本發(fā)明涉及基因工程和細(xì)胞學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種敲除aav受體的方法、敲除了aav受體的hek293細(xì)胞株及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：目前基因治療從近幾十年來無數(shù)科學(xué)家的夢(mèng)想正逐步變成了現(xiàn)實(shí)。基因治療的載體一直是整個(gè)基因治療的關(guān)鍵，作為基因載體，需要具有安全性、有效性、特異性。多種病毒、非病毒載體經(jīng)過多年的演變、淘汰，目前重組腺相關(guān)病毒(raav)載體是公認(rèn)為符合以上三個(gè)標(biāo)準(zhǔn)的基因治療載體。由于aav的生產(chǎn)得率長(zhǎng)期以來提升緩慢，因而臨床應(yīng)用的普及程度也受此制約。隨著近幾年來第一個(gè)被歐盟批準(zhǔn)的治療脂肪酸酶缺陷的基因治療藥物glybera上市，sparktheraputics公司的治療先天性失明的spk-rpe65三期臨床表現(xiàn)優(yōu)秀，aav作為基因治療載體的方向與道路已完全被證明，但aav的生產(chǎn)效率仍是基因治療的關(guān)鍵瓶頸。一個(gè)需要全身性轉(zhuǎn)導(dǎo)的遺傳疾病需要約1x1015aav基因組拷貝數(shù)(gc)的顆粒，而這個(gè)臨床級(jí)別的生產(chǎn)量需要50萬美元。生產(chǎn)上，如果用目前實(shí)驗(yàn)室能力范圍內(nèi)一次50個(gè)15cm盤可獲得1x1013gc的生產(chǎn)效率來計(jì)算，則需要要生產(chǎn)100次或100倍的生產(chǎn)規(guī)模才能得到治療一個(gè)病人的總量。目前aav的主流生產(chǎn)方法是三質(zhì)粒轉(zhuǎn)染hek293細(xì)胞方法。三質(zhì)粒轉(zhuǎn)染法簡(jiǎn)單、快速，但由于hek293為貼壁細(xì)胞，這種方法在規(guī)模上的擴(kuò)展較有困難。但如果能把貼壁細(xì)胞馴化為懸浮細(xì)胞，則該方法會(huì)打破自身的局限，成為規(guī)?；I(yè)生產(chǎn)的重要候選方案。把貼壁的hek293細(xì)胞馴化為懸浮細(xì)胞近幾年已有人取得成功，但由于原本的生產(chǎn)效率仍是未能滿足需求，因此規(guī)?；a(chǎn)只能靠單一地增加生產(chǎn)規(guī)模。在常規(guī)的aav生產(chǎn)中，已有多篇報(bào)道發(fā)現(xiàn)了在大部分aav在hek293細(xì)胞生產(chǎn)aav過程中分泌到上清中。這一現(xiàn)象使目前的aav生產(chǎn)方法有了一定的變化，即不再忽略上清中存在的aav；并且還產(chǎn)生了一個(gè)新的aav生產(chǎn)方式：長(zhǎng)時(shí)間培養(yǎng)三質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后的hek293細(xì)胞，并連續(xù)地收集上清中的aav。這一方法據(jù)稱可達(dá)到原先一次轉(zhuǎn)染后三天收獲aav的總量的5倍。但是，上清中的aav是由hek293細(xì)胞分泌出來，也會(huì)因?yàn)閍av容易感染hek293細(xì)胞而再次進(jìn)入hek293細(xì)胞中。感染進(jìn)入hek293細(xì)胞后的aav會(huì)經(jīng)歷溶酶體的包含、消化外殼、aav基因組逃脫溶酶體等步驟，最終會(huì)導(dǎo)致已經(jīng)生產(chǎn)、分泌出來的aav再次被回收，總aav產(chǎn)量變低。