本發(fā)明涉及基因工程
技術(shù)領(lǐng)域：
，尤其是涉及一種檢測(cè)ret基因突變的引物組及其應(yīng)用和應(yīng)用其的產(chǎn)品以及檢測(cè)ret基因突變的方法。
背景技術(shù)：
：原癌基因ret(rearrangedduringtransfection；omim：164761)定位于人類(lèi)染色體10q11.2，全長(zhǎng)80kb，含21個(gè)外顯子(約長(zhǎng)55kb)，其剪接變異體包含ret基因的第1～19外顯子，并帶有獨(dú)特的3’末端序列。ret編碼1114個(gè)氨基酸的酪氨酸激酶受體，主要在神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞、泌尿生殖系統(tǒng)和中央或外周神經(jīng)細(xì)胞系統(tǒng)中表達(dá)。ret蛋白屬于細(xì)胞表面分子，包括胞外區(qū)、跨膜區(qū)和胞內(nèi)區(qū)功能域，與膠質(zhì)細(xì)胞衍生神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(glial-derivedneurotropicfactor，gdnf)家族的配體：gdnf、neurturin、persephin和artemin相互作用，轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞分化和生長(zhǎng)的信號(hào)。ret基因在體內(nèi)和體外均能通過(guò)細(xì)胞遺傳學(xué)重排激活成為致癌基因。種系水平ret突變(獲得功能突變)可導(dǎo)致起源于神經(jīng)嵴細(xì)胞的多發(fā)性?xún)?nèi)分泌腺瘤2型(multipleendocrineneoplasiatype2，men2)的發(fā)生，目前已發(fā)現(xiàn)超過(guò)166種ret變異體，其中70余種ret突變體可引起men2的發(fā)生。men2包括2種亞型：2a型(men2a；占95％)和2b型(men2b；占5％)。發(fā)病率約為1/30000。經(jīng)典型men2a的臨床主要表現(xiàn)為2種或以上特定的內(nèi)分泌腫瘤：甲狀腺髓樣癌(medullarythyroidcarcinoma，mtc；95％～100％)、腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤(pheochromocytoma，pheo；50％)和甲狀旁腺功能亢進(jìn)(hyperparathyroidism，hpt；20％～30％)。少部分men2a患者伴發(fā)肩背部區(qū)域(t2～t6)瘙癢性皮膚苔蘚淀粉樣變(cutaneouslichenamyloidosis，cla；9％)或伴先天性巨結(jié)腸癥(hirschsprungdisease,hscr；7％)，或僅患有mtc且不伴其它內(nèi)分泌腺腫瘤的家族性mtc(familialmedullarythyroidcarcinoma，fmtc；15％)。men2b患者很早就表現(xiàn)為侵襲性mtc，其他癥狀包括pheo(50％)、舌前背、腭、咽黏膜神經(jīng)節(jié)瘤(70％～100％)和胃腸道彌漫性神經(jīng)節(jié)瘤(40％～90％)、眼部異常(上瞼緣外翻，淚液分泌減少)和角膜增厚(60％～90％)和marfan樣體征(75％)或可伴發(fā)無(wú)臨床意義的甲狀旁腺瘤/增生。與men2相關(guān)的ret突變絕大多數(shù)為雜合性種系突變，極少數(shù)為純合子或雙突變、多位點(diǎn)突變，突變熱區(qū)主要集中于ret基因的第5、8、10、11、13-16外顯子：(1)在約98％的men2a家系可見(jiàn)種系水平的ret基因第10和11外顯子突變，其中約87％以上的突變發(fā)生在ret基因第11外顯子第630(c630f/r/s/y)、634(c634f/g/r/s/w/y)位密碼子點(diǎn)突變；其余突變多發(fā)生在第10外顯子第609位(c609f/g/r/s/y)、第611位(c611f/g/r/s/w/y)、第618位(c618f/g/r/s/y)和第620位(c620f/g/r/s/w/y)密碼子，即半胱氨酸被置換。在約95％的fmtc家系和7％的散發(fā)性mtc患者中可見(jiàn)種系水平的ret基因突變，典型的是第609位、第611位、第618位、第620位和第634位密碼子突變，其中第618位、第620位和第634位的突變各占20％～30％。