化鋅或其混合物。除了本發(fā)明的寡聚物以外，粉末劑與噴霧劑可包含賦形劑，諸如乳糖、滑石、硅酸、氫氧化鋁、硅酸鈣和聚酰胺粉末，或這些物質(zhì)的混合物。噴霧劑可額外地包含通常的推進(jìn)劑，諸如含氯氟烴和諸如丁烷與丙烷的揮發(fā)性的未取代的烴類。透皮貼劑具有提供本發(fā)明寡聚物的控制遞送至身體的更多的優(yōu)勢。此類劑型可通過將寡聚物溶解或分散在適當(dāng)?shù)慕橘|(zhì)中來制造。吸收增強(qiáng)劑也可用于增加制劑穿過皮膚的通量?？赏ㄟ^提供控制速率的膜或在聚合物基質(zhì)或凝膠中分散制劑控制此類通量的速率，本領(lǐng)域中已知的其他方法中。適用于胃腸外給藥的藥物組合物可包含一個或多個本發(fā)明寡聚物與一個或多個藥學(xué)上可接受的無菌等滲水或非水溶液、分散液、懸浮液或乳化劑、或恰在使用前重組成無菌可注射的溶液或分散液的無菌粉末組合，其可包含糖、醇類、抗氧化劑、緩沖劑、抑菌劑、使得制劑與預(yù)期接受者的血液等滲的溶質(zhì)、懸浮劑或增稠劑?？蓱?yīng)用于本發(fā)明的藥物組合物的合適的水的和非水的載體的實(shí)例包括水、乙醇、多元醇(諸如甘油、丙烯乙二醇、聚乙二醇等)以及其合適的混合物，諸如橄欖油的植物油，諸如油酸乙酯的可注射的有機(jī)酯。例如通過諸如卵磷脂的包衣物質(zhì)的使用，通過維持在分散情況下的所需的顆粒大小以及通過表面活性劑的使用，可以維持適當(dāng)?shù)牧鲃有浴＿@些組合物也可包含佐劑，諸如防腐劑、濕潤劑、乳化劑和分散劑?？赏ㄟ^包含各種抗菌劑和抗真菌劑，例如尼泊金、氯丁醇、苯酚山梨酸等確保預(yù)防微生物對個體寡聚物的作用。理想的是包括等滲劑，諸如糖、氯化鈉等在組合物內(nèi)。另外，可通過包含延遲吸收的制劑諸如單硬脂酸鋁和明膠引起可注射的藥物形式的延長的吸收。在某些情況下，為延長藥物效應(yīng)，理想的是減慢藥物從皮下或肌肉內(nèi)注射的吸收。這可以通過使用具有不良的水溶性的晶體或非晶體物質(zhì)的液體懸浮液的使用來實(shí)現(xiàn)，在本領(lǐng)域中已知的其他方法中。然后藥物的吸收速率取決于它的溶解率，其反過來又取決于晶體大小和結(jié)晶形狀?？蛇x擇地，不經(jīng)腸道給藥的藥物形式的延遲吸收通過藥物在油狀媒介物中溶解或懸浮實(shí)現(xiàn)?？赏ㄟ^在諸如聚交酯-聚乙二醇的可生物降解的聚合物中形成個體的寡聚物的微膠囊基質(zhì)制造可注射的藥性持久形式。取決于寡聚物與聚合物的比率以及所應(yīng)用的特定聚合物的性質(zhì)，寡聚物釋放的速率為可控制的。其他的可生物降解的聚合物的實(shí)例包括聚(原酸酯)和聚(酸酐)。藥性持久的可注射的制劑也可通過將藥物裹入與身體組織相容的脂質(zhì)體或微乳劑來制備。當(dāng)本發(fā)明的寡聚物作為藥物給予人類和動物時，它們可以自身給予或作為例如包含0.1-99％(更優(yōu)選10-30％)活性成分與藥學(xué)上可接受的載體組合的藥物組合物給予。如上文所述，本發(fā)明的制劑或制備可口服地、不經(jīng)腸道地、局部地或直腸地給予。它們通常以適用于每一給藥途徑的形式給予。例如，它們以片劑或膠囊形式給藥，通過注射、吸入、眼用洗劑、膏劑、栓劑等。通過注射、輸注或吸入給藥；局部通過洗劑或膏劑；以及直腸通過栓劑。本文所用的“胃腸外給藥”和“不經(jīng)腸道給藥”意指不同于直腸和局部給藥的給藥模式，通常通過注射，并且包括但不限于靜脈內(nèi)的、肌肉內(nèi)的、動脈內(nèi)的、鞘內(nèi)的、囊內(nèi)的、眼眶內(nèi)的、心臟內(nèi)的、皮膚內(nèi)的、腹膜內(nèi)的、經(jīng)氣管的、皮下的、表皮下的、關(guān)節(jié)內(nèi)的、被膜下的、蛛網(wǎng)膜下的、椎管內(nèi)的、胸骨內(nèi)的注射以及輸注。本文所用的短語“全身給藥”、“系統(tǒng)地給藥”、“外圍的給藥”以及“外圍地給藥”意指化合物、藥物或其他的物質(zhì)的給藥不同于直接到達(dá)中樞神經(jīng)系統(tǒng)，從而使得它進(jìn)入患者的系統(tǒng)并且因此受到新陳代謝及其他相似的過程，例如皮下給藥。不管所選擇的給藥途徑，可用于合適的水合形式的本發(fā)明的寡聚物和/或本發(fā)明的藥物組合物可通過本領(lǐng)域中技術(shù)人員已知的常規(guī)方法，被配制成藥學(xué)上可接受的劑型。本發(fā)明的藥物組合物中的活性成分的實(shí)際劑量水平是多變的以便獲取有效的針對特定患者實(shí)現(xiàn)理想的治療反應(yīng)的活性成分的量以及給藥模式，沒有不能被患者接受的毒性。選擇的劑量水平將取決于各種因素，包括本發(fā)明所應(yīng)用的特定寡聚物或其酯、鹽或酰胺的活性，給藥途徑，給藥時間，所應(yīng)用的特定的寡聚物的排泄或新陳代謝的速率，吸收的速率和程度，治療的持續(xù)時間，其他的藥物、化合物和/或所使用的與應(yīng)用的特定的寡聚物組合的物質(zhì)，年齡，性別，體重，狀態(tài)，健康狀況以及被治療患者的早前的治療史以及醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中熟知的相似的因素。具有普通技能的內(nèi)科醫(yī)師或獸醫(yī)可容易地確定及開具所需的藥物組合物的有效量。例如，內(nèi)科醫(yī)師或獸醫(yī)開始藥物組合物中應(yīng)用的本發(fā)明的化合物的劑量水平低于所需的以便實(shí)現(xiàn)理想的治療效果并且逐漸地增加劑量直到獲得理想的效果。通常，本發(fā)明化合物的合適的每日劑量為有效產(chǎn)生治療效果的最低的劑量的化合物的量。此類有效劑量通常取決于上文所述的因素。通常，本發(fā)明化合物用于患者的口服的、靜脈內(nèi)的、腦室內(nèi)的以及皮下的劑量，當(dāng)用于顯示效應(yīng)時，范圍從約0.0001-約100mg/kg體重/天。若需要，活性化合物的有效的每日劑量可以適當(dāng)?shù)恼扉g隔，任選地以單位劑型分別給藥，給予2個、3個、4個、5個、6個或更多的亞劑量。在某些情況下，劑量為1給藥/天。