本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種用于志賀氏菌的檢測(cè)試劑盒、檢測(cè)方法及應(yīng)用。

背景技術(shù)：

食源性疾病目前是全世界關(guān)注的重要公共衛(wèi)生問(wèn)題，無(wú)論在發(fā)達(dá)國(guó)家還是發(fā)展中國(guó)家，每年都會(huì)有數(shù)千萬(wàn)的人因感染食源性致病菌而發(fā)病，嚴(yán)重者導(dǎo)致死亡。志賀氏菌(shigella)作為主要的食源性致病菌之一，在我國(guó)引起感染性腹瀉的致病菌中居首位。志賀氏菌屬由4種革蘭氏陰性、非運(yùn)動(dòng)性、無(wú)芽孢形成的桿狀細(xì)菌組成，分別是鮑氏志賀氏菌、痢疾志賀氏菌、福氏志賀氏菌和宋內(nèi)氏志賀氏菌。毒力較強(qiáng)的志賀氏菌可以引起人類(lèi)細(xì)菌性痢疾，可表現(xiàn)出輕度痢疾、發(fā)熱、腹部絞痛以及嚴(yán)重的體液流失。

目前的分子生物學(xué)檢測(cè)方法可以有效地克服傳統(tǒng)檢測(cè)方法的部分劣勢(shì)而被多數(shù)研究者所青睞，其中重組酶聚合酶擴(kuò)增(recombinasepolymeraseamplification,rpa)技術(shù)因其特異性強(qiáng)、靈敏性高、反應(yīng)時(shí)間短、操作簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)而受到廣泛的關(guān)注，具有巨大的發(fā)展前景。

傳統(tǒng)的志賀氏菌檢測(cè)主要依賴(lài)于細(xì)菌培養(yǎng)及一系列的生化鑒定，檢測(cè)周期較長(zhǎng)，無(wú)法實(shí)現(xiàn)快速檢測(cè)。目前已建立了多種志賀氏菌的檢測(cè)方法。常規(guī)的檢驗(yàn)程序需要增菌、選擇性平板分離培養(yǎng)、生化試驗(yàn)、血清學(xué)分離鑒定等，耗時(shí)長(zhǎng)，操作繁瑣，難以滿(mǎn)足大批量樣品檢測(cè)或突發(fā)公共衛(wèi)生事件處理的需求。在分子生物學(xué)檢測(cè)方面，常用的方法包括聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(pcr)、環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增法(lamp)和基因芯片技術(shù)等。pcr反應(yīng)由變性、退火、延伸三個(gè)基本步驟構(gòu)成，反應(yīng)完成后進(jìn)行電泳檢測(cè)，必要時(shí)需要對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行純化或測(cè)序分析，一般需要經(jīng)驗(yàn)豐富的技術(shù)人員進(jìn)行操作，且需要昂貴的pcr儀。lamp擴(kuò)增目的片段時(shí)依賴(lài)于一種具有鏈置換特性的dna聚合酶和4-6條能夠識(shí)別靶序列六個(gè)特異區(qū)域的引物，引物設(shè)計(jì)較為繁瑣，其擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測(cè)呈現(xiàn)出梯度條帶，不易與非特異性條帶區(qū)分。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

針對(duì)現(xiàn)有志賀氏菌檢測(cè)程序復(fù)雜、引物設(shè)計(jì)繁瑣、儀器昂貴等問(wèn)題，本發(fā)明提供一種用于志賀氏菌的檢測(cè)試劑盒。

進(jìn)一步地，本發(fā)明還提用于志賀氏菌的檢測(cè)方法及應(yīng)用。

為達(dá)到上述發(fā)明目的，本發(fā)明實(shí)施例采用了如下的技術(shù)方案：

一種用于志賀氏菌的檢測(cè)試劑盒，所述檢測(cè)試劑盒用于實(shí)時(shí)熒光rpa檢測(cè)志賀氏菌，以志賀氏菌侵襲性質(zhì)?？乖環(huán)基因作為靶基因，根據(jù)其保守序列設(shè)計(jì)有一對(duì)引物和一條探針，

