本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，更具體地，涉及一種精確定量制備高通量測序文庫的方法及其配套試劑盒。

背景技術(shù)：

隨著高通量測序技術(shù)的普及，針對各種不同來源樣品的高通量測序文庫制備方法及商業(yè)試劑盒也得到大量應(yīng)用。市場上主流的高通量文庫制備試劑盒諸如illumina公司的truseq系列dna/rna文庫制備試劑盒，kapa公司的hyper系列建庫試劑盒，neb公司用于二代測序的nebnextdna/rna文庫制備試劑等，這些種類繁多、功能各異的試劑盒能應(yīng)對不同測序平臺、不同樣本來源等各種需求，最大程度地滿足科研和臨床等實(shí)際應(yīng)用。不過，目前還沒有一種完全定量化的文庫制備方法，無法滿足精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)和定量生物學(xué)的實(shí)際需要。

因此，本領(lǐng)域尚缺乏一種專門針對精確定量需求的高通量測序文庫制備方法。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種精確定量化的針對dna樣品的高通量測序文庫制備方法。

本發(fā)明的第一方面提供了一種銜接子，所述銜接子具有式i或ii所示的結(jié)構(gòu)：

5'-s1─s2─s3─s4─s5─s6-3'(i)

5'-ps1─s2─s3─s4─s5─s6-3'(ii)

各式中，

s1為任選地引導(dǎo)部(n)m，n為a、t、g、c中任一堿基，m為1-150的正整數(shù)；

ps1為磷酸化的s1；

s2為莖部1，具有seqidno.:1所示的核苷酸序列；

s3為環(huán)部，其中含有至少一個(gè)堿基u；

s4為莖部2，具有seqidno.:2所示的核苷酸序列；

s2與s4完全互補(bǔ)或部分互補(bǔ)；

s5為無或與引導(dǎo)部s1互補(bǔ)的延伸部；

s6為無或含有至少一個(gè)堿基t的結(jié)合部；

若s5為無，則s6為無；

“─”為化學(xué)鍵。

在另一優(yōu)選例中，所述的銜接子為線性結(jié)構(gòu)、或莖環(huán)結(jié)構(gòu)。

在另一優(yōu)選例中，所述的銜接子具有式iii或iv所示結(jié)構(gòu)：

在另一優(yōu)選例中，m為1-100，更佳地1-50，最佳地5-20的任一正整數(shù)。

在另一優(yōu)選例中，m為5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50。

在另一優(yōu)選例中，所述環(huán)部s3具有seqidno.:3所示的核苷酸序列。

在另一優(yōu)選例中，所述s6含有1個(gè)堿基t。

在另一優(yōu)選例中，所述銜接子的s2具有seqidno.:1所示的核苷酸序列；s3具有seqidno.:3所示的核苷酸序列；s4具有seqidno.:2所示的核苷酸序列。

在另一優(yōu)選例中，s2與s4是完全互補(bǔ)的，或除了未互補(bǔ)的1或2個(gè)堿基之外均為是互補(bǔ)的。

本發(fā)明的第二方面提供了一種基于核酸樣品構(gòu)建測序文庫的方法，包括步驟：

(a)提供一用于構(gòu)建測序文庫的核酸樣品；

(b)對所述的核酸樣品進(jìn)行末端修復(fù)反應(yīng)，獲得末端經(jīng)修復(fù)的核酸樣品；

(c)對所述的末端經(jīng)修復(fù)的核酸樣品進(jìn)行3'末端加da尾反應(yīng)，獲得經(jīng)加尾的核酸樣品；

(d)將所述經(jīng)加尾的核酸樣品與權(quán)利要求1-5中任一所述的銜接子混合，并進(jìn)行連接反應(yīng)，從而形成含“銜接子-核酸-銜接子”復(fù)合物的第一混合物；

(e)將步驟(d)中獲得的“銜接子-核酸-銜接子”復(fù)合物與user酶混合，使得銜接子中的u被降解，形成含末端分叉不互補(bǔ)的“銜接子-核酸-銜接子”復(fù)合物的第二混合物；