在某些實(shí)施方案中，劑量為1個或多個給藥/每2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14天或每1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12個周或每1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12個月，如所需要的，以減少流感病毒復(fù)制。通過各種本領(lǐng)域中熟悉的那些已知的方法給予細(xì)胞核酸分子，包括但不限于封裝在脂質(zhì)體中，通過離子導(dǎo)入法或通過摻入到其他的媒介物，諸如水凝膠、環(huán)糊精、可生物降解的納米膠囊以及生物黏附微球，如本文所述的，本領(lǐng)域中已知的。在某些實(shí)施方案中，可利用微乳化技術(shù)以改進(jìn)親脂性的(非水溶性)藥物制劑的生物利用度。實(shí)例包括trimetrine(dordunoo,s.k.,etal.,drugdevelopmentandindustrialpharmacy,17:1685-1713,1991)和rev5901(sheen,p.c,etal.pharmsci.80:712-714,1991)。在其他的利益中，微乳化提供了通過將吸收優(yōu)選導(dǎo)向淋巴系統(tǒng)取代循環(huán)系統(tǒng)，其因此繞開肝臟及預(yù)防化合物在肝膽循環(huán)中摧毀提供了增強(qiáng)的生物利用度。在本發(fā)明的一方面，制劑包含形成于本文所提供的膠束并且至少一個兩性分子的載體，其中膠束具有小于約100nm的平均直徑。更優(yōu)選的實(shí)施方案提供了具有小于約50nm的平均直徑的膠束和甚至更優(yōu)選的實(shí)施方案提供了具有小于約30nm的平均直徑，或甚至小于約20nm的膠束。雖然關(guān)注所有合適的兩性分子的載體，但是目前優(yōu)選的載體通常為具有一般認(rèn)為安全(gras)狀態(tài)的那些，使本發(fā)明的化合物溶解并且在稍后的階段使其微乳化，當(dāng)溶液進(jìn)入與復(fù)合的水相接觸時(諸如人類胃腸道中所發(fā)現(xiàn)的一個)。通常，滿足這些要求的兩性分子的成分具有2-20個hlb(親水親油均衡)值，并且它們的結(jié)構(gòu)包含范圍c-6-c-20直鏈脂肪族基團(tuán)。實(shí)例為聚乙烯-乙酰胺的脂肪酸甘油酯和聚乙二醇。兩性分子的載體實(shí)例包括飽和的及單不飽和的聚乙二醇的脂肪酸甘油酯，諸如獲取自完全地或部分地氫化的各種各樣的植物油的那些。此類油可有利地由相應(yīng)的脂肪酸的三元的、二元的、單元的脂肪酸甘油酯及二元的和單元的聚乙二醇酯，帶有特別優(yōu)選的脂肪酸組合物包括癸酸4-10，癸酸3-9，月桂酸40-50，肉豆蔻酸14-24，棕櫚酸4-14以及硬脂酸5-15％。另一有用的兩性分子的載體類別包括部分酯化的山梨糖醇酐和/或山梨醇，帶有飽和的或單不飽和的脂肪酸(span系列)或相應(yīng)的乙氧基的對應(yīng)物(tween系)?？缮藤彽膬尚苑肿拥妮d體可為特別有用的，包括gelucire系列、labrafil、酸甘油酯(labrasol)或lauroglycol(所有都通過gattefossecorporation,saintpriest,france生產(chǎn)和分布)、peg-單一-油酸鹽、peg-二元-油酸鹽，peg-單一-月桂酸鹽以及二元-月桂酸鹽、卵磷脂、聚山梨醇酯80等(許多美國和世界各地的公司生產(chǎn)及分布)。在某些實(shí)施方案中，通過脂質(zhì)體、納米膠囊、微粒、微球、脂質(zhì)顆粒、囊泡等的使用可發(fā)生遞送，將本發(fā)明的組合物引入至合適的宿主細(xì)胞。尤其本發(fā)明的組合物可配制用于遞送封裝在液體顆粒、脂質(zhì)體、囊泡、納米球、納米顆粒等。此類遞送媒介物的配制及使用可利用已知的常規(guī)的技術(shù)進(jìn)行。適用于本發(fā)明的親水聚合物為易于溶于水的的那些，可共價地附加至形成囊泡的脂質(zhì)并且其在體內(nèi)沒有毒性作用，可接受的(即生物相容性)。合適的聚合物包括聚乙二醇(peg)、聚乳酸(也稱為聚交酯)、聚乙醇酸(也稱為聚乙交酯)、聚乳酸-聚乙醇酸共聚物以及聚乙烯醇。在某些實(shí)施方案中，共聚物具有分子量約100或120道爾頓-約5000或10000道爾頓，或約300道爾頓-約5000道爾頓。在其他的實(shí)施方案中，共聚物為具有分子量約100-約5000道爾頓或具有分子量約300-約5000道爾頓的聚乙二醇。在某些實(shí)施方案中，共聚物為750道爾頓的聚乙二醇(peg(750))。共聚物也可通過其中的單體數(shù)量所定義；本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案利用至少約3個單體的共聚物，由3個單體組成的此類peg共聚物(大約150道爾頓)?？蛇m用于本發(fā)明的其他的親水聚合物包括聚乙烯吡咯烷酮、聚甲氧基噁唑啉、聚乙基噁唑啉、聚羥丙基、甲基丙烯酰胺、聚甲基丙烯酰胺、聚二甲基丙烯酰胺以及衍生的纖維素，諸如羥甲基纖維素或羥乙基纖維素。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的制劑包含選自由以下組成的生物相容性聚合物：聚酰胺、聚碳酸酯、聚烯烴、丙烯酸與甲基丙烯酸酯的聚合物、聚乙烯聚合物、聚乙二醇、聚硅氧烷、聚氨酯以及其共聚物、纖維素、聚丙烯、聚乙烯、聚苯乙烯、乳酸與乙醇酸的聚合物、聚酸酐、聚(鄰)酯、聚(butic酸)、聚(戊酸)、聚(乳酸-共-己內(nèi)酯)、多聚糖、蛋白、聚透明質(zhì)酸、聚丙烯酸氰基酯以及其融合物、混合物或共聚物。環(huán)糊精為環(huán)狀的寡聚糖，由6個、7個或8個葡萄糖單元組成，各自被稱為希臘字母α、β或γ。葡萄糖單元通過α-1,4糖苷鍵連接。由于糖單元椅型構(gòu)象的結(jié)果，所有的仲醇羥基(c2,c3上)都位于環(huán)的一側(cè)，而c6上所有的伯醇羥基都位于另一側(cè)。因此，外表面為親水的，這使得環(huán)糊精為水溶性的。相反，環(huán)糊精的腔為疏水性的，因?yàn)樗鼈兺ㄟ^c3與c5原子的氫鍵以及類醚的氧連接。這些基質(zhì)允許與各種各樣相對疏水性化合物絡(luò)合，例如包括諸如17α-雌二醇的類固醇化合物。