由此可見，現(xiàn)有技術(shù)生產(chǎn)aav的產(chǎn)量瓶頸亟待打破，在方法上改進(jìn)、創(chuàng)新，取得更高的aav產(chǎn)率是目前基因治療的一大亟待改善的問題。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：有鑒于此，有必要針對(duì)的問題，提供一種敲除aav受體的方法、敲除了aav受體的hek293細(xì)胞株及其應(yīng)用，可將aav感染hek293細(xì)胞這一途徑阻斷，提升aav的最終產(chǎn)量。本發(fā)明通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：一種敲除了aav受體的hek293細(xì)胞株(aavrkohek293)，編號(hào)arko-x88，保藏編號(hào)：cctccno：c201793；保藏單位：中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(武漢大學(xué)保藏中心)；保藏日期：2017年06月22日；分類命名：hek293人胚腎細(xì)胞arko-x88。所述aav受體為kiaa0319l，其基因位于染色體1p34.3，ncbireferencesequence:nm_024874.4，所述敲除了aav受體的hek293細(xì)胞株在常規(guī)培養(yǎng)條件下與原始的hek293細(xì)胞并無顯著形態(tài)學(xué)差異，但在aav的產(chǎn)量上提高了約50％。一種通過crispr技術(shù)敲除hek293細(xì)胞的aav受體kiaa0319l的方法，步驟包括：(1)構(gòu)建靶向aavr基因組序列的sgrna載體：設(shè)計(jì)基因的靶序列，利用sgrna克隆骨架載體pg-cmv.spcas9-u6.(sp)sgrna構(gòu)建靶向aavr基因組序列的sgrna載體；(2)將(1)中的靶序列的sgrna載體分別轉(zhuǎn)染293t細(xì)胞，再經(jīng)培養(yǎng)得到各克隆細(xì)胞，稀釋，分轉(zhuǎn)到反應(yīng)孔板中；(3)待(2)中的生長(zhǎng)15天后得到單克??；再消化，并用完全培養(yǎng)基中和，一半細(xì)胞懸液凍存，另一半細(xì)胞懸液提取基因組dna用于surveyor基因突變分析試驗(yàn)；(4)surveyor基因突變分析試驗(yàn)鑒定所提取的單克隆的基因組dna，確認(rèn)aavr突變的單克隆，即為敲除了aav受體的293t細(xì)胞株；(5)復(fù)蘇(3)中aavr突變的單克隆凍存細(xì)胞到反應(yīng)孔板中，作aav生產(chǎn)的產(chǎn)量比較，選擇出高產(chǎn)aav的aavr突變細(xì)胞株；(6)pcr測(cè)序全面鑒定(5)中所得高產(chǎn)aav的aavr突變hek293細(xì)胞株基因組中其它潛在突變位點(diǎn)的突變情況；(7)把(6)中鑒定無其它突變位點(diǎn)的細(xì)胞株再擴(kuò)大，建庫(kù)以備生產(chǎn)。進(jìn)一步的，所述敲除hek293細(xì)胞的aav受體kiaa0319l的方法，步驟包括：(1)、構(gòu)建靶向aavr基因組序列的u6啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)下的sgrna載體：設(shè)計(jì)2個(gè)kiaa0319l基因的靶序列：ar1：gaggtgacacaatagcaatg(外顯子8)ar2：ggtaggggtagcataactgt(外顯子4)sgrna克隆骨架載體：pg-cmv.spcas9-u6.