本發(fā)明涉及一種檢測(cè)體外培養(yǎng)的細(xì)胞的細(xì)胞分泌功能的方法，特別涉及一種能排除細(xì)胞數(shù)量對(duì)細(xì)胞分泌功能檢測(cè)結(jié)果造成干擾的方法。
背景技術(shù)：
比較研究體外培養(yǎng)的細(xì)胞的細(xì)胞分泌功能是科研過程中十分常見的實(shí)驗(yàn)內(nèi)容，例如，研究不同干預(yù)因素下同一種細(xì)胞的細(xì)胞分泌功能的改變；研究數(shù)種細(xì)胞經(jīng)相同干預(yù)因素處理后的細(xì)胞分泌功能的改變，等等。常規(guī)的實(shí)驗(yàn)步驟往往是：將各細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，等量接種于細(xì)胞培養(yǎng)板，定期換液，保證各組細(xì)胞除干預(yù)因素外的其它培養(yǎng)條件一致，定期收取細(xì)胞培養(yǎng)板中的細(xì)胞培養(yǎng)液并檢測(cè)其中細(xì)胞分泌物的含量。常用的檢測(cè)方法包括酶聯(lián)免疫吸附劑測(cè)定法、免疫印跡法、羥脯氨酸試劑盒等。
上述實(shí)驗(yàn)過程無法回答如下問題：等量的同一種細(xì)胞接種后，培養(yǎng)過程中經(jīng)過不同干預(yù)因素處理，其細(xì)胞數(shù)量的差異有沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；等量的數(shù)種細(xì)胞接種后，經(jīng)過一段時(shí)間的培養(yǎng)，其細(xì)胞數(shù)量的差異有沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；上述問題表明，應(yīng)用上述方法檢測(cè)細(xì)胞分泌功能時(shí)無法排除細(xì)胞數(shù)量這一干擾因素。為了排除細(xì)胞數(shù)量對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果造成的干擾，有研究在收取細(xì)胞培養(yǎng)板中的細(xì)胞培養(yǎng)液后，將細(xì)胞培養(yǎng)板中的細(xì)胞消化后用細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，或者直接在顯微鏡下計(jì)數(shù)細(xì)胞培養(yǎng)板上的細(xì)胞數(shù)量；也有研究在收取細(xì)胞培養(yǎng)板中的細(xì)胞培養(yǎng)液后，將細(xì)胞培養(yǎng)板上的細(xì)胞消化，測(cè)量其蛋白濃度，間接反映細(xì)胞數(shù)量。上述方法要么主觀性太強(qiáng)，要么操作繁瑣。有必要探索更客觀、更簡(jiǎn)單的方法排除細(xì)胞數(shù)量對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果造成的干擾。
wst-8與mtt類似，在電子耦合試劑存在時(shí)，被線粒體內(nèi)的脫氫酶還原生成橙黃色的formazan，對(duì)于同樣的細(xì)胞而言，顏色的深淺和細(xì)胞的數(shù)量呈線性關(guān)系。cellcountingkit-8簡(jiǎn)稱cck-8試劑盒正是利用這一原理進(jìn)行細(xì)胞增殖能力的檢測(cè)。更重要的是，wst-8對(duì)細(xì)胞無明顯毒性，檢測(cè)完畢更換培養(yǎng)液后可以繼續(xù)培養(yǎng)該細(xì)胞。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是：針對(duì)現(xiàn)有方法檢測(cè)細(xì)胞分泌功能時(shí)無法排除細(xì)胞數(shù)量這一干擾因素的問題。
為了排除細(xì)胞數(shù)量對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果造成的干擾，本專利提供一種檢測(cè)細(xì)胞分泌功能的方法，應(yīng)用該方法可以測(cè)得細(xì)胞數(shù)量、細(xì)胞培養(yǎng)液中細(xì)胞分泌物的含量，利用細(xì)胞培養(yǎng)液中細(xì)胞分泌物的含量與細(xì)胞數(shù)量的比值反映細(xì)胞分泌功能。該方法操作方便，結(jié)果客觀。
本發(fā)明采取的技術(shù)方案是：
一種檢測(cè)細(xì)胞分泌功能的方法，其特征在于，其包括如下步聚：1)將細(xì)胞懸液接種至細(xì)胞培養(yǎng)板上，定期更換細(xì)胞培養(yǎng)液；2)定期收取培細(xì)胞養(yǎng)板中的細(xì)胞培養(yǎng)液，測(cè)量細(xì)胞培養(yǎng)液中細(xì)胞分泌物的含量；3)收取細(xì)胞培養(yǎng)板中的細(xì)胞培養(yǎng)液后，立即對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)板中的細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)；4)利用步驟2所測(cè)的細(xì)胞培養(yǎng)液中細(xì)胞分泌物的含量與步驟3所測(cè)的細(xì)胞培養(yǎng)板中的細(xì)胞數(shù)量的比值，校正步驟2所測(cè)的細(xì)胞培養(yǎng)液中細(xì)胞分泌物的含量。
為了測(cè)量各取材時(shí)相點(diǎn)的細(xì)胞數(shù)量，利用現(xiàn)有的基于wst-8的cck-8試劑盒對(duì)步驟3所述的細(xì)胞培養(yǎng)板中的細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。
為了測(cè)量各取材時(shí)相點(diǎn)收取的細(xì)胞培養(yǎng)液中細(xì)胞分泌物的含量，利用現(xiàn)有的酶聯(lián)免疫吸附劑測(cè)定法、免疫印跡法、羥脯氨酸試劑盒等方法測(cè)量步驟2中所述細(xì)胞培養(yǎng)液中細(xì)胞分泌物的含量。