(f)將步驟(e)中獲得的含所述復(fù)合物的第二混合物與片段分選磁珠混合，使得所述片段分選磁珠吸附多余的銜接子，并將所述被吸附的銜接子去除，獲得第三混合物；

(g)以步驟(f)獲得的所述復(fù)合物為模板，用特異性結(jié)合于銜接子的第一引物和特異性結(jié)合于銜接子的第二引物進(jìn)行pcr反應(yīng)，獲得擴(kuò)增產(chǎn)物；

(h)以將步驟(g)中獲得的擴(kuò)增產(chǎn)物為原料，制得測序文庫。

在另一優(yōu)選例中，在步驟(h)中，還包括對所述擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行純化的步驟。

在另一優(yōu)選例中，所述的純化包括用片段分選磁珠去除多余的引物。

在另一優(yōu)選例中，所述步驟(c)和(d)之間還包括步驟：

(i)對式i所示的銜接子進(jìn)行5'末端磷酸化反應(yīng)，使其形成式ii所示結(jié)構(gòu)；

或?qū)κ絠ii所示的銜接子進(jìn)行5'末端磷酸化反應(yīng)，使其形成式iv所示結(jié)構(gòu)。

在另一優(yōu)選例中，所述步驟(c)和(d)之間還包括步驟：

(j)對式i或所示的銜接子進(jìn)行退火，使其形成式iii所示結(jié)構(gòu)；

或?qū)κ絠i或所示的銜接子進(jìn)行退火，使其形成式iv所示結(jié)構(gòu)。

在另一優(yōu)選例中，所述步驟(c)和(d)之間還包括步驟：

(k)當(dāng)s5為無時(shí)，對式i-iv任一所示的銜接子進(jìn)行鏈延伸反應(yīng)，補(bǔ)齊簡并堿基部分形成互補(bǔ)雙鏈。

在另一優(yōu)選例中，所述步驟(c)和(d)之間還包括步驟：

(l)當(dāng)s5不為無時(shí)，對i-iv任一所示的銜接子進(jìn)行3'末端加dt尾反應(yīng)；或

當(dāng)s5為無時(shí)，對步驟(k)中獲得的銜接子進(jìn)行3'末端加dt尾反應(yīng)。

在另一優(yōu)選例中，所述片段分選磁珠選自下組：ampurexp磁珠、hieffngsdna分選磁珠、imag片段分選磁珠。

在另一優(yōu)選例中，所述測序文庫可用于illunima高通量測序平臺直接測序。

在另一優(yōu)選例中，所述測序文庫可用于精確定量。

在另一優(yōu)選例中，所述步驟(a)中核酸樣品總量為500pg～1μg。

本發(fā)明的第三方面提供了一種基于核酸樣品構(gòu)建測序文庫的試劑盒，所述試劑盒包括：

一末端修復(fù)/加da尾復(fù)合酶及其緩沖液；

一t4dna連接酶；

一銜接子，所述的銜接子如本發(fā)明的第一方面中任一所述；

和說明書，所述的說明書記載了使用方法。

在另一優(yōu)選例中，所述試劑盒還包括：特異性結(jié)合于銜接子的第一引物和第二引物。

在另一優(yōu)選例中，所述第二引物帶有測序標(biāo)記(barcode)。

在另一優(yōu)選例中，所述第一引物為通用引物p5，其序列如seqidno.:5所示。

在另一優(yōu)選例中，所述第二引物為特異引物p7。

在另一優(yōu)選例中，所述第二引物為特異引物p7，其序列如seqidno.:6所示。

在另一優(yōu)選例中，所述試劑盒還包括酶緩沖液。

在另一優(yōu)選例中，所述試劑盒還包括pcr反應(yīng)預(yù)混液。

應(yīng)理解，在本發(fā)明范圍內(nèi)中，本發(fā)明的上述各技術(shù)特征和在下文(如實(shí)施例)中具體描述的各技術(shù)特征之間都可以互相組合，從而構(gòu)成新的或優(yōu)選的技術(shù)方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附圖說明

圖1是銜接子制備過程的示意圖。

具體實(shí)施方式

本發(fā)明人經(jīng)過長期而深入的研究，意外開發(fā)出了一種具有式i-iv中任一所示的結(jié)構(gòu)的銜接子，其能夠用于制備dna高通量測序文庫；以及使用該銜接子的構(gòu)建dna高通量測序文庫的方法和相應(yīng)試劑盒，使用所述方法，能夠制備精確定量的高通量測序文庫?；谏鲜霭l(fā)現(xiàn)，完成了本發(fā)明。