(sp)sgrna(來源于addgene的載體編號(hào)42230(px330-u6-chimeric_bb-cbh-hspcas9)，置換原cbh啟動(dòng)子為cmv啟動(dòng)子)；將所述靶序列分別克隆至所述骨架載體中；(2)將(1)中的兩個(gè)不同的靶序列的載體分別轉(zhuǎn)染293t細(xì)胞，轉(zhuǎn)染方法：①轉(zhuǎn)染前16小時(shí)分1e+5個(gè)293t細(xì)胞在24孔板孔中；②轉(zhuǎn)染時(shí)把1μg載體dna和3ulpei在50uldmem中混勻靜置15分鐘，然后加入孔中，輕搖以保證均勻分布；③16小時(shí)后換為完全培養(yǎng)基，37度，5％co2條件下培養(yǎng)，3天后把各克隆細(xì)胞稀釋到約2.5個(gè)細(xì)胞/ml，分到96孔板中，200ul/孔，以獲得理論分配為0.5個(gè)細(xì)胞每孔，從而確保一個(gè)孔內(nèi)絕大多數(shù)情況下為一個(gè)細(xì)胞長(zhǎng)成的單克?。?；(3)待(2)中的生長(zhǎng)15天后得到單克隆；用50ul0.01％trypsin胰酶消化克隆1分鐘，用50ul完全培養(yǎng)基中和，取50ul細(xì)胞懸液提取基因組dna作后面surveyor基因突變分析試驗(yàn)；剩余的50ul細(xì)胞懸液加入含有10％dmso的完全培養(yǎng)基250ul，凍存-80度超低溫冰箱；(4)surveyor基因突變分析試驗(yàn)鑒定所提取的單克隆的基因組dna，選出aavr突變的單克隆，即敲除了aav受體的293t細(xì)胞株；默認(rèn)步驟(3)中凍存的另一半細(xì)胞液與該步驟鑒定結(jié)果相同；(5)再?gòu)?fù)蘇(3)中已確認(rèn)為aavr突變的單克隆凍存細(xì)胞到6孔板中，擴(kuò)大培養(yǎng)至3x106個(gè)細(xì)胞/孔(密度約80～90％)，每孔凍存2.5x106個(gè)細(xì)胞，每孔剩余的0.5x106個(gè)細(xì)胞分到24孔板的一個(gè)孔中，作aav生產(chǎn)的產(chǎn)量比較，具體操作方法為：通過常規(guī)三質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染，將腺病毒輔助載體pad-deltaf6、aavdj血清型輔助載體prc-dj、載體pitr-cag.egfp共轉(zhuǎn)染293t細(xì)胞突變株細(xì)胞，同時(shí)以常規(guī)293t細(xì)胞作為平行轉(zhuǎn)染對(duì)照；轉(zhuǎn)染3天后收獲細(xì)胞及上清，經(jīng)三次凍融后離心取上清，稀釋1000倍后取2ul，在20ul的總反應(yīng)體系(15.8μlh2o，2μl10xdnase緩沖液，dnasei(70u/ul)0.2μl)中用dna酶消化(37℃條件下30分鐘)，去除殘余的質(zhì)粒dna；再稀釋10倍后用sybrgreenqpcr方法分析aav-egfp產(chǎn)量；與常規(guī)293t細(xì)胞對(duì)照相比，選擇出高產(chǎn)aav的aavr突變細(xì)胞株；(6)pcr測(cè)序全面鑒定(5)中的高產(chǎn)aav的aavr突變hek293細(xì)胞株基因組中其它潛在突變位點(diǎn)的突變情況；(7)把(6)中所得的無其它突變位點(diǎn)的細(xì)胞株再擴(kuò)大，建庫(kù)以備生產(chǎn)。進(jìn)一步的，所述敲除了aav受體的hek293細(xì)胞株在aav生產(chǎn)領(lǐng)域的應(yīng)用。一種利用敲除了aav受體的hek293細(xì)胞株制備aav的方法，具體操作步驟包括：(1)、鋪敲除了aav受體的hek293細(xì)胞株至反應(yīng)孔板中；(2)、將prc-dj載體、ad輔助載體及aav-egfp載體加入dmem中，再加入pei(1ug/ul)，馬上混勻，培養(yǎng)；(3)、培養(yǎng)72小時(shí)后收集細(xì)胞和上清，反復(fù)凍融三次，離心得上清即為aav粗提液。