其中，所述的一對(duì)引物和一條探針的序列如下所示：

上游引物：5'-ctgcatggctggaaaaactcagtgcctctg-3'

下游引物：5'-gttctgactttatcccgggcaatgtcctcc-3'

探針：5'-ccatcaggcatctgaaggccttttcga-fam-dt-thf-a-bhq1-dt-gataccggcgctctgctc-c3-3'。

進(jìn)一步地，本發(fā)明還提供一種用于志賀氏菌的檢測(cè)方法，所述檢測(cè)方法為實(shí)時(shí)熒光rpa方法，所述檢測(cè)方法至少包括以下步驟：

步驟1、從待測(cè)樣品中提取基因組dna；

步驟2、采用上述用于志賀氏菌的檢測(cè)試劑盒對(duì)步驟1所提取的所述dna進(jìn)行等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)；其中，所述等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)的溫度為37-39℃，時(shí)間為20-30min；

步驟3、通過(guò)判斷反應(yīng)結(jié)果是否為陽(yáng)性，確定待測(cè)樣品中是否存在志賀氏菌。

本研究以志賀氏菌侵襲性質(zhì)?？乖環(huán)基因(ipah)作為靶基因，根據(jù)其保守序列設(shè)計(jì)特異性引物及exo探針，建立了用于食品中志賀氏菌快速檢測(cè)的real-timerpa方法。

相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明提供的用于志賀氏菌檢測(cè)的實(shí)時(shí)熒光rpa方法的建立，具有以下優(yōu)勢(shì)：(1)操作簡(jiǎn)便，僅需增菌提取核酸后即可上機(jī)檢測(cè)，所有試劑均以?xún)龈煞鄣男问奖４嬖诜磻?yīng)管中；(2)反應(yīng)時(shí)間短，不需要熱變性，20min內(nèi)即可完成；(3)反應(yīng)結(jié)果可直接觀察，無(wú)需電泳檢測(cè)；(4)便攜式熒光檢測(cè)設(shè)備的使用。本研究中使用的genieiii等溫?cái)U(kuò)增熒光檢測(cè)系統(tǒng)緊湊小巧，輕便耐用，僅為1.75kg左右，觸摸屏操作，無(wú)需連接電腦，其內(nèi)置長(zhǎng)航時(shí)鋰電池，可在無(wú)電源環(huán)境中全天戶(hù)外工作，可用于微生物性食品中毒事件原因的現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)。

進(jìn)一步地，本發(fā)明還提供所述的檢測(cè)試劑盒或檢測(cè)方法在志賀氏菌檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域的應(yīng)用。

本研究中運(yùn)用建立的real-timerpa方法，對(duì)人工污染志賀氏菌的不同樣品進(jìn)行檢測(cè)，當(dāng)樣品污染量為46cfu/25g、增菌6h時(shí)，雞肉中可檢出志賀氏菌。本研究中real-timerpa和real-timepcr檢測(cè)結(jié)果一致，但是前者檢測(cè)所需時(shí)間明顯小于后者。

附圖說(shuō)明

為了更清楚地說(shuō)明本發(fā)明實(shí)施例中的技術(shù)方案，下面將對(duì)實(shí)施例中所需要使用的附圖作簡(jiǎn)單地介紹，顯而易見(jiàn)地，下面描述中的附圖僅僅是本發(fā)明的一些實(shí)施例，對(duì)于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來(lái)講，在不付出創(chuàng)造性勞動(dòng)的前提下，還可以根據(jù)這些附圖獲得其他的附圖。