針對dna樣品制備精確定量的高通量測序文庫方法

本發(fā)明提供了一種基于核酸樣品制備定量化高通量測序文庫的方法，所述的方法包括步驟：

(a)提供一用于制備測序文庫的核酸樣品，總量為500pg～1μg(或1-200ng，或0.5-10ng)；

(b)對所述的核酸樣品進(jìn)行末端修復(fù)反應(yīng)；

(c)對所述的核酸樣品進(jìn)行3'末端加da尾反應(yīng)；

(d)提供一用于制備銜接子(adaptor)的單鏈核酸樣品，序列為附件所示，其5'末端包含有5～20個(gè)簡并堿基，3'末端倒數(shù)第34個(gè)堿基為u；

(e)對上述單鏈核酸樣品進(jìn)行5'末端磷酸化反應(yīng)；

(f)對上一步獲得的核酸樣品進(jìn)行退火，使其形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)；

(g)對上一步獲得的核酸樣品進(jìn)行鏈延伸反應(yīng)，補(bǔ)齊簡并堿基部分形成互補(bǔ)雙鏈；

(h)對上一步獲得的核酸樣品進(jìn)行3'末端加dt尾反應(yīng)，至此莖環(huán)結(jié)構(gòu)銜接子(adaptor)制備完成，結(jié)構(gòu)如式iv所示，其中s6為堿基t；

(i)將末端修復(fù)后加da尾的核酸樣品與銜接子混合進(jìn)行連接反應(yīng)，從而形成“銜接子-核酸-銜接子”的復(fù)合物；

(j)將上一步獲得的“銜接子-核酸-銜接子”復(fù)合物與user酶混合，使得銜接子中的u被降解，形成末端分叉不互補(bǔ)的“銜接子-核酸-銜接子”復(fù)合物；

(k)將上一步獲得的復(fù)合物與適量片段分選磁珠混合，吸附去除多余的銜接子；

(l)將上一步獲得的復(fù)合物與特異性結(jié)合于銜接子的通用引物(p5)和特異性結(jié)合于銜接子的特異引物(p7)混合，進(jìn)行pcr反應(yīng)，獲得擴(kuò)增產(chǎn)物；

(m)將上一步獲得的擴(kuò)增產(chǎn)物與適量片段分選磁珠混合，以去除多余的引物，此即制備完成的測序文庫，經(jīng)長度范圍檢測和濃度定量之后即可用于illunima高通量測序平臺直接測序。

(n)測序后得到的每一個(gè)讀長(reads)兩端都個(gè)帶有一個(gè)5～20個(gè)簡并堿基的標(biāo)簽，此標(biāo)簽的復(fù)雜度取決于簡并堿基的數(shù)量，理論上足夠覆蓋所有的核酸樣品，并且在擴(kuò)增放大過程中被忠實(shí)保留，因此可以用于精確定量。

基于微量核酸樣品構(gòu)建測序文庫的試劑盒

本發(fā)明還提供了一種基于核酸樣品制備高通量測序文庫的試劑盒，所述試劑盒包括：

一末端修復(fù)/加a尾復(fù)合酶及其緩沖液；

一t4dna連接酶；

一銜接子，所述的銜接子為莖環(huán)結(jié)構(gòu)，單鏈環(huán)狀部分帶有一個(gè)堿基u，互補(bǔ)雙鏈末端帶有5～20個(gè)簡并堿基，

和說明書，所述的說明書記載了使用方法。

典型地，本發(fā)明試劑盒還包括：一通用引物和/或一特異引物。

典型地，本發(fā)明試劑盒中，所述特異引物帶有測序標(biāo)記(barcode)，所述測序標(biāo)記選自表1中所列出的序列。

典型地，本發(fā)明試劑盒還包括：一pcr反應(yīng)預(yù)混液。

本發(fā)明的主要優(yōu)點(diǎn)包括：

(1)本發(fā)明通過特殊設(shè)計(jì)的銜接子(adaptor)，引入一段長度為5～20個(gè)簡并堿基，作為每一條核酸片段的獨(dú)有標(biāo)簽，且不會在放大、測序以及后期信息學(xué)分析過程中混淆，能夠追溯原始樣品中每一條核酸片段的數(shù)量和種類，可以實(shí)現(xiàn)完全精確定量。