其余的突變發(fā)生在第5、8、13-16外顯子，又以第768位和第804為密碼子為常見(jiàn)。(2)men2b患者ret基因突變約95％為第16外顯子的m918t，4％為第15外顯子的a883f突變。這些特異的ret基因突變型轉(zhuǎn)化甲狀腺c細(xì)胞增生進(jìn)展至mtc的活力呈現(xiàn)明顯的年齡相關(guān)性，即突變型轉(zhuǎn)化活力強(qiáng)的，men2-mtc侵襲性更強(qiáng)、發(fā)病年齡更早，其mtc的診斷年齡和外顯率較pheo更早或更高，反之亦然。ret突變基因型和臨床表型呈現(xiàn)出很好的相關(guān)性。1)第10外顯子第609、611、618、620位和第11外顯子第630、634位密碼子是fmtc和men2a最常見(jiàn)的突變位點(diǎn)，且常為半胱氨酸殘基的錯(cuò)義突變。ret基因半胱氨酸殘基替換導(dǎo)致在未與配體結(jié)合下使ret單體通過(guò)二硫鍵自身聚合，形成畸變的同源二聚體，啟動(dòng)胞內(nèi)酪氨酸殘基磷酸化，異常激活酪氨酸蛋白激酶活性(ret蛋白二聚體的激酶活性至少是單體的10倍)。2)第13外顯子第768、790、791位密碼子、第14外顯子第804、819、833、844和15外顯子第866、891位密碼子等。胞內(nèi)區(qū)突變常為非半胱氨酸密碼子突變；上述位點(diǎn)突變導(dǎo)致的激酶自身磷酸化活性較低、轉(zhuǎn)化能力較弱，往往與fmtc表型密切相關(guān)，僅見(jiàn)少部分突變與其他men2a亞型相關(guān)。3)同為胞內(nèi)區(qū)的ret基因第15外顯子a833f和第16外顯子m918t突變主要與men2b有關(guān)。這類(lèi)突變具有超強(qiáng)的激酶活性和激活大多以單體形式的受體轉(zhuǎn)化活性，導(dǎo)致底物結(jié)合區(qū)構(gòu)象的改變、不適當(dāng)?shù)孜锪姿峄碳ば盘?hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，使正常ret基因不能參與這一信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。4)其他，可見(jiàn)于ret基因的5號(hào)外顯子(v292m)和8號(hào)外顯子(c.1585_1593dupgaggagtgt；g533c)可導(dǎo)致men2a或fmtc。依據(jù)men2的表型可做出臨床診斷，但men2的精準(zhǔn)診斷需基于種系ret突變檢測(cè)，后者是診斷men2的金標(biāo)準(zhǔn)，也是與散發(fā)mtc/pheo/hpt的本質(zhì)區(qū)別所在。國(guó)際mtc診治指南：美國(guó)甲狀腺協(xié)會(huì)(ata)-2015、歐洲甲狀腺協(xié)會(huì)(eta)-2012和美國(guó)國(guó)家癌癥網(wǎng)(nccn)-2010均推薦對(duì)所有首診mtc患者進(jìn)行ret突變檢測(cè)，對(duì)突變者的其他家族成員進(jìn)行ret突變篩查：(1)mtc患者其一生中進(jìn)行一次ret突變檢測(cè)可明確是不是men2；(2)循men2患者進(jìn)行家系調(diào)查和ret突變篩查，可發(fā)現(xiàn)ret突變者在沒(méi)有出現(xiàn)men2臨床癥狀前得以早期明確診斷；(3)依據(jù)ret突變危險(xiǎn)分級(jí)整合血清降鈣素水平等，對(duì)men2患者實(shí)施早期個(gè)體化精準(zhǔn)治療或監(jiān)視隨訪；(4)有別于無(wú)癥狀散發(fā)mtc患者，大多限于體檢發(fā)現(xiàn)或并經(jīng)穿刺活檢病理明確診斷后才進(jìn)行治療；(5)5.6％～9％的men2a為denovoret突變，90％的men2b為denovoret-m918t所致，有利于此部分原先考慮“散發(fā)mtc”診斷的修正及其子代的及時(shí)治療或監(jiān)視；(6)men2相關(guān)伴隨疾病的及早準(zhǔn)確診治；(7)有利于men2的預(yù)防。因此加強(qiáng)mtc/pheo等患者的ret基因篩查(分子診斷)，進(jìn)行遺傳咨詢(xún)指導(dǎo)，積極采取臨床早期干預(yù)措施及其綜合規(guī)范治療，有效實(shí)踐轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)和精準(zhǔn)醫(yī)療，可最大限度減少men2的臨床危害。