圖1是本發(fā)明實(shí)施例提供的real-timerpa靈敏性試驗(yàn)結(jié)果示意圖；

圖2是本發(fā)明對(duì)比例提供的real-timepcr靈敏性試驗(yàn)結(jié)果示意圖。

具體實(shí)施方式

為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點(diǎn)更加清楚明白，以下結(jié)合附圖及實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實(shí)施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。

一種用于志賀氏菌的檢測(cè)試劑盒，所述檢測(cè)試劑盒用于實(shí)時(shí)熒光rpa檢測(cè)志賀氏菌，以志賀氏菌侵襲性質(zhì)?？乖環(huán)基因作為靶基因，根據(jù)其保守序列設(shè)計(jì)有一對(duì)引物和一條探針，

其中，所述的一對(duì)引物和一條探針的序列如下所示：

上游引物：5'-ctgcatggctggaaaaactcagtgcctctg-3'

下游引物：5'-gttctgactttatcccgggcaatgtcctcc-3'

探針：5'-ccatcaggcatctgaaggccttttcga-fam-dt-thf-a-bhq1-dt-gataccggcgctctgctc-c3-3'。

優(yōu)選地，所述檢測(cè)試劑盒還包括凍干酶制劑和醋酸鎂溶液。

優(yōu)選地，所述檢測(cè)試劑盒的反應(yīng)體系組成如下：2μl的10μm的上游引物，2μl的10μm的下游引物，0.6μl的10μm的探針，12.5μl的體積濃度為20％的聚乙二醇，1μl的病毒dna模板，29.4μl的ddh2o。

優(yōu)選地，所述凍干酶制劑包括1mm的脫氧核糖核苷三磷酸，90ng/μl的單鏈結(jié)合蛋白，120ng/μl的reca重組酶，30ng/μl的bsudna聚合酶，30ng/μl的exo核酸外切酶，100mmol/l的三羥甲基甘氨酸，體積濃度為20％的聚乙二醇，5mm的二硫蘇糖醇，100ng/μl的肌酸激酶。

本發(fā)明還提供一種用于志賀氏菌的檢測(cè)方法，所述檢測(cè)方法為實(shí)時(shí)熒光rpa方法，所述檢測(cè)方法至少包括以下步驟：

步驟1、從待測(cè)樣品中提取基因組dna；

步驟2、采用上述用于志賀氏菌的檢測(cè)試劑盒對(duì)步驟1所提取的所述dna進(jìn)行等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)；其中，所述等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)的溫度為37-39℃，時(shí)間為20-30min；

步驟3、通過(guò)判斷反應(yīng)結(jié)果是否為陽(yáng)性，確定待測(cè)樣品中是否存在志賀氏菌。

優(yōu)選地，所述等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)在溫度設(shè)定為39℃的等溫?cái)U(kuò)增熒光檢測(cè)儀中進(jìn)行，反應(yīng)時(shí)間為20min。

優(yōu)選地，所述志賀氏菌的上、下游引物的終濃度均為0.4μm，探針的終濃度為0.12μm。

優(yōu)選地，所述志賀氏菌的dna的提取包括以下步驟：將宋內(nèi)氏志賀氏菌純培養(yǎng)菌接種于8-12ml營(yíng)養(yǎng)肉湯中，在34-36℃下培養(yǎng)16-18h；取1ml菌液以10000rpm轉(zhuǎn)速離心1min，棄上清液；將菌體沉淀按照細(xì)菌dna提取試劑盒方法提取細(xì)菌基因組dna，提取完畢后立即使用或-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