(2)與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明利用簡單易行的操作實(shí)現(xiàn)高通量測序文庫的制備。對低至500pg的核酸樣品也能順利建庫，通過常規(guī)片段分選磁珠的純化，文庫質(zhì)量高，雜質(zhì)少，可以直接上機(jī)測序。

(3)本發(fā)明適合于各種dna和rna樣品制備高通量測序文庫，且所需都是常規(guī)實(shí)驗(yàn)技術(shù)以及容易購買到的試劑和藥品，條件易得，且操作簡便，一般實(shí)驗(yàn)技術(shù)人員皆可獨(dú)立操作完成。

下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，例如sambrook等人，分子克?。簩?shí)驗(yàn)室手冊(newyork:coldspringharborlaboratorypress,1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和份數(shù)按重量計(jì)算。

實(shí)施例1dna高通量測序文庫的構(gòu)建

采用式i所示銜接子(其中s5為無，s6為無)為例(參見圖1)，構(gòu)建dna高通量測序文庫，銜接子預(yù)處理流程如下：

1、銜接子磷酸化

將商業(yè)合成的單鏈dna樣品溶于純水得到濃度為100μm的溶液，取5μl溶液到一只200μlpcr薄壁管，加入1μl10×t4連接酶緩沖液(終濃度為50mmtris-hcl，10mmmgcl2，1mmatp，10mmdtt)，1μlt4多聚核苷酸激酶(pnk)(10u/μl)，補(bǔ)水至總體積為10μl。

37℃反應(yīng)60分鐘，然后70℃反應(yīng)25min使酶失活。

2、退火

上述反應(yīng)中加入1μl10×nebuffer2(終濃度為50mmnacl，10mmtris-hcl，10mmmgcl2，1mmdtt)，補(bǔ)水至總體積為20μl。

95℃加熱10分鐘，然后以0.1℃/秒的降溫速度緩慢降溫至4℃，冰上保存。

3、補(bǔ)平

上述體系中加入2μl10×nebuffer2(終濃度為50mmnacl，10mmtris-hcl，10mmmgcl2，1mmdtt)，2μl濃度為10mm的dntp，3μl濃度為5u/μl的klenow酶，補(bǔ)水至總體積為40μl。

25℃反應(yīng)30分鐘，然后用qiagen公司的qiaquicknucleotideremovalkit回收反應(yīng)產(chǎn)物，總體積為60μl。

4、加dt尾

上述溶液中加入10μl10×nebuffer2(終濃度為50mmnacl，10mmtris-hcl，10mmmgcl2，1mmdtt)，3μl濃度為10mm的dttp，5μl濃度為5u/μl的klenow(exo-)酶，補(bǔ)水至總體積為100μl。

37℃反應(yīng)30分鐘，然后用qiagen公司的qiaquicknucleotideremovalkit回收反應(yīng)產(chǎn)物，總體積為30μl。至此銜接子預(yù)處理完成，可分裝后-20℃保存。

建庫方法流程如下，起始樣品dna范圍是500pg～1μg：

1、末端修復(fù)/加a尾

取200μlpcr管，加入起始樣品dna，末端修復(fù)/加da尾復(fù)合酶3μl，10×末端修復(fù)緩沖液6.5μl，補(bǔ)水至65μl。

20℃反應(yīng)30分鐘，然后65℃反應(yīng)30分鐘，4℃保存。

2、連接

上述反應(yīng)中加入t4dna連接酶5μl，加入制備好的銜接子1μl(如果起始樣品dna總量<100ng，銜接子須以水稀釋10倍后使用)，補(bǔ)水至總體積為80μl。