進(jìn)一步的，所述利用敲除了aav受體的hek293細(xì)胞株制備aav的方法，具體操作步驟包括：(1)、鋪敲除了aav受體的hek293細(xì)胞株()約3x105至24孔板中，16小時(shí)后轉(zhuǎn)染時(shí)細(xì)胞密度約為60～70％；(2)、用prc-dj與ad輔助載體及aav-egfp載體各0.2～2ug，加入0.5mldmem中，再加入pei15ul(1ug/ul)，馬上混勻，常溫下放置10分鐘后加入細(xì)胞培養(yǎng)基中再放回37度細(xì)胞培養(yǎng)箱(5％co2濃度)培養(yǎng)；(3)、培養(yǎng)72小時(shí)后收集細(xì)胞和上清，在37℃水浴和干冰-乙醇浴中反復(fù)凍融三次(解凍與凍結(jié)每次各2分鐘)，10000g離心10分鐘后上清為aav粗提液。本發(fā)明有益效果：本發(fā)明的敲除了aav受體的hek293細(xì)胞株(aavrkohek293)，所述受體kiaa0319l(aavr)一旦被敲除，細(xì)胞基本不能被任何血清型的aav所感染。本發(fā)明從這一理論出發(fā)，旨在獲得一種敲除了aav受體(aavr)的hek293細(xì)胞株，把a(bǔ)av感染hek293細(xì)胞這一途徑阻斷，減少生產(chǎn)過程中aav的損失，從而得到比常規(guī)hek293細(xì)胞產(chǎn)量高出約50％的敲除了aav受體(aavr)的hek293細(xì)胞株(aavrkohek293)，提升aav的最終產(chǎn)量，大幅降低生產(chǎn)規(guī)模與成本。附圖說明圖1為本發(fā)明aavrkohek293細(xì)胞與常規(guī)hek293細(xì)胞的aav生產(chǎn)率對(duì)比圖。保藏信息：保藏編號(hào)：cctccno：c201793；保藏單位：中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(武漢大學(xué)保藏中心)；地址：湖北省武漢市武昌區(qū)八一路299號(hào)武漢大學(xué)校內(nèi)武漢大學(xué)第一附小對(duì)面；保藏日期：2017年06月22日。具體實(shí)施方式為了更好地說明本發(fā)明所解決的問題、所采用的技術(shù)方案和所達(dá)到的效果，現(xiàn)結(jié)合具體實(shí)施例和相關(guān)資料進(jìn)一步闡述。需要說明的是，本
發(fā)明內(nèi)容包含但不限于以下實(shí)施例及其組合實(shí)施方式。實(shí)施例一本發(fā)明的aav受體敲除的hek293細(xì)胞株及其制備方法1、本發(fā)明的敲除了aav受體的hek293細(xì)胞株在常規(guī)的hek293細(xì)胞生產(chǎn)aav過程中，aav會(huì)分泌到上清液中，上清中的aav容易感染hek293細(xì)胞而再次進(jìn)入hek293細(xì)胞中，感染進(jìn)入hek293細(xì)胞后的aav會(huì)經(jīng)歷溶酶體的包含、消化外殼、aav基因組逃脫溶酶體等步驟，最終會(huì)導(dǎo)致已經(jīng)生產(chǎn)、分泌出來的aav再次被回收，總aav產(chǎn)量變低。kiaa0319l(后稱aavr)是aav感染細(xì)胞的必要受體，該受體處于細(xì)胞膜表面，基因位于染色體1p34.3，ncbireferencesequence:nm_024874.4，該受體kiaa0319l(aavr)一旦被敲除，細(xì)胞基本不能被任何血清型的aav所感染。根據(jù)這一理論，本發(fā)明提供一種敲除了aav受體的hek293細(xì)胞株。該細(xì)胞株編號(hào)arko-x88，生長(zhǎng)形態(tài)與常規(guī)293t無明顯差異。