優(yōu)選地，使用超微量分光光度計(jì)測(cè)定所提取的細(xì)菌基因組dna的核酸濃度。

本發(fā)明還提供所述的檢測(cè)試劑盒或檢測(cè)方法在志賀氏菌檢測(cè)領(lǐng)域中的應(yīng)用。

為了更好的說(shuō)明本發(fā)明實(shí)施例提供的，下面通過(guò)實(shí)施例做進(jìn)一步的舉例說(shuō)明。

本實(shí)施例與對(duì)比例提供的用于志賀氏菌檢測(cè)的實(shí)時(shí)熒光rpa方法的建立，所采用的主要試劑與設(shè)備有：志賀氏菌增菌肉湯、木糖賴(lài)氨酸脫氧膽鹽(xld)瓊脂、營(yíng)養(yǎng)肉湯等細(xì)菌培養(yǎng)基均購(gòu)自北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司；細(xì)菌基因組dna提取試劑盒等購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司；premixextaq購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司；raa試劑盒(熒光型)購(gòu)自浙江泰晶生物科技有限公司；引物及探針由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

genieiii等溫?cái)U(kuò)增熒光檢測(cè)系統(tǒng)，英國(guó)optigene公司；abi7500實(shí)時(shí)熒光pcr儀，美國(guó)abi公司；nanodrop2000c超微量分光光度計(jì)，美國(guó)thermoscientific公司。

實(shí)施例1用于志賀氏菌的檢測(cè)方法-實(shí)時(shí)熒光rpa方法的建立

1、引物及探針序列的設(shè)計(jì)及制備

本研究以志賀氏菌侵襲性質(zhì)?？乖環(huán)基因(ipah)作為靶基因，根據(jù)其保守序列設(shè)計(jì)特異性引物及exo探針，建立了用于食品中志賀氏菌快速檢測(cè)的real-timerpa方法。

本發(fā)明發(fā)明人通過(guò)對(duì)于genebank中志賀氏菌ipah基因序列(登錄號(hào)：ae005674)，進(jìn)行分析，選擇保守區(qū)域，設(shè)計(jì)real-timerpa引物及exo探針，目的片段大小為247bp。

本發(fā)明設(shè)計(jì)合成了一對(duì)引物和一條探針，如表1所示。

表1本發(fā)明設(shè)計(jì)的志賀氏菌real-timerpa引物和探針

2、志賀氏菌菌株及細(xì)菌基因組dna的提取

將志賀氏菌(cicc21679)純培養(yǎng)菌接種于10ml營(yíng)養(yǎng)肉湯中，36℃培養(yǎng)18h；取菌液1ml加入1.5ml移液管中，以10000rpm的轉(zhuǎn)速離心1min，棄上清液；將菌體沉淀按照細(xì)菌基因組dna提取試劑盒所述方法提取細(xì)菌dna，立即使用或-20℃保存?zhèn)溆?，同時(shí)使用nanodrop2000c超微量分光光度計(jì)測(cè)定所提取的宋內(nèi)氏志賀氏菌的核酸濃度。

3、志賀氏菌檢測(cè)試劑盒的制備

使用raa試劑盒(熒光型)配制單個(gè)反應(yīng)體系，反應(yīng)體系中如下：2μl的10μm的上游引物(終濃度為0.4μm)，2μl的10μm的下游引物(終濃度為0.4μm)，0.6μl的10μm的探針(終濃度為0.12μm)，12.5μl的體積濃度為20％的聚乙二醇，1μl的病毒dna模板，29.4μl的ddh2o。將上述將47.5μl體系混勻后加入到裝有凍干酶制劑的反應(yīng)管中，用移液器上下吹打至完全溶解，然后向反應(yīng)管中加入2.5μl的280mm的醋酸鎂，瞬時(shí)離心并渦旋后放入等溫?cái)U(kuò)增熒光檢測(cè)儀genieiii中，溫度設(shè)定為39℃，反應(yīng)時(shí)間為20min。

所述凍干酶制劑包括1mm的脫氧核糖核苷三磷酸，90ng/μl的單鏈結(jié)合蛋白，120ng/μl的reca重組酶，30ng/μl的bsudna聚合酶，30ng/μl的exo核酸外切酶，100mmol/l的三羥甲基甘氨酸，體積濃度為20％的聚乙二醇，5mm的二硫蘇糖醇，100ng/μl的肌酸激酶。