目前，對(duì)ret基因突變的檢測(cè)方法相對(duì)復(fù)雜，使用效率相對(duì)較低。因此，開(kāi)發(fā)一種能夠快速、準(zhǔn)確、有效的檢測(cè)ret基因突變的試劑盒及操作簡(jiǎn)單的檢測(cè)方法尤為重要。有鑒于此，特提出本發(fā)明。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的第一個(gè)目的在于提供一種檢測(cè)ret基因突變的引物組，本發(fā)明的第二個(gè)目的在于提供上述引物組在檢測(cè)ret基因突變中的應(yīng)用，本發(fā)明的第三個(gè)目的在于提供上述引物組在制備用于檢測(cè)ret基因突變的產(chǎn)品中的應(yīng)用，本發(fā)明的第四個(gè)目的在于提供一種用于檢測(cè)ret基因突變的試劑，本發(fā)明的第五個(gè)目的在于提供一種用于檢測(cè)ret基因突變的試劑盒，本發(fā)明的第六個(gè)目的在于提供一種檢測(cè)ret基因突變的方法，以緩解現(xiàn)有技術(shù)中存在的對(duì)ret基因突變的檢測(cè)尚不全面，并且檢測(cè)方法復(fù)雜，效率低的技術(shù)問(wèn)題。本發(fā)明提供的一種檢測(cè)ret基因突變的引物組，所述引物組包括如下7個(gè)引物對(duì)中的至少一個(gè)引物對(duì)，所述7個(gè)引物對(duì)為：用于檢測(cè)ret基因第5外顯子的引物對(duì)，用于檢測(cè)ret基因第8外顯子的引物對(duì)，用于檢測(cè)ret基因第10外顯子的引物對(duì)，用于檢測(cè)ret基因第11外顯子的引物對(duì)，用于檢測(cè)ret基因第13外顯子的引物對(duì)，用于檢測(cè)ret基因第14外顯子和/或第15外顯子的引物對(duì)以及用于檢測(cè)ret基因第16外顯子的引物對(duì)；所述用于檢測(cè)ret基因第5外顯子的引物對(duì)包括seqidno.1和seqidno.2所示的核苷酸序列；所述用于檢測(cè)ret基因第8外顯子的引物對(duì)包括seqidno.3和seqidno.4所示的核苷酸序列；所述用于檢測(cè)ret基因第10外顯子的引物對(duì)包括seqidno.5和seqidno.6所示的核苷酸序列；所述用于檢測(cè)ret基因第11外顯子的引物對(duì)包括seqidno.7和seqidno.8所示的核苷酸序列；所述用于檢測(cè)ret基因第13外顯子的引物對(duì)包括seqidno.9和seqidno.10所示的核苷酸序列；所述用于檢測(cè)ret基因第14外顯子和/或第15外顯子的引物對(duì)包括seqidno.11和seqidno.12所示的核苷酸序列；所述用于檢測(cè)ret基因第16外顯子的引物對(duì)包括seqidno.13和seqidno.14所示的核苷酸序列。進(jìn)一步地，所述引物組由7個(gè)所述引物對(duì)組成。本發(fā)明還提供了上述的引物組在檢測(cè)ret基因突變中的應(yīng)用。本發(fā)明還提供了上述的引物組在制備用于檢測(cè)ret基因突變的產(chǎn)品中的應(yīng)用。進(jìn)一步地，所述產(chǎn)品為試劑。本發(fā)明還提供了一種用于檢測(cè)ret基因突變的試劑，包括上述的引物組。本發(fā)明還提供了一種用于檢測(cè)ret基因突變的試劑盒，包括上述的引物組或試劑。本發(fā)明還提供了一種檢測(cè)ret基因突變的方法，應(yīng)用上述的引物組或試劑或試劑盒。進(jìn)一步地，所述方法包括：以所述引物組為引物，以待測(cè)樣本的dna為模板，進(jìn)行pcr擴(kuò)增反應(yīng)，得到pcr擴(kuò)增產(chǎn)物并對(duì)所述擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，得到測(cè)序結(jié)果，對(duì)所述測(cè)序結(jié)果進(jìn)行分析并注明突變位點(diǎn)。進(jìn)一步地，所述測(cè)序使用的引物為：所述seqidno.1所示的核苷酸序列，所述seqidno.4所示的核苷酸序列，所述seqidno.5所示的核苷酸序列，所述seqidno.7所示的核苷酸序列，所述seqidno.9所示的核苷酸序列，所述seqidno.11所示的核苷酸序列，所述seqidno.12所示的核苷酸序列，所述seqidno.13所示的核苷酸序列。