本發(fā)明涉及一種合成磷脂酰絲氨酸的方法,尤其是采用高效的生物酶催化和現(xiàn)代化的分離技術(shù)的磷脂酰絲氨酸合成方法,具體是一種催化合成磷脂酰絲氨酸的生物酶及其制備方法和應(yīng)用。
背景技術(shù):
磷脂酰絲氨酸(phosphatidylserine簡(jiǎn)稱ps),又稱絲氨酸磷脂,二酰甘油酰磷酸絲氨酸,是一類普遍存在的磷脂,通常位于細(xì)胞膜的內(nèi)層,磷脂化學(xué)物中的磷酸甘油酯類,是細(xì)胞膜組分之一,與一系列的膜功能有關(guān)。尤其在人體的神經(jīng)系統(tǒng),是大腦的細(xì)胞膜的重要組成成分之一,同時(shí)對(duì)大腦的各種功能(尤其是對(duì)大腦的記憶力和情緒的穩(wěn)定)起到重要的調(diào)節(jié)作用,如它能影響著細(xì)胞膜的流動(dòng)性、通透性,并且能激活多種酶類的代謝和合成。具有重要的功能與作用:延緩衰老、維持機(jī)體健康年輕、強(qiáng)化腦部功能、增強(qiáng)記憶力、運(yùn)動(dòng)員等的營(yíng)養(yǎng)必需品、治療多動(dòng)癥兒童、促進(jìn)血液循環(huán)、分解過高的血脂和過高的膽固醇、清掃血管,使血管順暢,從而減輕脂肪肝的發(fā)病率,有“血管清道夫”的美譽(yù)。
目前工業(yè)化生產(chǎn)磷脂酰絲氨酸的制備方法主要有提取法和酶轉(zhuǎn)化法,其中提取法主要是從植物細(xì)胞、動(dòng)物的卵磷脂中提取ps,植物中的ps含量較少,所以提取法以動(dòng)物的卵磷脂中提取為主,從動(dòng)物中提取主要是動(dòng)物的大腦及內(nèi)臟,目前國(guó)外大部分以牛、羊、兔、馬、驢等家禽的動(dòng)物腦為原料來提取ps。近年來,由于瘋牛病的等動(dòng)物疾病的原因,利用動(dòng)物細(xì)胞提取ps的方法,其提取的產(chǎn)品的安全性收到人們的懷疑,現(xiàn)在已處于淘汰邊緣。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素:
為了解決以上問題,本發(fā)明的第一個(gè)目的在于提供一種催化合成磷脂酰絲氨酸的生物酶。
本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供一種編碼所述催化合成磷脂酰絲氨酸的生物酶的核苷酸序列。
本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供一種催化合成磷脂酰絲氨酸的生物酶的制備方法
本發(fā)明提供的磷脂酰絲氨酸的生物合成采用生物酶法催化一步合成磷脂酰絲氨酸;本發(fā)明采用酶高效轉(zhuǎn)化麥芽糖生成磷脂酰絲氨酸,并采用現(xiàn)代化的先進(jìn)分離技術(shù),使磷脂酰絲氨酸的工業(yè)化生產(chǎn)成本大大降低。
本發(fā)明的第四個(gè)目的是提供一種生物酶催化合成磷脂酰絲氨酸的方法。
本發(fā)明的技術(shù)方案如下:
一種催化合成磷脂酰絲氨酸的生物酶,所述生物酶為seqidno:2所示的氨基酸序列。
根據(jù)上述催化合成磷脂酰絲氨酸的生物酶,所述生物酶來源于體外重組構(gòu)建的基因工程菌株;所述基因工程菌株為大腸桿菌、畢氏酵母、枯草芽孢桿菌。
一種編碼上述的生物酶的核苷酸序列,所述核苷酸序列如seqidno:1所示。
一種上述的生物酶的制備方法,包括如下步驟:
(1)首先構(gòu)建磷脂酰絲氨酸酶的基因工程菌株,將權(quán)利要求2所述的核苷酸序列經(jīng)酶切重組到表達(dá)載體,轉(zhuǎn)化到宿主細(xì)胞中;
(2)將陽(yáng)性克隆挑入ypd液體培養(yǎng)基中活化后轉(zhuǎn)入bmgy液體培養(yǎng)基中,培養(yǎng),最后經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng),得到催化合成磷脂酰絲氨酸的生物酶。
一種權(quán)利要求1所述的生物酶催化磷脂酰絲氨酸的合成方法,包括如下步驟:
3)向反應(yīng)釜中加入大豆卵磷脂,l-絲氨酸,醋酸鈉,氯化鈣,純化水?dāng)嚢枞芙?;其中大豆卵磷脂的投料量?0~500g/l,l-絲氨酸的投料量為10~500g/l,醋酸鈉的投料量為10~100g/l,氯化鈣的投料量為1~100g/l;
4)采用抽真空氮?dú)庵脫Q的方法置換反應(yīng)體系中的空氣,置換完畢氮?dú)獗Wo(hù)整個(gè)反應(yīng)體系;
5)在25~65℃、氮?dú)獗Wo(hù)下,用堿性溶液調(diào)節(jié)ph值至5.0~8.0;