25℃反應(yīng)2小時(shí)。

3、上述體系中加入3μluser酶，然后37℃反應(yīng)15分鐘。

上述體系中加入80μlampurexp磁珠，混勻后室溫下孵育5分鐘，然后置磁架上靜置5分鐘，待溶液變澄清透明后吸棄上清。將磁珠以新配的80％乙醇溶液洗三遍，吸棄上清，置磁架上靜置干燥10分鐘。然后加入28μl10mmtris-hcl，ph8.0，混勻后置磁架上靜置5分鐘，然后吸取23μl上清到另一200μlpcr管中，繼續(xù)加入下面的溶液：

2×pcr預(yù)混液25μl，帶有測序標(biāo)記(barcode)的濃度為25μm的特異引物1μl，濃度為25μm的通用引物1μl，總體積為50μl。

在pcr儀上執(zhí)行下述反應(yīng)程序：

98℃初始變性30秒，然后98℃變性10秒，65℃退火30秒，72℃延伸30秒，此程序執(zhí)行5～16個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸5分鐘，4℃保存。

如果起始dna樣品接近1μg，那么pcr循環(huán)數(shù)可控制在5～7；如果起始樣品為50ng，pcr循環(huán)數(shù)是10左右；如果起始樣品數(shù)是500pg，那么pcr循環(huán)需要13～16。

用ampurexp磁珠清出產(chǎn)物

上述體系中加入45μlampurexp磁珠，混勻后室溫下孵育5分鐘，然后置磁架上靜置5分鐘，待溶液變澄清透明后吸棄上清。將磁珠以新配的80％乙醇溶液洗三遍，吸棄上清，置磁架上靜置干燥10分鐘。然后加入33μl10mmtris-hcl，ph8.0，混勻后置磁架上靜置5分鐘，然后吸取28μl上清到另一新管中，此即制備好的可用于上機(jī)測序的文庫。

本發(fā)明中，銜接子中各組成部分s1-s6的序列如下：

s1為n5-20(簡并堿基(n)長度為5～20)；

s2的序列：5'-agatcggaagagc-3'(seqidno.:1)；

s4的序列：5'-gctcttccgatct-3'(seqidno.:2)；

s3的序列：5'-acacgtctgaactccagtcuacactctttccctacacgac-3'(seqidno.:3)。

本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方式中，銜接子序列結(jié)構(gòu)為z1-z2，

其中，z1為n5-20；

z2為5'-agatcggaagagcacacgtctgaactccagtcuacactctttccctacacgacgctcttccgatct-3'(seqidno.:4)。

本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方式中，引物序列如下：

通用引物p5為seqidno.:5：

5'-aatgatacggcgaccaccgagatctacactctttccctacacgacgctcttccgatct-3'；

特異引物p7為

p1－b－p2

式中，

p1為caagcagaagacggcatacgagattg(seqidno.:6中第1－26位)；

b為測序標(biāo)記(barcode)序列，例如ttgact；

p2為gtgactggagttcagacgtgtgctcttccgatct(seqidno.:6中第33-66位)。

在另一具體實(shí)施方式中，所述b的長度為6個(gè)nt。

在另一具體實(shí)施方式中，所述b選自下表1：

表1illumina高通量測序標(biāo)記barcode編號及對應(yīng)序列

在另一具體實(shí)施方式中，特異引物p7的序列為seqidno.:6：

5'-caagcagaagacggcatacgagattgttgactgtgactggagttcagacgtgtgctcttccgatct-3'。

在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨(dú)引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范圍。

序列表

<110>上海交通大學(xué)

<120>一種定量高通量測序文庫的制備方法及其配套試劑盒

<130>p2017-0449

<160>6

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>13

<212>dna

<213>人工序列

<400>1

agatcggaagagc13

<210>2

<211>13

<212>dna

<213>人工序列

<400>2

gctcttccgatct13

<210>3

<211>40

<212>dna

<213>人工序列

<400>3

acacgtctgaactccagtcuacactctttccctacacgac40

<210>4

<211>66

<212>dna

<213>人工序列

<400>4

agatcggaagagcacacgtctgaactccagtcuacactctttccctacacgacgctcttc60

cgatct66

<210>5

<211>58

<212>dna

<213>人工序列

<400>5

aatgatacggcgaccaccgagatctacactctttccctacacgacgctcttccgatct58

<210>6

<211>66

<212>dna

<213>人工序列

<400>6

caagcagaagacggcatacgagattgttgactgtgactggagttcagacgtgtgctcttc60

cgatct66