本發(fā)明提供的檢測(cè)ret基因突變的引物組，包括用于檢測(cè)ret基因第5外顯子、第8外顯子、第10外顯子、第11外顯子、第13外顯子、第14外顯子和/或第15外顯子、第16外顯子的引物對(duì)中的一種或兩種以上，可同時(shí)檢測(cè)ret基因的多種突變，檢測(cè)全面，應(yīng)用廣泛。本發(fā)明提供的用于檢測(cè)ret基因突變的試劑，包括本發(fā)明提供的引物組，檢測(cè)快速，準(zhǔn)確。本發(fā)明提供的用于檢測(cè)ret基因突變的試劑盒，包括本發(fā)明提供的引物組或試劑，能夠快速、準(zhǔn)確地檢測(cè)ret基因的突變，靈敏度高、特異性強(qiáng)，能對(duì)men2患者的診斷、治療及遺傳咨詢(xún)方面提供指導(dǎo)，達(dá)到早發(fā)現(xiàn)、早治療，以期患者得到更多獲益。本發(fā)明提供的檢測(cè)ret基因突變的方法，操作簡(jiǎn)單，成本低廉，耗時(shí)短，臨床應(yīng)用范圍廣。附圖說(shuō)明圖1為本發(fā)明實(shí)施例2提供的樣本pcr產(chǎn)物電泳鑒定圖；圖2為本發(fā)明實(shí)施例2提供的樣本dna測(cè)序結(jié)果峰圖。具體實(shí)施方式下面將結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整地描述。顯然，所描述的實(shí)施例是本發(fā)明一部分實(shí)施例，而不是全部的實(shí)施例?；诒景l(fā)明中的實(shí)施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒(méi)有做出創(chuàng)造性勞動(dòng)前提下所獲得的所有其他實(shí)施例，都屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。本發(fā)明提供了一種檢測(cè)ret基因突變的引物組，包括如下7個(gè)引物對(duì)中的至少一個(gè)引物對(duì)，所述7個(gè)引物對(duì)為：本發(fā)明提供的檢測(cè)ret基因突變的引物組，可同時(shí)檢測(cè)ret基因的多種突變，檢測(cè)全面，應(yīng)用廣泛。在本發(fā)明中，引物組由上述7個(gè)所述引物對(duì)組成。本發(fā)明還提供了上述的引物組在檢測(cè)ret基因突變中的應(yīng)用。本發(fā)明還提供了上述的引物組在制備用于檢測(cè)ret基因突變的產(chǎn)品中的應(yīng)用。在本發(fā)明中，用于檢測(cè)ret基因突變的產(chǎn)品為試劑。本發(fā)明還提供了一種用于檢測(cè)ret基因突變的試劑，包括上述的引物組。本發(fā)明提供的用于檢測(cè)ret基因突變的試劑，包括本發(fā)明提供的引物組，檢測(cè)快速，準(zhǔn)確。本發(fā)明還提供了一種用于檢測(cè)ret基因突變的試劑盒，包括上述的引物組或試劑。在本發(fā)明中，用于檢測(cè)ret基因突變的試劑盒還包括pcr緩沖液、dntps、mgcl2、taqdna聚合酶和模板dna。本發(fā)明提供的用于檢測(cè)ret基因突變的試劑盒，包括本發(fā)明提供的引物組或試劑，能夠快速、準(zhǔn)確地檢測(cè)ret基因的突變，靈敏度高、特異性強(qiáng)，能對(duì)men2患者的治療提供遺傳學(xué)方面的指導(dǎo)，達(dá)到提早發(fā)現(xiàn)，早期治療，以使患者得到更多的獲益的目的。本發(fā)明還提供了一種檢測(cè)ret基因突變的方法，應(yīng)用上述的引物組或試劑或試劑盒。其中，檢測(cè)ret基因突變不以疾病的診斷與治療為目的。在本發(fā)明中，該方法包括：以引物組為引物，以待測(cè)樣本的dna為模板，進(jìn)行pcr擴(kuò)增反應(yīng)，得到pcr擴(kuò)增產(chǎn)物并對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，得到測(cè)序結(jié)果，對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行分析并注明突變位點(diǎn)。