絡(luò)合通過范德華力(vanderwaalsinteractions)和形成氫鍵發(fā)生。為進(jìn)行環(huán)糊精的化學(xué)綜述，見wenz,agnew,chem.int.ed.engl,33:803-822,1994。環(huán)糊精衍生物的理化性質(zhì)強(qiáng)烈地取決于取代的種類與程度。例如，它們的水溶性范圍自不可溶的(例如三乙酰-β-環(huán)糊精)-147％可溶的(w/v)(g-2-β-環(huán)糊精)。另外，它們在許多有機(jī)溶劑中是可溶的。環(huán)糊精的特性使得能夠通過增加或減少它們的溶解度控制各種制劑組分的溶解度。已描述了眾多的環(huán)糊精以及他們的制備方法。例如，parmeter(i)etal.(u.s.pat.no.3,453,259)和grameraetal.(u.s.pat.no.3,459,731)描述了電中性的環(huán)糊精。其他的衍生物包括帶有陽離子特性的環(huán)糊精(parmeter(ii),u.s.pat.no.3,453,257)，不可溶解的交聯(lián)的環(huán)糊精(solms,u.s.pat.no.3,420,788)以及帶有陰離子特性的環(huán)糊精(parmeter(iii),u.s.pat.no.3,426,011)。在帶有陰離子特性的環(huán)糊精衍生物中，羧酸、磷酸、三價膦酸、膦酸、含磷的酸、硫代膦酸、硫代硫酸以及硫酸已被添加到母體的環(huán)糊精(見parmeter(iii),supra)。而且，磺烷基醚環(huán)糊精衍生物已被stellaetal.(u.s.pat.no.5,134,127)描述。脂質(zhì)體由至少一層封閉水內(nèi)部隔間的脂質(zhì)雙層膜組成。脂質(zhì)體通過膜的類型和大小而表征化。小單層囊泡(suvs)具有單一的膜并且通常范圍在0.02-0.05μπι直徑；大單層囊泡(luvs)通常大于0.05μπι。寡聚層的大囊泡與多層的囊泡具有多重的，通常同心的薄膜層并且通常大于0.1μπι。帶有幾層非同心膜的脂質(zhì)體，即被包含在較大的囊泡內(nèi)的幾個較小的囊泡，被稱為多泡的囊泡。本發(fā)明的一方面涉及包含脂質(zhì)體的制劑，該脂質(zhì)體含本發(fā)明的寡聚物，其中配制脂質(zhì)體膜以提供帶有增強(qiáng)運(yùn)輸能力的脂質(zhì)體?？蛇x擇地或另外，本發(fā)明的化合物可被包含在脂質(zhì)體雙分子層內(nèi)或吸附到脂質(zhì)體的脂質(zhì)體雙分子層上。本發(fā)明的寡聚物可與脂質(zhì)表面活性劑聚合并且被運(yùn)至脂質(zhì)體的內(nèi)部空間內(nèi)；在這種情況下，配制脂質(zhì)體膜以耐受活性劑-表面活性劑聚合的破壞性影響。根據(jù)本發(fā)明的一個實(shí)施方案，脂質(zhì)體的脂質(zhì)雙分子層包含與聚乙二醇衍生的脂質(zhì)，從而使得peg鏈從脂質(zhì)雙分子層的內(nèi)表面延伸至脂質(zhì)體所封裝的內(nèi)部空間，并且從脂質(zhì)雙分子層的外部延伸至周圍環(huán)境。本發(fā)明的脂質(zhì)體內(nèi)所包含的活性劑為溶解的形式。根據(jù)本發(fā)明，表面活性劑與活性劑(諸如包含感興趣的活性劑的乳劑或膠束)的聚合可被裹入脂質(zhì)體的內(nèi)部空間內(nèi)。表面活性劑采取作用使活性劑分散及溶解，并且可選自任一合適的脂肪族的、脂環(huán)族的或芳香族的表面活性劑，包括但不限于不同鏈長(例如約c14-約c20)的生物相容性溶血磷脂膽堿(lpcs)。也可利用聚合物衍生的脂質(zhì)，諸如peg-脂質(zhì)用于膠束形成，因?yàn)樗鼈儗⒆饔靡种颇z束/膜融合，并且因?yàn)榫酆衔锾砑又帘砻婊钚詣┙档土吮砻婊钚詣┑腸mc并且有助于膠束形成。優(yōu)選的是微摩爾范圍內(nèi)帶有cmcs的表面活性劑；可利用較高的cmc表面活性劑以制備裹入到本發(fā)明的脂質(zhì)體內(nèi)的膠束。根據(jù)本發(fā)明，可通過任一本領(lǐng)域中已知的各種技術(shù)制備脂質(zhì)體，例如見美國專利申請第4,235,871號；出版的pct專利申請wo96/14057；新的rrc，脂質(zhì)體：實(shí)用方法，irl出版，牛津(1990)，33-104頁(liposomes:apracticalapproach,irlpress,oxford(1990),pages33-104)；lasicdd,liposomesfromphysicstoapplications,elseviersciencepublishersbv,amsterdam,1993)。例如，制備本發(fā)明的脂質(zhì)體可通過將衍生于親水聚合物的脂質(zhì)擴(kuò)散進(jìn)預(yù)先形成的脂質(zhì)體，諸如通過將預(yù)先形成的脂質(zhì)體暴露于由接合脂質(zhì)的聚合物組成的膠束，與脂質(zhì)體中理想的衍生的脂質(zhì)最終的摩爾百分?jǐn)?shù)一致的脂質(zhì)濃度。包含親水聚合物的脂質(zhì)體也可通過如本領(lǐng)域中已知的均化作用、脂質(zhì)場水合作用或擠壓技術(shù)而形成。在另一示例性形成程序中，首先通過溶血卵磷脂或其他的易于使疏水性分子溶解的低cmc表面活性劑(包括接合聚合物的脂質(zhì))中聲波降解法分散活性劑。然后將由此得到的活性劑的膠束懸浮液用于再水化干燥的包含合適的摩爾百分?jǐn)?shù)的接合聚合物的脂質(zhì)或膽固醇的脂質(zhì)樣品。然后利用如本領(lǐng)域中已知的擠壓技術(shù)將脂質(zhì)與活性劑的懸浮液形成脂質(zhì)體，并且通過標(biāo)準(zhǔn)的柱分離將由此得到的脂質(zhì)體從未封裝的溶液中分離出來。在本發(fā)明的一方面，制備脂質(zhì)體以具有在選擇的大小范圍內(nèi)基本上均勻的大小。有效的分篩方法涉及通過一系列具有選擇的均一孔徑的聚碳酸酯膜擠壓脂質(zhì)體的水懸浮液；膜的孔徑大致對應(yīng)通過穿過那個膜的擠壓所產(chǎn)生的脂質(zhì)體的最大孔徑。例如見美國專利申請第4,737,323號。在某些實(shí)施方案中，可利用諸如與的試劑以將多核苷酸或蛋白引入至細(xì)胞。