6)加入權(quán)利要求4所述的生物酶,氮?dú)獗Wo(hù)下、在25~65℃攪拌反應(yīng)6~48h;
7)反應(yīng)完畢,放料,料液離心,收集濾餅;
8)將得到的濾餅用去離子水打漿離心;
9)濾餅用二元混合溶劑溶解后過濾除去不溶性雜質(zhì);
10)減壓濃縮濾液,濃縮至物料粘稠流動(dòng)性較差時(shí),加入析晶溶劑,產(chǎn)品析出;
11)離心過濾后,用打漿溶劑打漿;
離心過濾,真空干燥得產(chǎn)品。
作為優(yōu)選,步驟3)中所述的堿性溶液為氫氧化鈉、碳酸鈉、碳酸氫鈉、氫氧化鉀、碳酸鉀、碳酸氫鉀、氨水中的一種。
作為優(yōu)選,步驟7)中所述的二元混合溶劑為乙酸乙酯同甲醇、正己烷同異丙醇、環(huán)己烷同乙醇、正己烷同乙醇中的一種。
作為優(yōu)選,所述的析晶溶劑為甲醇、乙醇、異丙醇、丙酮中的一種。
作為優(yōu)選,所述的打漿溶劑為甲醇、乙醇、異丙醇、丙酮中的一種。
有益的效果:本發(fā)明采用生物酶技術(shù),通過酶轉(zhuǎn)化法主要是以天然的卵磷脂為基質(zhì),加入絲氨酸,利用磷脂酰絲氨酸合成酶的高度專一性,催化卵磷脂和絲氨酸制備磷脂酰絲氨酸,有望改變目前在生產(chǎn)磷脂酰絲氨酸上存在的問題,為工業(yè)化定向生產(chǎn)高純度磷脂類物質(zhì)奠定基礎(chǔ)。
構(gòu)建生物酶的基因工程菌株,將全基因合成的生物酶基因片段,利用限制性內(nèi)切酶salⅰ線性化重組質(zhì)粒。將陽(yáng)性克隆挑入ypd液體培養(yǎng)基活化后轉(zhuǎn)入bmgy液體培養(yǎng)基中,培養(yǎng)至od為1.0時(shí)接入1%的甲醇誘導(dǎo),誘導(dǎo)72小時(shí),用于表達(dá)生物酶,經(jīng)過進(jìn)一步發(fā)酵獲得催化合成磷脂酰絲氨酸的生物酶,利用磷脂酰絲氨酸合成酶高度專一性,催化卵磷脂和絲氨酸制備磷脂酰絲氨酸,轉(zhuǎn)化率達(dá)到80%,有效地解決了目前浸提法和化學(xué)合成法無法獲取高純度磷脂酰絲氨酸的問題,而且工藝穩(wěn)定可靠,效率高,適合工業(yè)化生產(chǎn),在醫(yī)藥及食品保健品領(lǐng)域具有很大的應(yīng)用潛力。采用酶法合成安全環(huán)保可持續(xù),酶反應(yīng)生成率高,可到達(dá)95%以上,反應(yīng)液中磷脂酰絲氨酸濃度高達(dá)到100g/l。
具體實(shí)施方式
以下結(jié)合具體實(shí)施例,對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說明。應(yīng)理解,以下實(shí)施例僅由于說明本發(fā)明而非用于限定本發(fā)明的范圍。
實(shí)施例1:生物酶的基因工程菌株構(gòu)建
本發(fā)明所應(yīng)用lb液體培養(yǎng)基的組成:酵母粉5g,蛋白胨10g,氯化鈉10g,調(diào)節(jié)ph到7.0;加水定容至1l;
ypd培養(yǎng)基的組成:酵母粉10g,蛋白胨20g,葡萄糖20g,加水定容至1l;
bmgy液體培養(yǎng)基的組成:酵母粉10g,蛋白胨10g,ynb13.4g,甘油10g,生物素0.004g,用磷酸鹽緩沖液(0.1m)調(diào)節(jié)ph至6.0,加水定容至1l。
將全基因合成的生物酶片段(序列如seqidno:1所示,由常州基宇生物科技有限公司合成),經(jīng)限制性內(nèi)切酶ecorⅰ和not?。ㄙ?gòu)自newenglandbiolabs公司,根據(jù)說明書進(jìn)行操作)酶切后重組到酵母表達(dá)載體ppic9k(invitrogen公司),轉(zhuǎn)化到e.colitop10感受態(tài)(購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司),將e.colitop10置于lb液體培養(yǎng)基中,37℃、160rpm轉(zhuǎn)振蕩培養(yǎng)過夜,提取重組質(zhì)粒。利用限制性內(nèi)切酶sal?。ㄙ?gòu)自newenglandbiolabs公司,根據(jù)說明書進(jìn)行操作)線性化重組質(zhì)粒。
巴斯德畢赤酵母gs115感受態(tài)細(xì)胞(invitrogen公司):將pichiapastorisgs115單菌落挑入ypd培養(yǎng)基中活化,活化的pichiags115按0.5%的接種量接入50mlypd培養(yǎng)基中30℃培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期,離心獲得的菌體用20ml無菌水洗2次,再用20ml無菌1m山梨醇洗2次,加入1ml1m山梨醇溶液重懸菌體獲得巴斯德畢赤酵母gs115感受態(tài)細(xì)胞。