其中，pcr擴(kuò)增體系為：試劑體積10×pcr緩沖液5μldntps(2.5mm)3μl上游引物10μm下游引物10μmtaqdna聚合酶1μl(2u)template20-50ngh2oupto50μlpcr擴(kuò)增條件為：95℃預(yù)變性5min；95℃變性30s，60℃退火30s，72℃延伸1min，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸5min。在本發(fā)明中，測(cè)序使用的引物為：用于檢測(cè)ret基因第5外顯子的seqidno.1所示的核苷酸序列，用于檢測(cè)ret基因第8外顯子的seqidno.4所示的核苷酸序列，用于檢測(cè)ret基因第10外顯子的seqidno.5所示的核苷酸序列，用于檢測(cè)ret基因第11外顯子的seqidno.7所示的核苷酸序列，用于檢測(cè)ret基因第13外顯子的seqidno.9所示的核苷酸序列，用于檢測(cè)ret基因第14外顯子的seqidno.11所示的核苷酸序列，用于檢測(cè)ret基因第15外顯子的seqidno.12所示的核苷酸序列，用于檢測(cè)ret基因第16外顯子的seqidno.13所示的核苷酸序列。本發(fā)明提供的檢測(cè)ret基因突變的方法，操作簡(jiǎn)單，成本低廉，耗時(shí)短，臨床應(yīng)用范圍廣。為了更清楚地說(shuō)明本發(fā)明，下面結(jié)合優(yōu)選實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的說(shuō)明。實(shí)施例1樣本的處理取外周血2ml于edta抗凝管中，輕柔地顛倒混勻，4℃保存。取200μl抗凝血，用試劑盒提取dna，采用電泳凝膠成像對(duì)dna純度和濃度作檢測(cè)。具體操作步驟如下：加500μlbufferap1到1.5ml離心管中；加200-250μl抗凝全血到bufferap1中，用移液器來(lái)回吸注幾次，以徹底溶解殘留在吸頭上的血液；蓋緊離心管蓋子，旋渦振蕩10s；加100μlbufferap2，旋渦振蕩10s，2,000×g離心10min，得濾液；將制備管置于2ml離心管中，將上述濾液加入到制備管中，12,000×g離心1min；棄濾液，將制備管置回到原2ml離心管中，加入700μlbufferw1a，室溫放置2min12,000×g離心30s；棄濾液，將制備管置回到原2ml離心管中，加入800μl已加無(wú)水乙醇的bufferw2，12,000×g離心1min；將棄濾液，將制備管置回原2ml離心管，12,000×g離心1min；將制備管置于另一潔凈的1.5ml離心管中，在silica膜中央加入80-200μlbufferte，室溫靜置1min，12,000×g離心1min洗脫dna。實(shí)施例2樣本的檢測(cè)(1)pcr反應(yīng)體系的配置在每一個(gè)反應(yīng)孔中加入試劑盒中的pcr緩沖液、dntps、mgcl2、taqdna聚合酶、模板dna的pcr反應(yīng)體系如下：試劑體積10×pcr緩沖液5μldntps(2.5mm)3μl上游引物10μm下游引物10μmtaqdna聚合酶1μl(2u)template20-50ngh2oupto50μl使用對(duì)應(yīng)引物擴(kuò)增目標(biāo)外顯子：(2)pcr擴(kuò)增條件為：95℃預(yù)變性5min；95℃變性30s，60℃退火30s，72℃延伸1min，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸5min。結(jié)果如圖1所示。其中，泳道1-8分別為dl2000marker，以seq3/seq4、seq13/seq14、seq11/seq12、seq9/seq10、seq1/seq2、seq7/seq8、seq5/seq6為引物的pcr產(chǎn)物。(3)pcr產(chǎn)物純化：為了提高回收效率，使用磁珠純化的方式，對(duì)pcr產(chǎn)物進(jìn)行快速純化。(4)使用abi3730xl測(cè)序儀器測(cè)序：測(cè)序pcr反應(yīng)條件：1μlbigdye(2.5×)+1.5μlbigdyeseqbuffer(5×)+1μl測(cè)序引物+2μlpcr純化產(chǎn)物+3.5μlddh20。95℃預(yù)變性1min；95℃變性30s，50℃退火10s，60℃延伸3min，25個(gè)循環(huán)；72℃延伸5min。使用酒精/naac/edta方法純化后，按照abi說(shuō)明進(jìn)行上機(jī)測(cè)序。