本發(fā)明制劑的釋放特征取決于封裝材料、被封裝藥物的濃度以及釋放改變劑的存在。例如，控制釋放可為ph依賴性的，例如，利用只在如在胃里的低ph下或如在腸道里的較高ph下釋放的ph敏感的包衣。腸溶包衣可用于預(yù)防釋放發(fā)生直至穿過胃之后。多重包衣或封裝在不同材料中氨腈的混合物可用于獲得胃中的最初釋放，隨后腸道中更遲的釋放。也可通過內(nèi)含鹽或造孔劑控制釋放，造孔劑可以通過從膠囊擴(kuò)散增加水分?jǐn)z取或藥物釋放。改變藥物溶解度的賦形劑也可用于控制釋放率。也可摻入增強(qiáng)基質(zhì)降解或從基質(zhì)釋放的制劑。它們被添加至藥物，作為單獨(dú)相(即如微粒)添加，或可在聚合物相中為共溶解的，取決于化合物。在大部分情況下，量應(yīng)該在0.1-30％(w/w聚合物)。降解增強(qiáng)劑的類型包括諸如硫酸銨和氯化銨的無機(jī)鹽，諸如檸檬酸、苯甲酸以及抗壞血酸的有機(jī)酸，諸如碳酸鈉、碳酸鉀、碳酸鈣、碳酸鋅以及氫氧化鋅的無機(jī)堿，諸如硫酸魚精蛋白、精胺、膽堿、乙醇胺、二乙醇胺以及三羥乙基胺的有機(jī)堿，諸如與的表面活性劑。增加微結(jié)構(gòu)至基質(zhì)的造孔劑(即水溶性化合物，諸如無機(jī)鹽與糖)作為微粒被添加。通常范圍在1％-30％(w/w聚合物)。通過改變微粒在消化道的停留時間也可控制攝取。例如可以通過用或選擇作為封裝材料、粘膜粘附聚合物包裹微粒實(shí)現(xiàn)這一目的。實(shí)例包括大部分帶有游離羧基的聚合物，諸如殼聚糖、纖維素以及特別是聚丙烯酸酯(如本文所用的，聚丙烯酸酯指包括丙烯酸酯和諸如氨基丙烯酸酯和甲基丙烯酸酯的修飾的丙烯酸酯)。配制寡聚物以通過外科或醫(yī)療器械或移植包含入或適合釋放。在某些方面，包裹植入物或相反用寡聚物治療植入物。例如，水凝膠或其他的聚合物，諸如生物相容性和/或可生物降解的聚合物，可用于用本發(fā)明的組合物包裹植入物(即通過使用水凝膠或其他的聚合物使組合物適合于醫(yī)療器械使用)。用于用制劑包裹醫(yī)療器械的聚合物與共聚物為本領(lǐng)域中熟知的。植入物的實(shí)例包括但不限于支架、藥物涂層支架、縫合線、假肢、血管導(dǎo)管、透析導(dǎo)管、人造血管、人工心臟瓣膜、心臟起搏器、植入型心律轉(zhuǎn)復(fù)除顫器、iv針、諸如大頭針、螺絲、平板的用于正骨和骨形成的器械，其他的器械以及用于傷口愈合的人造組織基質(zhì)。除了本文所提供的方法以外，本發(fā)明所使用的寡聚物可配制用于以任一便捷的方式給藥以用于人類或獸醫(yī)，通過與其他的藥物類比。反義寡聚物與它們相應(yīng)的制劑在流感病毒感染的治療中可單獨(dú)給藥或與其他的治療策略聯(lián)合給藥(例如奧司他韋，其市場商品名為)。根據(jù)本發(fā)明，反義寡聚物的遞送途徑包括但不限于各種系統(tǒng)的途徑，包括口服和胃腸外途徑，例如靜脈內(nèi)的、皮下的、腹膜內(nèi)的和肌肉內(nèi)的、以及吸入、經(jīng)皮膚的、肺部的和局部遞送。本領(lǐng)域中技術(shù)人員可確定適當(dāng)?shù)耐緩剑曋委熤袀€體的狀態(tài)而定。例如，皮膚的病毒感染治療中，適當(dāng)?shù)挠糜诜戳x寡聚物遞送的途徑為局部遞送，而用于病毒的呼吸系統(tǒng)感染的治療得反義寡聚物的遞送為通過吸入、鼻內(nèi)的或肺部遞送。寡聚物也可直接遞送至病毒感染的部位或血液循環(huán)。反義寡聚物可以任一便捷的生理學(xué)可接受的媒介物給藥。此類組合物可包括任一各種各樣的標(biāo)準(zhǔn)的藥學(xué)上可接受的本領(lǐng)域中普通技術(shù)人員所應(yīng)用的載體。實(shí)例包括但不限于鹽水、磷酸鹽緩沖鹽溶液(pbs)、水、乙醇水溶液、諸如油/水乳劑或甘油三酯乳劑的乳劑、片劑以及膠囊。合適的生理學(xué)上可接受的載體的選擇因所選擇的給藥模式而不同。在一些情況下，如上文所述，可應(yīng)用脂質(zhì)體以促進(jìn)細(xì)胞對反義寡核苷酸的攝取(例如見williams,s.a.,leukemia.10(12):1980-1989,1996；lappalainenetal.,antiviralres.23:119,1994；uhlmannetal,antisenseoligonucleotides:anewtherapeuticprinciple,chemicalreviews,volume90,no.4,pages544-584,1990；gregoriadis,g.,chapter14,liposomes,drugcarriersinbiologyandmedicine,pp.287-341,academicpress,1979)。水凝膠也可用作媒介物用于反義寡聚物給藥，例如，如wo93/01286或pct專利申請us1992/005305號所述?？蛇x擇地，寡核苷酸以微球或微粒給藥(例如見wu,g.y.andwu,c.h.,/.biol.chem.262:4429-4432,1987)。可選擇地，與反義寡聚物復(fù)合的充氣的微泡的使用可增強(qiáng)遞送至靶組織，如美國專利申請第6,245,747號所述。也可使用緩釋組合物。這些可包括特型制品形式的半滲透的聚合物基質(zhì)，諸如膜劑或微囊劑。在方法的一方面，個體為人類個體，例如被診斷患有局部的或全身的病毒感染的患者?；颊叩臓顟B(tài)也可指示。例如，本發(fā)明的反義寡聚物的預(yù)防性給藥，例如在患者為(1)免疫功能低下的；(2)燒傷；(3)有留置導(dǎo)管；或(4)將接受或最近接受了手術(shù)的情況下。在一優(yōu)選的實(shí)施方案中，寡聚物為磷二酰胺嗎啉寡聚物，包含在藥學(xué)上可接受的載體中，口服給藥。在另一優(yōu)選的實(shí)施方案中，寡聚物為磷二酰胺啉寡聚物，包含在藥學(xué)上可接受的載體中，靜脈內(nèi)給藥(i.v)。反義化合物可以有效導(dǎo)致最高的血液濃度至少200-400nm反義寡聚物的量和方式給藥。通常，給予一種或多種劑量的反義寡聚物，通常以規(guī)律的間隔，約1-2周的時間段。用于口服給藥的優(yōu)選的劑量為約1-100mg寡聚物/70kg。在一些情況下，可需要大約100mg寡聚物/患者的劑量。對i.v.給藥而言，反義寡聚物可以規(guī)律的間隔短時間給藥，例如兩周或更少的。