將線性化片段加入到80μl巴斯德畢赤酵母gs115感受態(tài)細(xì)胞中冰浴5分鐘,電轉(zhuǎn)化后加入800μl山梨醇將細(xì)胞洗至1.5ml無菌離心管中,25℃溫育2小時(shí)后,離心涂md平板,30℃培養(yǎng)至長(zhǎng)出菌落后,劃線分離出單菌落。將單菌落挑入無菌水中加入適量lyticase(購(gòu)自sigma公司)后37℃溫育1小時(shí)消化細(xì)胞壁,取部分消化產(chǎn)物加入pcr體系檢測(cè)陽(yáng)性克隆。
將陽(yáng)性克隆挑入ypd液體培養(yǎng)基后轉(zhuǎn)接入bmgy液體培養(yǎng)基中,培養(yǎng)至od為1.0時(shí)接入1%甲醇誘導(dǎo),誘導(dǎo)72小時(shí),每24小時(shí)補(bǔ)加一次甲醇用于表達(dá)本發(fā)明的生物酶。
實(shí)施例2:生物酶的發(fā)酵制備
取原種菌種在ypd劃線,30℃,倒置培養(yǎng)過夜。在平板上挑取單菌落(直徑1mm)至50mlypd液體培養(yǎng)基(酵母粉10g,蛋白胨10g,葡萄糖10g,加水定容至1l)中,30℃,200rpm振蕩培養(yǎng)過夜(24h),od600長(zhǎng)至4-5。以10%的接種量接種到300mlypd液體培養(yǎng)基中(1l三角瓶)搖瓶中,30℃、200rpm搖床振蕩培養(yǎng),約24小時(shí)后od600長(zhǎng)到12左右。將發(fā)酵培養(yǎng)基按每升料配置好后,倒入發(fā)酵罐(30l),121℃滅菌30min;降溫后控制溫度30℃,使用氨水調(diào)節(jié)ph值至5.0.將長(zhǎng)好的種子液接種進(jìn)罐,接種量5%。根據(jù)溶氧調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)速和通氣,控制溶氧在30%以上。培養(yǎng)24小時(shí)左右,待溶氧突變上升,此時(shí)濕重約為140g/l,開始補(bǔ)料50%(w/v),補(bǔ)料速度約為15ml/l發(fā)酵液/小時(shí),補(bǔ)料速度控制溶氧保持在30%以上;待菌種濕重長(zhǎng)至180g/l左右,停止補(bǔ)加甘油,以7.2ml/l發(fā)酵液/小時(shí)流速流加100%甲醇,誘導(dǎo)10小時(shí)后,ph值調(diào)節(jié)為6.0,誘導(dǎo)24小時(shí),ph調(diào)節(jié)為7.0,補(bǔ)料速度保持不變,根據(jù)溶氧調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)速和通氣,保持溶氧在30%以上。誘導(dǎo)96小時(shí)菌體濕重約為340g/l左右放罐。離心,收集清液,超濾濃縮后凍干,得到合成磷脂酰絲氨酸用生物酶凍干粉。
實(shí)施例3:生物酶催化合成磷酯酰絲氨酸
一種上述的生物酶的制備方法,包括如下步驟:
1)首先構(gòu)建磷脂酰絲氨酸酶的基因工程菌株,將權(quán)利要求2所述的核苷酸序列經(jīng)酶切重組到表達(dá)載體,轉(zhuǎn)化到宿主細(xì)胞中;
2)將陽(yáng)性克隆挑入ypd液體培養(yǎng)基中活化后轉(zhuǎn)入bmgy液體培養(yǎng)基中,培養(yǎng),最后經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng),得到催化合成磷脂酰絲氨酸的生物酶。
實(shí)施例4
一種權(quán)利要求1所述的生物酶催化磷脂酰絲氨酸的合成方法,包括如下步驟:
1)向反應(yīng)釜中加入大豆卵磷脂,l-絲氨酸,醋酸鈉,氯化鈣,純化水?dāng)嚢枞芙?;其中大豆卵磷脂的投料量?0~500g/l,l-絲氨酸的投料量為10~500g/l,醋酸鈉的投料量為10~100g/l,氯化鈣的投料量為1~100g/l;
2)采用抽真空氮?dú)庵脫Q的方法置換反應(yīng)體系中的空氣,置換完畢氮?dú)獗Wo(hù)整個(gè)反應(yīng)體系;
3)在25~65℃、氮?dú)獗Wo(hù)下,用堿性溶液調(diào)節(jié)ph值至5.0~8.0;
4)加入權(quán)利要求4所述的生物酶,氮?dú)獗Wo(hù)下、在25~65℃攪拌反應(yīng)6~48h;