4、志賀氏菌檢測(cè)方法-real-timerpa方法的建立

所述檢測(cè)方法的建立包括以下步驟：

步驟1、從待測(cè)樣品中提取基因組dna；

步驟2、對(duì)步驟1所提取的所述dna進(jìn)行等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)；其中反應(yīng)液采取上述的志賀氏菌的上、下游引物及探針，將所述反應(yīng)液混勻，加入到裝有凍干酶制劑的反應(yīng)管中，溶解，再向反應(yīng)管中加入2.5μl的280mm的醋酸鎂溶液，進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)；

擴(kuò)增反應(yīng)在溫度設(shè)定為37-39℃的等溫?cái)U(kuò)增熒光檢測(cè)儀中進(jìn)行，反應(yīng)時(shí)間為20-30min；

步驟3、通過(guò)判斷反應(yīng)結(jié)果是否為陽(yáng)性，確定待測(cè)樣品中是否存在志賀氏菌。

為了更好的說(shuō)明本發(fā)明的技術(shù)方案，下面還通過(guò)對(duì)比例和本發(fā)明的實(shí)施例做進(jìn)一步的對(duì)比。

對(duì)比例1用于志賀氏菌檢測(cè)方法-real-timepcr方法的建立

1、real-timepcr的一對(duì)引物和探針如表2所示.

表2本發(fā)明設(shè)計(jì)的志賀氏菌real-timepcr引物和探針

2、real-timepcr方法的建立

反應(yīng)體系為：2μl的10μm的上游引物(終濃度為0.8μm)，2μl的10μm的下游引物(終濃度為0.8μm)，0.9μl的5μm的探針(終濃度為0.18μm)，12.5μl的premixextaq，1μl的病毒dna模板，6.6μl的ddh2o。

將上述體系充分混勻后放入abi7500實(shí)時(shí)熒光pcr儀中，反應(yīng)程序設(shè)置為：95℃，預(yù)變性30s；95℃變性5s，60℃延伸35s，35個(gè)循環(huán)，60℃收集熒光信號(hào)。

為了更好的說(shuō)明本發(fā)明實(shí)施例提供的用于志賀氏菌檢測(cè)的實(shí)時(shí)熒光rpa方法的應(yīng)用，下面將實(shí)施例1與對(duì)比例1分別作特異性、靈敏性試驗(yàn)以及人工污染樣品檢測(cè)的試驗(yàn)。

特異性試驗(yàn)

以表3中所示菌株的基因組dna作為模板進(jìn)行real-timerpa反應(yīng)，確定是否出現(xiàn)特異性擴(kuò)增曲線。

表3

注：+，陽(yáng)性結(jié)果；－，陰性結(jié)果。

以志賀氏菌和其他細(xì)菌dna作為模板進(jìn)行real-timerpa檢測(cè)，結(jié)果如表3所示，僅志賀氏菌呈現(xiàn)典型的擴(kuò)增曲線，其他細(xì)菌均無(wú)擴(kuò)增，說(shuō)明該方法具有良好的特異性。

靈敏性試驗(yàn)

將濃度為35ng/μl的志賀氏菌基因組dna使用ddh2o進(jìn)行10倍梯度，連續(xù)稀釋7個(gè)梯度后，每個(gè)梯度dna分別進(jìn)行real-timerpa和real-timepcr反應(yīng)，確定該方法的靈敏性，檢測(cè)結(jié)果如圖1和圖2所示。

圖1為real-timerpa檢測(cè)結(jié)果，圖2為real-timepcr檢測(cè)結(jié)果。圖1、2中1:3.5×10¹ng/μl；2:3.5×10⁰ng/μl；3:3.5×10^-1ng/μl；4:3.5×10^-2ng/μl；5:3.5×10^-3ng/μl；6:3.5×10^-4ng/μl；7:3.5×10^-5ng/μl。