每日。然而，在一些情況下，寡聚物間隔地給藥較長的時間段?？股亟o藥或其他治療處理可在跟隨在給藥后或與給藥同時?？扇缢镜恼{(diào)整治療方案(劑量、頻率、途徑等)，基于免疫測定、其他的生物化學(xué)測試以及治療中個體的生理學(xué)檢查的結(jié)果。治療的監(jiān)測利用本發(fā)明反義寡核苷酸的有效的體內(nèi)治療方案可因持續(xù)時間、劑量、頻率和給藥途徑，以及治療中個體的狀態(tài)而不同(即預(yù)防性給藥與響應(yīng)局部的或全身的感染的給藥相對)。因此，此類體內(nèi)療法將經(jīng)常要求監(jiān)測，通過適合于治療中病毒感染的特定類型的試驗(yàn)以及劑量或治療方案中的相應(yīng)調(diào)整以便實(shí)現(xiàn)最佳的治療結(jié)果?？赏ㄟ^感染的一般指標(biāo)，諸如全血細(xì)胞計數(shù)(cbc)、核酸檢測方法、免疫診斷試驗(yàn)、病毒培養(yǎng)或異源雙鏈體的檢測監(jiān)測治療?？蓮娜∽越o予個體反義寡聚物之前、期間以及隨后的生物學(xué)樣品(組織、血液、尿液等)中檢測本發(fā)明反義寡聚物體內(nèi)給藥以抑制或消除一種或多種類型的rna病毒生長的功效。此類樣品的測定包括(1)利用本領(lǐng)域中技術(shù)人員已知的程序，例如凝膠電泳流動分析，監(jiān)測與靶序列和非靶序列所形成的異源雙鏈體的存在或不存在；(2)如通過諸如elisa或免疫印跡(westernblotting)的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，監(jiān)測病毒蛋白產(chǎn)生的量，或(3)測量對病毒滴度的影響，例如通過spearman-karber的方法(例如見pari,g.s.etal.,antimicrob.agentsandchemotherapy.39(5):1157-1161,1995；anderson,k.p.etal.,antimicrob.agentsandchemotherapy.40:2004-2011,1996；cottral,g.e.(ed)in:manualofstandardmethodsforveterinarymicrobiology,pp.60-93,1978)。參考文獻(xiàn)abes,r.,h.m.moulton,etal.(2008)."deliveryofstericblockmorpholinooligomersby(r-x-r)4peptides:structure-activitystudies."nucleicacidsres.cox,n.j.andk.subbarao(1999)."influenza."lancet354(9186):1277-82.cox,n.j.andk.subbarao(2000)."globalepidemiologyofinfluenza:pastandpresent."annurevmed51:407-21.egholm,m.,o.buchardt,etal.(1993)."pnahybridizestocomplementaryoligonucleotidesobeyingthewatson-crickhydrogen-bondingrules."nature365(6446):566-8.jearawiriyapaisarn,n.,h.m.moulton,etal.(2008)."sustaineddystrophinexpressioninducedbypeptide-conjugatedmorpholinooligomersinthemusclesofmdxmice."molther.marshall,n.b.,s.k.oda,etal.(2007)."arginine-richcell-penetratingpeptidesfacilitatedeliveryofantisenseoligomersintomurineleukocytesandalterpre-mrnasplicing."journalofimmunologicalmethods325(1-2):114-126.moulton,h.m.,m.h.nelson,etal.(2004)."cellularuptakeofantisensemorpholinooligomersconjugatedtoarginine-richpeptides."bioconjugchem15(2):290-9.munster,v.j.,e.dewit,etal.(2009)."pathogenesisandtransmissionofswine-origin2009a(h1n1)influenzavirusinferrets."science.stein,c.a.,j.b.hansen,etal.(2010)."efficientgenesilencingbydeliveryoflockednucleicacidantisenseoligonucleotides,unassistedbytransfectionreagents."nucleicacidsres38(1):e3.strauss,j.h.ande.g.strauss(2002).virusesandhumandisease.sandiego,academicpress.summerton,j.andd.weller(1997)."morpholinoantisenseoligomers:design,preparation,andproperties."antisensenucleicaciddrugdev7(3):187-95.wu,b.,h.m.moulton,etal.(2008)."effectiverescueofdystrophinimprovescardiacfunctionindystrophin-deficientmicebyamodifiedmorpholinooligomer."procnatlacadsciusa105(39):14814-9.本說明書中所提到的所有出版物和專利申請都通過引用的方式并入本文，如同每篇獨(dú)立的出版物和專利被特別且單獨(dú)指出通過引用的方式并入一樣。