測(cè)序使用的引物為：用于檢測(cè)ret基因第5外顯子的seqidno.1所示的核苷酸序列，用于檢測(cè)ret基因第8外顯子的seqidno.4所示的核苷酸序列，用于檢測(cè)ret基因第10外顯子的seqidno.5所示的核苷酸序列，用于檢測(cè)ret基因第11外顯子的seqidno.7所示的核苷酸序列，用于檢測(cè)ret基因第13外顯子的seqidno.9所示的核苷酸序列，用于檢測(cè)ret基因第14外顯子的seqidno.11所示的核苷酸序列，用于檢測(cè)ret基因第15外顯子的seqidno.12所示的核苷酸序列，用于檢測(cè)ret基因第16外顯子的seqidno.13所示的核苷酸序列。(5)使用軟件對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行分析測(cè)序完成后，對(duì)測(cè)序的結(jié)果使用seqscap軟件進(jìn)行分析，并注明突變位點(diǎn)。結(jié)果如圖2所示。(6)結(jié)論通過(guò)對(duì)這幾個(gè)外顯子的比對(duì)分析，發(fā)現(xiàn)了突變，結(jié)果如下：突變位點(diǎn)突變方式密碼子改變r(jià)s號(hào)5號(hào)外顯子無(wú)突變---8號(hào)外顯子無(wú)突變---10號(hào)外顯子無(wú)突變---11號(hào)外顯子c.1901g>atgc>tacrs7599617313號(hào)外顯子無(wú)突變---14號(hào)外顯子無(wú)突變---15號(hào)外顯子無(wú)突變---16號(hào)外顯子無(wú)突變---最后應(yīng)說(shuō)明的是：以上各實(shí)施例僅用以說(shuō)明本發(fā)明的技術(shù)方案，而非對(duì)其限制；盡管參照前述各實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)的說(shuō)明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解：其依然可以對(duì)前述各實(shí)施例所記載的技術(shù)方案進(jìn)行修改，或者對(duì)其中部分或者全部技術(shù)特征進(jìn)行等同替換；而這些修改或者替換，并不使相應(yīng)技術(shù)方案的本質(zhì)脫離本發(fā)明各實(shí)施例技術(shù)方案的范圍。sequencelisting<110>中國(guó)人民解放軍第一一七醫(yī)院上海祥音生物科技有限公司<120>檢測(cè)ret基因突變的引物組及其應(yīng)用和應(yīng)用其的產(chǎn)品以及檢測(cè)ret基因突變的方法<160>14<170>patentinversion3.5<210>1<211>20<212>dna<213>人工序列<400>1atctggtccacctatgggct20<210>2<211>20<212>dna<213>人工序列<400>2tcagctcagggagagaggtc20<210>3<211>20<212>dna<213>人工序列<400>3gctgcactcacatccttcct20<210>4<211>20<212>dna<213>人工序列<400>4ccattctgtccccagcacat20<210>5<211>20<212>dna<213>人工序列<400>5ctcactgggcctatgcttgc20<210>6<211>20<212>dna<213>人工序列<400>6ctgagaacaccccatcgagc20<210>7<211>20<212>dna<213>人工序列<400>7ggtctaggagggggcagtaa20<210>8<211>20<212>dna<213>人工序列<400>8cacctcatcacagtcccacc20<210>9<211>20<212>dna<213>人工序列<400>9tgcggggaatttctgtggac20<210>10<211>20<212>dna<213>人工序列<400>10tgacaatgttcctgccatgc20<210>11<211>20<212>dna<213>人工序列<400>11gctgtgtccacccccttact20<210>12<211>21<212>dna<213>人工序列<400>12gcggagttctaattgggtcct21<210>13<211>20<212>dna<213>人工序列<400>13gctccagccccttcaaagat20<210>14<211>20<212>dna<213>人工序列<400>14ctttgagcagtttggggcac20當(dāng)前第1頁(yè)12