經(jīng)大規(guī)模aav生產(chǎn)驗(yàn)證，相比常規(guī)293t細(xì)胞產(chǎn)率高出約50％。2、本發(fā)明的敲除了aav受體的hek293細(xì)胞株的無篩選壓力制備方法通過crispr技術(shù)以無篩選壓力法敲除hek293細(xì)胞的aav受體kiaa0319l的方法，步驟包括：(1)、構(gòu)建靶向aavr基因組序列的u6啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)下的sgrna載體。具體操作如下：(1.1)設(shè)計(jì)2個(gè)kiaa0319l基因的靶基因序列及引物：靶基因：ar1：gaggtgacacaatagcaatg(外顯子8)ar2：ggtaggggtagcataactgt(外顯子4)引物：ar1-sgrna-fcaccgaggtgacacaatagcaatgar1-sgrna-raaaccattgctattgtgtcacctcar2-sgrna-fcaccggtaggggtagcataactgtar2-sgrna-raaacacagttatgctacccctacc(1.2)退火：把引物分別稀釋到100um，再將ar1-sgrna-f與ar1-sgrna-r，ar2-sgrna-f與ar2-sgrna-r分別按以下體積混勻：試劑用量f(100um)1ul(final10um)r(100um)1ul(final10um)10xt4連接反應(yīng)液(takara公司)1ul無核酸酶水6.5ult4pnk(10u/ul，takara公司)0.5ul(final5u)總量:10ul37度反應(yīng)30分鐘后整體轉(zhuǎn)移至裝滿250ml水的燒杯中，燒開水3分鐘后自然冷卻到常溫。(1.3)用pg-cmv.spcas9-u6.(sp)sgrna(來源于addgene的載體編號(hào)42230(px330-u6-chimeric_bb-cbh-hspcas9)，置換原cbh啟動(dòng)子為cmv啟動(dòng)子)作為骨架作酶切連接載體：酶切連接反應(yīng)試劑用量pg-cmv.spcas9-u6.(sp)sgrna25ng10um退火產(chǎn)物1ul10xt4連接反應(yīng)液1ulh2o加到9ulbbsi(5u/ul)0.5ul(2.5u)t4連接酶(400u/ul)0.5ul(200u)總量10ul反應(yīng)條件:1)37攝氏度，5分鐘；2)23攝氏度，5分鐘；3)轉(zhuǎn)到步驟1)，20-30個(gè)循環(huán)，4小時(shí)。(1.4)轉(zhuǎn)化：各取5ul連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化50uldh5a感受態(tài)細(xì)胞，常規(guī)轉(zhuǎn)化方法。(1.5)測(cè)序：挑克隆作小量質(zhì)粒提取后，用u6啟動(dòng)子引物測(cè)序鑒定靶序列是否已經(jīng)克隆進(jìn)入載體中。(2)將(1)中得到的兩個(gè)靶序列的sgrna載體分別轉(zhuǎn)染293t細(xì)胞(293t，crl-3216tm，用含10％胎牛血清、2mml-glutamine(atcc30-2214)、1％penicillin/streptomycin的高糖dmem(稱為完全培養(yǎng)基)培養(yǎng))。轉(zhuǎn)染方法如下：①轉(zhuǎn)染前16小時(shí)分1e+5個(gè)293t細(xì)胞在24孔板孔中；②轉(zhuǎn)染時(shí)把1μg載體dna和3ulpei在50uldmem中混勻靜置15分鐘，然后加入孔中，輕搖以保證均勻分布；③16小時(shí)后換為完全培養(yǎng)基，37度，5％co2條件下培養(yǎng)，3天后把各克隆細(xì)胞稀釋到約2.5個(gè)細(xì)胞/ml，分到96孔板中，200ul/孔，以獲得理論分配為0.5個(gè)細(xì)胞每孔，從而確保一個(gè)孔內(nèi)絕大多數(shù)情況下為一個(gè)細(xì)胞長(zhǎng)成的單克??