盡管為了理解清晰，已借助例證和實(shí)例相當(dāng)詳細(xì)地描述了上述發(fā)明，但顯然，根據(jù)本發(fā)明的教導(dǎo)，對本領(lǐng)域普通技術(shù)人員而言，在沒有背離所附加的權(quán)利要求的精神和范圍的情況下，可對本發(fā)明做某些改變和修飾。僅以說明而非限制的方式，提供下述實(shí)施例。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)很容易地認(rèn)識到，可以改變或修飾以產(chǎn)生基本類似結(jié)果的各種非關(guān)鍵性參數(shù)。實(shí)施例a.材料和方法所有的肽由globalpeptideservices(ft.collins,co)或avibiopharma(corvallis,or)定制合成并且純化至>90％純度(見下列的實(shí)施例2)。根據(jù)已知的方法由avibiopharma合成pmo，例如(summertonandweller1997)和美國專利申請第5,185,444號所述的，并且進(jìn)一步描述于pct專利申請us08/012804號的方法。pmo的示例性結(jié)構(gòu)如圖1a-c中所示。由integrateddnatechnologiesinc.,skokie,il合成2’-ome寡聚物。由biosynthesis,inc.,lewisville,tx產(chǎn)生lna寡聚物。如(美國專利申請第7,468,418號，pct專利申請us08/008168號以及(marshall,odaetal.2007；abes,moultonetal.2008))所述，一些pmo寡聚物在3’末端由富精氨酸肽((rahxrrbr)2ahxb或(rahxr)4ahxb；各自為seqidno:124與118)連接以形成肽連接的pmo(ppmo)，從而增強(qiáng)細(xì)胞攝取。可用于制造含(1-哌嗪)氧亞膦羥基鍵的嗎啉亞基的合成路徑描述于pct專利申請us07/011435號并且下文提供了用于代表性合成的進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)細(xì)節(jié)。哌嗪與三苯基氯甲烷的反應(yīng)產(chǎn)生三苯甲基哌嗪，其作為琥珀酸鹽被分離出來。弱堿(諸如二異丙基乙胺或diea)存在的情況下與三氟乙酸乙酯反應(yīng)提供1-三氟乙酰基-4-三苯甲基哌嗪，其即刻與hcl反應(yīng)以提供良好產(chǎn)率的鹽。用甲苯中的三氯氧磷將二氯磷?；糠忠?。氯化?；c嗎啉亞基(mon)反應(yīng)以提供激活的亞基，其可如美國專利申請第5,185,444號或summertonandweller,1997(上文引用的)所述并且進(jìn)一步地描述于pct專利申請us08/012804號。必要時，合適的保護(hù)基被用于核苷堿基；例如，苯甲酰用于腺嘌呤和胸腺嘧啶，苯乙酰用于鳥嘌呤以及三甲基乙酰甲基用于肌苷。含(1-哌嗪)氧亞膦羥基鍵的亞基可以并入到現(xiàn)存的pmo合成協(xié)議，例如如summertonandweller(1997)所述，未加修飾。實(shí)施例1小鼠模型系統(tǒng)中甲型流感病毒的抑制甲型流感病毒感染的小鼠模型被用于檢測感染的代表性反義寡聚物的體內(nèi)功效。經(jīng)由50微升內(nèi)大約4×104個空斑形成單位的鼻內(nèi)給藥，甲型流感病毒亞型h2n3(portchalmers/1/73)被用于感染balb/c雌性小鼠。研究使用每組12只小鼠，第2天移除6只以檢測病毒滴度并且第6天移除6只以檢測病毒滴度。二級終點(diǎn)包括防止體重減輕和存活。三種測試的反義寡聚物化合物，如表1和下列的表6中所列舉的pb1-aug+15、m1/m2-aug和np-v3’(seqidno:12,13與30-33)，被評估為肽連接的(ppmo)和正電荷鍵化學(xué)(pmoplustm)。利用連接至pmo3’末端的cp06062肽(seqidno:124)合成ppmo。每一測試制劑以三種劑量水平評估(10,30和100微克)以建立劑量依賴的關(guān)系。經(jīng)由鼻內(nèi)途徑加量，開始于第0天感染前4小時，然后4天內(nèi)每天總共5劑量。研究的主要終點(diǎn)為肺中病毒滴度降低，以空斑形成單位/g肺組織衡量。表6.h3n2小鼠模型中所使用的反義寡聚物圖6顯示感染后第6天對病毒滴度的影響。每一病毒滴度為被治療的動物6個ppmo與6個pmoplustm的平均值。m1/m2-aug靶向的化合物(seqidno:12與13)表現(xiàn)出，與其他測試的化合物比較，基本上更大的活性。利用靶向于登革熱(dengue)病毒的不相關(guān)的ppmo與pmoplustm序列獲得圖6中所示的來自于陰性對照的登革熱(dengue)處理的病毒滴度。實(shí)施例2雪貂模型系統(tǒng)中甲型流感病毒的抑制支持本發(fā)明的一個觀察為本發(fā)明的化合物在馴養(yǎng)的雪貂(mustelaputousfuro)動物模型系統(tǒng)中展現(xiàn)的抗病毒功效，利用新的h1n12009(s-oiv)病毒。雪貂模型的優(yōu)勢包括使用天然的流感病毒的人類分離株的能力，與鼠適應(yīng)株相反，并且人體內(nèi)所觀察到的大多數(shù)臨床體征諸如發(fā)熱和流鼻涕的發(fā)展(munster,dewitetal.2009)。用抵抗達(dá)菲(tamiflu)的h1n1株感染6只雪貂，該h1n1株來自于2009年獲取于疾病控制中心(大流行的豬流感)。病毒感染的途徑為鼻內(nèi)的(4×104個空斑形成單位)第1天，通過腹膜內(nèi)(ip)注射pmoplustm化合物或鼻內(nèi)(in)給予ppmo化合物加量。靶向于登革熱的陰性對照pmoplustm(30mg/kgip劑量)和ppmo(1.5mg/kgin劑量)化合物如上文實(shí)施例1中所述的給藥。劑量對于pmoplustm化合物而言為10，對于ml/m2-augplus(seqidno:13；avi-7100)而言為30mg/kg，對于連接在3’末端-seqidno:124的m1/m2-augppmo(seqidno:12)而言為0.5與1.5mg/kg。感染前4小時、第1天、3天、5天進(jìn)行加量。