5)反應(yīng)完畢,放料,料液離心,收集濾餅;
6)將得到的濾餅用去離子水打漿離心;
7)濾餅用二元混合溶劑溶解后過濾除去不溶性雜質(zhì);
8)減壓濃縮濾液,濃縮至物料粘稠流動(dòng)性較差時(shí),加入析晶溶劑,產(chǎn)品析出;
9)離心過濾后,用打漿溶劑打漿;
10)離心過濾,真空干燥得產(chǎn)品。
步驟3)中所述的堿性溶液為氫氧化鈉、碳酸鈉、碳酸氫鈉、氫氧化鉀、碳酸鉀、碳酸氫鉀、氨水中的一種。
步驟7)中所述的二元混合溶劑為乙酸乙酯同甲醇、正己烷同異丙醇、環(huán)己烷同乙醇、正己烷同乙醇中的一種。
所述的析晶溶劑可選用甲醇、乙醇、異丙醇、丙酮中的一種。
所述的打漿溶劑可選用甲醇、乙醇、異丙醇、丙酮中的一種。
本發(fā)明采用酶法合成安全環(huán)保可持續(xù),酶反應(yīng)生成率高,可到達(dá)95%以上,反應(yīng)液中磷脂酰絲氨酸濃度高達(dá)到100g/l。
seqidno:1
atggctccatctccaactccacatttggactccatcgagcaaaccctgagacaagtttccccaggattggaaggttccgtttgggaaagaacctccggtaacagactgggttcttctactccaggaggagcagattggttgttgcaaactccaggttgttggggagacgcagcttgtacagatagaccaggttccagaagactgctggataagatgagacaggacgttgcagcagctagagaaaccgttgacatctccactttggctccattcccaaacggaggttaccaagacgctatcgttgccggtttgaaggaatccgttcagaagggtaacagactgaaggtcagaatcatggtcggagcagctccagtttaccattctaccgttatcccatcctcctacagagacgagttgttggctaagttaggtccagcagcagcagcagatatcactttgaacgtcgcttccatgaccacctcaaagacctccttctcttggaaccactccaagctgatcgttgttgacggttcctccgttatcaccggaggtatcaactcttggaaggacgactacttggacactactcatccagttgccgacgttgatttggctttgtcaggaccagctgctggttcagcaggtagatacttggataccctttgggattggacttgcagaaacaagtcctcttggtcctccgtttggtttgcagcttctccaggagcagattgtatgccatctttgccaagaccagcttcaccagcaggaggaggagacgttcctgctttagcagttggaggtttgggagttggtatcagacagaacgatccagcttccgctttcagaccagttttgccaaccgctagagacactaagtgcggtatcggtttgccagatagaactaacgccgacagagactacgataccgttaacccagaggagtcagctttgagagctttggttgcaggagctacttcccacattgaaatttctcagcaagacatccacgctacttgtccaccattgccaagatacgacgtcagattgtacgacgctttggcagctaagttggtttccggtgtcaaggtcagaatcgttgtttccgacccagctaacagaggtactattggttccggaggttactcccagatcacttccttgaacgaggtttccgacgctttgagaggtagagttgcagcattgacaggagacggagctagagctagaacagctatgtgcgagaacttgcagttggctaccttcagagcttccgatagaccaacttgggctgacggtaaaccatacgctcaacatcacaagttggtctccgttgacggttcagctttctacatcggttccaagaacctgtacccatcttggttgcaggacttcggttacatcgtcgaatctccagcagcagcaggtcaattgaagtctgatttgcttgaccctcagtggagatactctcaagctacagctacctacgactacaccagaggactttgccaaggttag
seqidno:2
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