；(3)生長(zhǎng)15天后得到長(zhǎng)成一定細(xì)胞數(shù)量的單克隆，共獲得91個(gè)單克隆，編號(hào)arko-x1～91。再進(jìn)一步鑒定克隆是否已被敲除aavr：用50ul0.01％trypsin胰酶消化克隆1分鐘，再加50ul完全培養(yǎng)基中和，取50ul細(xì)胞懸液提取基因組dna(qiagenqiaampdnaminikit，貨號(hào)catno./id:51306)作后面surveyor基因突變分析試驗(yàn)；剩余的50ul細(xì)胞懸液加入含有10％dmso的完全培養(yǎng)基250ul，凍存-80度超低溫冰箱。(4)surveyor基因突變分析試驗(yàn)鑒定所提取的單克隆arko-x1～91的基因組dna，選出aavr突變的單克隆(詳細(xì)步驟見mutationdetectionkit檢測(cè)試劑盒說明書，貨號(hào)706020)，確認(rèn)敲除了aav受體的293t細(xì)胞株32個(gè)，突變率35.2％。因?yàn)榻^大部分96孔板中一孔的細(xì)胞是單個(gè)細(xì)胞繁殖而來，默認(rèn)其基因型是一致的，因此可得出另一半凍存細(xì)胞的基因型與本步驟驗(yàn)證的結(jié)果一致。(5)從先前96孔板凍存的細(xì)胞復(fù)蘇被確認(rèn)為aavr突變的單克隆凍存細(xì)胞到6孔板中，擴(kuò)大培養(yǎng)至3x106個(gè)細(xì)胞/孔(密度約80～90％)，再每孔凍存2.5x106個(gè)細(xì)胞，每孔剩余0.5x106個(gè)細(xì)胞分到24孔板的一個(gè)孔中，作aav生產(chǎn)的產(chǎn)量比較。通過常規(guī)三質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染：腺病毒輔助載體pad-deltaf6(載體來源：美國(guó)賓夕法尼亞大學(xué)載體部upennvectorcorepl-f-pvadf6)，aavdj血清型輔助載體prc-dj(載體來源：在來源于美國(guó)賓夕法尼亞大學(xué)載體部upennvectorcore的paav2/2基礎(chǔ)上，用根據(jù)公開的aav-dj的序列替換aav2cap2序列合成而來)、能在廣譜啟動(dòng)子cag驅(qū)動(dòng)下表達(dá)綠色熒光蛋白的帶itr目的載體pitr-cag.egfp(載體來源：來源于美國(guó)賓夕法尼亞大學(xué)載體部upennvectorcore的pl-c-pv1045pennaavcb6pimaster，用常規(guī)的克隆方法插入egfp蛋白編碼構(gòu)建而成)共轉(zhuǎn)染293t細(xì)胞突變株細(xì)胞，同時(shí)以正常293t細(xì)胞作為平行轉(zhuǎn)染對(duì)照。轉(zhuǎn)染3天后收獲細(xì)胞及上清，經(jīng)三次凍融后離心取上清，稀釋1000倍后取2ul，在20ul的反應(yīng)體系(包括：15.8μlh2o，2μl10xdnase緩沖液，dnasei(70u/ul)0.2μl)中用dna酶消化(反應(yīng)條件：37℃條件下30分鐘)，去除殘余的質(zhì)粒dna。再稀釋10倍后用sybrgreenqpcr方法分析aav-egfp產(chǎn)量。與常規(guī)293t細(xì)胞對(duì)照相比，選擇出5株高產(chǎn)aav的aavr突變細(xì)胞株，進(jìn)一步用更大規(guī)模aav生產(chǎn)驗(yàn)證其高產(chǎn)率。