達(dá)菲(奧司他韋oseltamivir)作為陽性抗病毒的對照給藥，平行于反義化合物。鹽水也包括在內(nèi)作為陰性對照。生命中的觀察結(jié)果包括體重增加(圖7a)、打噴嚏(圖7b)、流鼻涕(圖7c)以及呼吸窘迫(圖7d)。m1/m2-aug靶向的化合物防止體重減輕，減少打噴嚏、流鼻涕以及呼吸窘迫。從感染后第1天-第5天來自于洗鼻液的病毒滴度顯示于圖7e中，表示為曲線下面積(auc)組織培養(yǎng)感染的劑量(tcid)。m1/m2-augppmo制劑顯示了2.3對數(shù)降低，相對于鹽水(99.6％降低)以及1.1對數(shù)降低大于達(dá)菲(94.4％)。為進(jìn)一步評估avi-7100(seqidno:13)，在被非適應(yīng)性-抵抗奧司他韋hin1(soiv)大流行的流感病毒感染的雪貂中，測試靶向于流感病毒m1/m2節(jié)段翻譯起始位點(diǎn)的pmoplus。在該研究中利用總共36只雄性雪貂。研究起始時匹配的約700g體重的雄性雪貂被隨機(jī)分成5個處理組的其中之一(下文表7所示)，圈養(yǎng)于高效能空氣粒子過濾的籠子中(每籠4只)以使病毒傳播在籠-籠最小化。籠子保持在杜蘭大學(xué)醫(yī)學(xué)中心bsl-2實(shí)驗(yàn)室(tulaneuniversitymedicalcenterbsl-2laboratory)。表7.雪貂研究設(shè)計用avi-7100在病毒沖擊前1-4小時處理雪貂。給藥途徑為腹膜內(nèi)，針對組2、3和5；口服針對組1。劑量間隔為病毒沖擊后-4小時、24小時、48小時、72小時、96小時以及120小時。處理5組如下：組1接受奧司他韋5mg/kg每12小時口服給藥，組2接受avi-7100(pmoplus化合物；5’-cggt+tagaagac+tcatc+ttt-3’)10mg/kg劑量，通過i.p.給藥，組3接受avi-7100(pmoplus化合物)30mg/kg劑量，通過i.p.給藥，組4接受無菌的鹽水對照通過i.p.給藥，組5接受avi-710010mg/kg每天一次通過i.p.給藥以及奧司他韋5mg/kg每天兩次。組大小在組1-2(每組8只雪貂)與組4-5(每組6只雪貂)間差異的原因可歸于在研究啟動時血清反應(yīng)陰性的甲型流感病毒的有限利用度。所有參與該研究的雪貂都存活到研究結(jié)束，感染后第8天，提示這些動物非常健康或該特定的病毒在該模型中不是非常致病的。盡管如此，如下文所示，這些結(jié)果不但表明avi-7100處理，相對于未處理的或奧司他韋處理的對照，顯著地減少了流感病毒感染的癥狀，而且說明avi-7100與奧司他韋的聯(lián)合可獲得協(xié)同效應(yīng)。臨床的觀察結(jié)果的總結(jié)顯示于下列的表8中。表8.臨床的觀察結(jié)果作為進(jìn)一步的提示，對滲入到上呼吸道的細(xì)胞的觀察結(jié)果為感染的嚴(yán)重程度的測量。洗鼻液中巨噬細(xì)胞結(jié)構(gòu)的總結(jié)被包括于下列的表9。另外，未處理的與奧司他韋處理的雪貂顯示肺內(nèi)顯著的充血，伴有明顯的肺泡炎(肺部炎癥)，大量侵潤性細(xì)胞包括淋巴細(xì)胞和中性粒細(xì)胞，以及肺中度增厚的肺泡壁。與此相反，avi-7100處理的雪貂(有或無奧司他韋)顯示肺部沒有充血，只有輕微的肺泡炎和少許的浸潤性細(xì)胞。表9.上呼吸道中巨噬細(xì)胞結(jié)構(gòu)組平均值±標(biāo)準(zhǔn)差第3天峰達(dá)菲2.98±2.717.91±7.28m1-302.78±2.971.59±1.28m1-104.34±3.823.88±4.73鹽水5.02±3.772.41±3.24m1+達(dá)菲4.27±3.100.91±1.25如下列的表10所示，在第1天觀察到洗鼻液中病毒血癥峰值。在第2、4、6和7天沒有收集洗鼻液以便將收集洗鼻液對病毒感染的進(jìn)展的不利影響最小化。相對于鹽水或奧司他韋，可在avi-7100處理組中觀察到顯著的好處。相對于單獨(dú)的avi-7100(10mg/kg)和單獨(dú)的奧司他韋處理，也觀察到avi-7100(10mg/kg)與奧司他韋聯(lián)合的協(xié)同效應(yīng)。此處，針對洗鼻液中病毒滴度用于聯(lián)合用藥(avi-7100與奧司他韋)的auc顯示了相對于只有達(dá)菲組減少大于4對數(shù)，相對于鹽水組減少大于3對數(shù)。聯(lián)合用藥也顯示相對于等量的單獨(dú)的avi-7100(5.515aug-2.999aug)，病毒滴度減少得更多，這提示avi-7100可增強(qiáng)奧司他韋的抗病毒效應(yīng)。該結(jié)果是令人吃驚的，因?yàn)樵撗芯恐兴玫牟《痉駝t是耐受奧司他韋的。表10.病毒滴度實(shí)施例3利用剪接位點(diǎn)靶向的反義寡聚物對甲型流感病毒在組織培養(yǎng)中的抑制本發(fā)明的一方面為通過m1/m2節(jié)段內(nèi)反義靶向的多個位點(diǎn)，抑制甲型流感病毒復(fù)制。除了抑制通過靶向于通常的m1/m2aug起始位點(diǎn)的翻譯以外，也可利用本發(fā)明化合物，靶向于剪接供體與剪接受體位點(diǎn)。靶向于740位置上的剪接受體位點(diǎn)的兩個pmo可被合成為連接肽的ppmo、sa740和sa746(各自為seqidno:26與29)并且被放置于用于h1n1株pr8的體外組織培養(yǎng)復(fù)制系統(tǒng)中。p007細(xì)胞穿透肽(seqidno:118)被連接至pmo的3m末端。肺泡的小鼠巨噬細(xì)胞系(atcc；amj2-c11)用0.1moih1n1(pr8病毒株)感染并且在感染后1小時添加ppmo。35攝氏度下孵育細(xì)胞過夜。然后取走病毒的上清液并用vnar蛋白酶孵育以釋放病毒的rna。通過定量實(shí)時pcr(qrt-pcr)定量harna。洗滌、固定以及使細(xì)胞通透。然后37攝氏度下用單克隆的抗體作探針探測m1與m2蛋白30分鐘。洗滌細(xì)胞并且在室溫下添加與alexa646連接的抗鼠的igg15分鐘。然后通過流式細(xì)胞術(shù)測定m1與m2。為檢測m1與m2蛋白水平，m1或m2陽性細(xì)胞的百分比與m1或m2的平均熒光強(qiáng)度相乘。