從圖1、2檢測(cè)結(jié)果中可以看出，real-timerpa的檢測(cè)限為3.5×10^-3ng/μl，同real-timepcr方法檢測(cè)限一致。

人工污染樣品檢測(cè)的試驗(yàn)

將宋內(nèi)氏志賀氏菌(cicc21679)經(jīng)過(guò)夜純培養(yǎng)后，用生理鹽水進(jìn)行10倍梯度稀釋?zhuān)x取10^-5、10^-6、10^-7三個(gè)稀釋度的菌液200μl涂于xld瓊脂平板上，并作3個(gè)平行樣品，用于計(jì)算純培養(yǎng)菌的初始濃度。選擇1-10、10-50、50-100cfu范圍內(nèi)細(xì)菌分別添加到25g西蘭花和25g雞肉樣品中(樣品預(yù)先按照gb4789.5-2012檢測(cè)，均未檢出志賀氏菌)；然后再添加到225ml志賀氏菌增菌肉湯中，在36℃條件下培養(yǎng)。增菌6h、8h后分別取1ml菌液參照本發(fā)明提供的細(xì)菌基因組dna的提取方法進(jìn)行細(xì)菌dna的提取，取1μl作為模板進(jìn)行real-timerpa和real-timepcr檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果如表4所示。

表4人工污染樣品檢測(cè)的試驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果

注：－，未檢出。

由表4可以看出，對(duì)人工污染志賀氏菌的西蘭花、雞肉樣品增菌后，real-timerpa檢測(cè)結(jié)果表明，三個(gè)濃度的污染量在增菌時(shí)間為8h時(shí)，兩種樣品中的志賀氏菌均可檢出；當(dāng)樣品污染量為46cfu/25g、增菌時(shí)間為6h時(shí)，雞肉樣品中志賀氏菌可檢出，而西蘭花樣品中未能檢出；當(dāng)樣品污染量為101cfu/25g、增菌時(shí)間為6h時(shí)，兩種樣品中的賀氏菌均可檢出。兩種方法對(duì)所有樣品的檢測(cè)結(jié)果一致，但是real-timerpa僅需要7-12min，而real-timepcr則需要35min以上(ct值為27-34之間)。

在細(xì)菌污染量、增菌時(shí)間相同的情況下，雞肉中志賀氏菌檢出所需要的時(shí)間均小于西蘭花樣品，這可能是由于不同基質(zhì)提取核酸的效率不同，或是不同介質(zhì)中細(xì)菌繁殖數(shù)量有差異導(dǎo)致。

本發(fā)明建立針對(duì)志賀氏菌的real-timerpa方法特異性強(qiáng)、靈敏性高，操作簡(jiǎn)單，反應(yīng)時(shí)間短，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)食品樣品中志賀氏菌的有效檢測(cè)，并可以用于現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)，為食品和食源性公共衛(wèi)生事件中的志賀氏菌的檢測(cè)提供了一種新方法。

以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)所作的任何修改、等同替換或改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。

序列表

<110>河北出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心

<120>用于志賀氏菌的檢測(cè)試劑盒、檢測(cè)方法及應(yīng)用

<130>2017

<160>6

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>30

<212>dna

<213>人工序列

<400>1

ctgcatggctggaaaaactcagtgcctctg30

<210>2

<211>30

<212>dna

<213>人工序列

<400>2

gttctgactttatcccgggcaatgtcctcc30

<210>3

<211>46

<212>dna

<213>人工序列

<400>3

ccatcaggcatctgaaggccttttcgaagataccggcgctctgctc46

<210>4

<211>24

<212>dna

<213>人工序列

<400>4

ttcgtgcatgtcttacctctaagg24

<210>5

<211>23

<212>dna

<213>人工序列

<400>5

tgcaagcagggagtacaggtaac23

<210>6

<211>22

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