(5)pcr測(cè)序鑒定高產(chǎn)aav的aavr突變hek293細(xì)胞株基因組中有較大機(jī)率突變的相似序列位點(diǎn)(只限于近3’端17bp中有2個(gè)位點(diǎn)突變)情況：設(shè)計(jì)pcr引物(見表1)擴(kuò)增相應(yīng)靶點(diǎn)的潛在脫靶區(qū)域，測(cè)序確認(rèn)有無突變。表1：引物列表(6)把無其它突變位點(diǎn)的細(xì)胞株再擴(kuò)大，建庫(kù)以備生產(chǎn)。實(shí)施例二本發(fā)明的aav受體敲除的hek293細(xì)胞株制備aav利用aav受體敲除的hek293細(xì)胞株制備aav的方法，具體操作步驟包括：利用本發(fā)明細(xì)胞株arko-x88，采用常規(guī)的aav生產(chǎn)方法，即如下：1、鋪arko-x88細(xì)胞約3x105至24孔板中，第二天轉(zhuǎn)染時(shí)細(xì)胞密度約為60～70％；2、用aav輔助載體prc-dj(載體來源：在來源于美國(guó)賓夕法尼亞大學(xué)載體部upennvectorcore的paav2/2基礎(chǔ)上，用根據(jù)公開的aav-dj的序列替換aav2cap2序列合成)與ad輔助載體pad-deltaf6(載體來源：美國(guó)賓夕法尼亞大學(xué)載體部upennvectorcorepl-f-pvadf6)及重組aav載體pitr-cag.egfp(載體來源：來源于美國(guó)賓夕法尼亞大學(xué)載體部upennvectorcore的pl-c-pv1045pennaavcb6pimaster，用常規(guī)的克隆方法插入egfp蛋白編碼構(gòu)建而成)各0.2～2ug，加入0.5mldmem中，再加入pei1～5ul(1ug/ul)，馬上混勻，常溫下放置10分鐘后加入細(xì)胞培養(yǎng)基中，再放回37度細(xì)胞培養(yǎng)箱(5％co2濃度)培養(yǎng)；3、培養(yǎng)72小時(shí)后收集細(xì)胞和上清，在37℃水浴和干冰-乙醇浴中(干冰+乙醇可快速凍結(jié)液體及細(xì)胞，更有利于破裂細(xì)胞，釋放出aav顆粒)中往返凍融三次(解凍與凍結(jié)每次各2分鐘)，10000g離心10分鐘后上清為aav粗提液。對(duì)照試驗(yàn)：用未敲出aav受體的hek293細(xì)胞制備aav的方法1、鋪hek293細(xì)胞約3x105至24孔板中，第二天轉(zhuǎn)染時(shí)細(xì)胞密度約為60～70％。2、用aav輔助載體prc-dj與ad輔助載體pad-deltaf6及重組aav載體pitr-cag.egfp載體各0.2～2ug，加入0.5mldmem中，再加入pei1～5ul(1ug/ul)，馬上混勻，常溫下放置10分鐘后加入細(xì)胞培養(yǎng)基中，再放回37度細(xì)胞培養(yǎng)箱(5％co2濃度)培養(yǎng)。3、72小時(shí)后收集細(xì)胞和上清，在37℃水浴和干冰-乙醇浴中中往返凍融三次(解凍與凍結(jié)每次各2分鐘)，10000g離心10分鐘后上清為aav粗提液。本發(fā)明aavrkohek293細(xì)胞與常規(guī)hek293細(xì)胞的aav生產(chǎn)率對(duì)比見圖1。以上所述實(shí)施例僅表達(dá)了本發(fā)明的幾種實(shí)施方式，其描述較為具體和詳細(xì)，但并不能因此而理解為對(duì)本發(fā)明專利范圍的限制。應(yīng)當(dāng)指出的是，對(duì)于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干變形和改進(jìn)，這些都屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。因此，本發(fā)明專利的保護(hù)范圍應(yīng)以所附權(quán)利要求為準(zhǔn)。當(dāng)前第1頁(yè)12