然后每一樣品被未處理的對照除以產(chǎn)生m1或m2與未處理的混雜對照相比較的百分比。圖8a顯示病毒的harna水平的降低(利用qrt-pcr所測量的)。sa740與sa746抑制harna產(chǎn)生，表明與混雜的對照相比較病毒復(fù)制的抑制。在利用sa746的10微摩爾帶有大約2對數(shù)降低和sa740的1對數(shù)降低處觀察到最深意義的影響。圖8b和8c各自顯示了sa740與sa746對m1或m2蛋白水平的影響。上文所述的流式細(xì)胞術(shù)方法用于檢測相對的蛋白水平。這兩種寡聚物抑制m2蛋白產(chǎn)生而通過sa740降低m1蛋白水平。實(shí)施例4利用鎖核酸寡聚物抑制組織培養(yǎng)中甲型流感病毒本發(fā)明的化合物包括包含不同化學(xué)實(shí)體的寡核苷酸對應(yīng)物。合成一系列靶向于m1/m2節(jié)段aug起始位點(diǎn)區(qū)域的鎖核酸(分別為lna-augl,lna-aug12,lna-augl3與lna-aug10；seqidno:63,74,75和72)，并且如上文實(shí)施例3中所述的用于病毒的rna與m2蛋白表達(dá)的同一測定中測試這一系列鎖核酸。用pr8感染amj2-c11細(xì)胞1小時，然后洗滌。然后在35攝氏度下將細(xì)胞覆于帶有l(wèi)na或2’ome化合物的96孔平板并允許孵育過夜。在那時(大約18小時總孵育時間)評估病毒的rna水平與m2蛋白表達(dá)。圖9a顯示了4種不同的lna對病毒rna水平(ha節(jié)段)的影響。7.5微摩爾處，就lna-aug1寡聚物而言存在病毒的harna水平中大約3對數(shù)的降低，與就lna-aug12化合物(分別為seqidno:63和74)而言大約1.5對數(shù)的降低比較。lna-aug1為20單體而lna-aug12為16單體。根據(jù)針對所有4個lna寡聚物的長度，存在有效性的次序等級，表明較長的lna為本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案。圖9b中所示的m2蛋白表達(dá)的測量中也可觀察到這一關(guān)系，lna-aug1寡核苷酸相比較于lna-aug10化合物在7.5微摩爾處(seqidno:63與72)最有效。由10個堿基靶向序列組成的相對短的lna-aug10化合物在病毒的harna和m2蛋白表達(dá)測定中是最少有效的。實(shí)施例5利用2’ome寡聚物抑制組織培養(yǎng)中的甲型流感病毒本發(fā)明的化合物也包括由硫代磷酸鍵連接的2’ome殘基組成的反義對應(yīng)寡聚物。通過各自idt、2’ome-augl,2’ome-aug2和2’ome-sal；seqidno:12,20和26產(chǎn)生3個2’ome寡核苷酸。這些寡聚物被設(shè)計用于靶向m1/m2節(jié)段的aug起始密碼子或位于核苷酸740的剪接受體位點(diǎn)。2’ome-sa1序列(seqidno:26)匹配實(shí)施例3中所述的如上文sa740的ppmo化合物的2’ome-sa1序列。同一測定中測試2’ome化合物它們?nèi)缟衔乃龅膶?shí)施例3和4中抑制病毒的harna水平和m2蛋白表達(dá)的能力。通過如上文所述的lna在實(shí)施例4中的剝裸獲得細(xì)胞內(nèi)遞送。所有3種2’ome化合物都可有效降低病毒的harna水平2.5-4.5對數(shù)在7.5微摩爾處，如圖10a所示。也可在如圖10b中所示的m2蛋白測量測定中觀察到3種化合物的相對有效性。最有效的化合物為靶向于aug起始位點(diǎn)區(qū)域的2’ome-aug224單體(seqidno:20)。相似有效的為靶向于下游的m1/m2剪接受體位點(diǎn)的2’ome-sa1寡聚物(seqidno:26)。實(shí)施例6體外對m1和m2蛋白表達(dá)的抑制利用處理的和感染的amj2-c11細(xì)胞的免疫印跡分析評估本發(fā)明示例性化合物對m1和m2蛋白表達(dá)的影響。本發(fā)明的示例性ppmo化合物((m1/m2ppmo；p007-m1/m2-aug；連接在3接末端-seqidno:118的seqidno:12)以3種微摩爾用于處理mdck細(xì)胞過夜。然后用0.01moi處h1n1-pr8繼發(fā)地感染細(xì)胞1小時并且洗滌。感染18小時后，溶解細(xì)胞并且提取蛋白。將等量的蛋白裝載于凝膠劑上用于利用與m1、m2以及肌動蛋白反應(yīng)的單克隆抗體，通過標(biāo)準(zhǔn)的免疫印跡(蛋白質(zhì))測定進(jìn)行隨后的分析。如圖11所示，m1與m2蛋白的表達(dá)降低，與未處理的對照和不相關(guān)的對照ppmo(登革熱)比較。信號強(qiáng)度的分析指示m2蛋白表達(dá)被m1/m2ppmo抑制至大于如圖11所示的m1蛋白表達(dá)的程度(即對m2而言9％，相對于對m1而言27％)。用于m1與m2的信號比較被肌動蛋白對照標(biāo)準(zhǔn)化。序列表序列表<110>薩雷普塔治療公司<120>反義抗病毒化合物及治療流感病毒感染的方法<130>120178.456pc<140>pct<141>2010-11-12<150>us61/377,382<151>2010-08-26<150>us61/292,056<151>2010-01-04<150>us61/261,278<151>2019-11-13<160>133<170>fastseqforwindowsversion4.0<210>1<211>60<212>rna<213>甲型流感病毒<400>1agcaaaagcagguagauauuuaaagaugagucuucuaaccgaggucgaaacguacguucu60<210>2<211>45<212>rna<213>甲型流感病毒<400>2aagcagguagauauuuaaagaugagucuucuaaccgaggucgaaa45<210>3<211>25<212>rna<213>甲型流感病毒<400>3agcaaaagcagguagauauuuaaag25<210>4<211>25<212>rna<213>甲型流感病毒<400>4cuuuaaau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