根據(jù)不同實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的需要，在同一取材時(shí)相點(diǎn)，步驟2中收取細(xì)胞培養(yǎng)液的細(xì)胞培養(yǎng)板與步驟3中進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)的細(xì)胞培養(yǎng)板既可以是同一細(xì)胞培養(yǎng)板，也可以是相同接種條件、培養(yǎng)條件的兩個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)板。
根據(jù)不同實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的需要，各取材時(shí)相點(diǎn)，步驟2中收取細(xì)胞培養(yǎng)液的細(xì)胞培養(yǎng)板既可以是同一細(xì)胞培養(yǎng)板，也可以是相同接種條件、培養(yǎng)條件的多個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)板；步驟3中進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)的細(xì)胞培養(yǎng)板既可以是同一細(xì)胞培養(yǎng)板，也可以是相同接種條件、培養(yǎng)條件的多個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)板。
本發(fā)明中所述細(xì)胞既可以是貼壁生長(zhǎng)的細(xì)胞，也可以是懸浮生長(zhǎng)的細(xì)胞。
本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比：使用本發(fā)明的方法所檢測(cè)出的細(xì)胞分泌功能經(jīng)過細(xì)胞數(shù)量校正，排除了細(xì)胞數(shù)量對(duì)測(cè)量結(jié)果的干擾，結(jié)果更客觀。
具體實(shí)施方式
為使本發(fā)明的內(nèi)容更加易懂，以下結(jié)合兩個(gè)具體實(shí)施方式進(jìn)一步說明本發(fā)明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實(shí)施例僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。
實(shí)施例1：貼壁生長(zhǎng)細(xì)胞細(xì)胞分泌功能的測(cè)定
(1)細(xì)胞的接種
20萬個(gè)人真皮成纖維細(xì)胞接種于六孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，加入培養(yǎng)液2.5ml，每3天更換一次細(xì)胞培養(yǎng)液。
(2)細(xì)胞培養(yǎng)液的取材
接種后第3，6天，從細(xì)胞培養(yǎng)板中吸取細(xì)胞培養(yǎng)液1.5ml。
(3)細(xì)胞計(jì)數(shù)
步驟(2)中細(xì)胞培養(yǎng)液取材完畢，棄去細(xì)胞培養(yǎng)板中殘留的細(xì)胞培養(yǎng)液，根據(jù)cck-8試劑盒的說明書，加入wst-8，測(cè)得細(xì)胞培養(yǎng)板中的細(xì)胞數(shù)量。棄去細(xì)胞培養(yǎng)板中wst-8并用pbs漂洗3次，加入細(xì)胞培養(yǎng)液2.5ml繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞。
(4)細(xì)胞培養(yǎng)液中細(xì)胞分泌物含量的測(cè)定
根據(jù)羥脯氨酸試劑盒的說明書，測(cè)得上述各時(shí)相點(diǎn)收取細(xì)胞培養(yǎng)液中膠原蛋白的含量。
(5)細(xì)胞培養(yǎng)液中細(xì)胞分泌物含量的校正
利用步驟(4)中所測(cè)膠原蛋白含量與步驟(3)所測(cè)細(xì)胞數(shù)量的比值，校正步驟(4)所測(cè)膠原蛋白含量。
實(shí)施例2：懸浮生長(zhǎng)細(xì)胞細(xì)胞分泌功能的測(cè)定
(1)細(xì)胞的接種
20萬個(gè)大鼠巨噬細(xì)胞接種于六孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，加入培養(yǎng)液2.5ml，每3天更換一次細(xì)胞培養(yǎng)液。
(2)細(xì)胞計(jì)數(shù)
接種后第3，6天，根據(jù)cck-8試劑盒的說明書，向六孔板中加入wst-8，測(cè)得細(xì)胞培養(yǎng)板中的細(xì)胞數(shù)量。
(3)細(xì)胞培養(yǎng)液的取材
步驟(2)檢測(cè)完畢，將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至無菌離心管，低速離心，從上清中吸取培養(yǎng)液1.5ml，棄去殘留上清，2.5ml細(xì)胞培養(yǎng)液重懸細(xì)胞沉淀后接種于六孔板中繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞。
(4)細(xì)胞培養(yǎng)液中細(xì)胞分泌物含量的測(cè)定
根據(jù)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β的酶聯(lián)免疫試劑盒的說明書，測(cè)得上述各時(shí)相點(diǎn)收取細(xì)胞培養(yǎng)液中轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β的含量。
(5)細(xì)胞培養(yǎng)液中細(xì)胞分泌物含量的校正
利用步驟(4)中所測(cè)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β的含量與步驟(2)所測(cè)細(xì)胞數(shù)量的比值，校正步驟(4)所測(cè)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β的含量。