本發(fā)明涉及一種尖吻蝮蛇凝血酶重組蛋白的表達方法。

背景技術(shù)：

尖吻蝮蛇凝血酶(haemocoagulaseacutus，簡寫為halase)是本團隊研發(fā)的一類止血新藥，是一種從尖吻蝮蛇(agkistrodonacutus)蛇毒中分離純化的類凝血酶，具有較強的止血作用，且安全無毒。

目前，毒蛇的來源主要為人工飼養(yǎng)和野外捕捉兩種方式，各異的地理環(huán)境和飼養(yǎng)條件等因素，使得蛇毒的成分和性質(zhì)都存在著很大的差異，為規(guī)?；a(chǎn)造成一定的難度，產(chǎn)品的均一性受到限制。隨著生物工程技術(shù)的發(fā)展，開發(fā)蛇毒類凝血酶(snakevenomthrombin-likeenzymes,svtles)重組蛋白產(chǎn)品替代這類天然產(chǎn)物成為了svtles藥物研發(fā)的一個重要方向，以期通過蛋白質(zhì)工程的手段，穩(wěn)定表達具有良好生理活性的svtles產(chǎn)品。

對于svtles重組蛋白表達體系的構(gòu)建，最早是通過原核表達系統(tǒng)進行的。雖然svtles的糖基化修飾情況不盡相同，但是大部分svtles都是糖蛋白，含量在0％-30％間，個別種類甚至高達40％以上。而常用的細菌表達株并不具備糖基化的能力，這將大大影響到蛋白的活性。而且大腸桿菌的表達多以包涵體形式存在，研究人員通常需要添加硫氧還原蛋白(thioredoxin,trxr)標簽來增加外源蛋白的可溶性表達。真核表達系統(tǒng)中，較為成熟的酵母表達體系也被用作svtles的重組蛋白表達。然而酵母表達體系對于外源蛋白的表達可能存在過度的糖基化修飾，或者缺乏復(fù)雜性糖鏈的修飾，這些也會影響重組蛋白的功能。

哺乳動物細胞表達體系因具有更高級的糖基化機制，逐漸成為了異源糖蛋白表達的重要體系。在哺乳動物細胞表達體系中，cho細胞已經(jīng)成為了生物制藥領(lǐng)域最重要的表達系統(tǒng)，無血清懸浮培養(yǎng)技術(shù)的發(fā)展極大改善了傳統(tǒng)哺乳動物細胞表達系統(tǒng)易受病毒感染、自動化水平低的局限性，更加適合工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)。所以其應(yīng)用得到不斷拓展，被廣泛應(yīng)用于抗體、疫苗、重組蛋白藥物等生物醫(yī)藥制品的研發(fā)。美國食品藥品監(jiān)督管理局在2010年批準了cho表達蛋白直接入藥。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

為解決上述技術(shù)問題：本申請?zhí)岢鲆环N尖吻蝮蛇凝血酶重組蛋白的表達方法，首次利用cho細胞通過無血清懸浮培養(yǎng)技術(shù)表達一種尖吻蝮蛇凝血酶重組蛋白，包括如下步驟：

(1)優(yōu)化尖吻蝮蛇凝血酶基因；

(2)pcr擴增優(yōu)化的尖吻蝮蛇凝血酶基因；

(3)構(gòu)建表達載體；

(4)將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至cho細胞；

(5)重組蛋白表達鑒定。

其中，步驟(3)表達載體的構(gòu)建方法具體為：將回收的pcr產(chǎn)物與pmcx克隆載體酶切連接，構(gòu)建agkis-pmcx質(zhì)粒，將agkis-pmcx質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細胞中擴增，經(jīng)amp抗性篩選出陽性克隆，進行測序；提取測序正確的重組質(zhì)粒。

所述pcr產(chǎn)物與pmcx克隆載體酶切連接方法優(yōu)選方法為：對擴增后的尖吻蝮蛇凝血酶基因進行內(nèi)切酶消化，使用t4連接酶把基因目的片段連接到表達載體上。

步驟(4)將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至cho細胞的具體方法為：取細胞適量離心,用新鮮溶液重懸，使細胞終密度為5mioc/ml；離心時，將質(zhì)粒dna與pei預(yù)混，室溫孵育；處理好的dna&pei混合物，加入到準備的細胞中，混勻，31℃培養(yǎng)；轉(zhuǎn)染，加入適量的dmso，搖晃混勻，31℃培養(yǎng)；轉(zhuǎn)染后取樣品進行檢測；其中包含蛋白質(zhì)基因全長的重組質(zhì)粒單獨轉(zhuǎn)染，含a亞基基因序列和b亞基基因序列的重組質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染至cho細胞。

所述步驟(1)的具體方法包括以下步驟：

1)根據(jù)哺乳動物的編碼偏好對尖吻蝮蛇凝血酶基因序列進行優(yōu)化；

2)根據(jù)合成的尖吻蝮蛇凝血酶基因設(shè)計上游引物和下游引物，引物中引入了notⅰ和bamhⅰ兩個酶切位點，另外還添加了一段分泌性信號肽序列；

3)該基因包含了蛋白質(zhì)的a亞基和b亞基兩個亞基序列，通過對上下游引物的調(diào)整，可分別擴增出蛋白質(zhì)基因序列全長、a亞基基因序列和b亞基基因序列。

相對于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明是首次利用無血清懸浮式培養(yǎng)的cho細胞表達一種重組尖吻蝮蛇凝血酶，運用生物工程手段，較成功地解決了蛇毒產(chǎn)品原料來源不足、質(zhì)量不穩(wěn)定的實際生產(chǎn)問題。

附圖說明

圖1為本發(fā)明實施例優(yōu)化重組尖吻蝮蛇凝血酶基因序列的示意圖。

圖2為本發(fā)明實施例重組尖吻蝮蛇凝血酶sds-page電泳示意圖。

圖3為本發(fā)明實施例重組尖吻蝮蛇凝血酶westernblot的示意圖

具體實施方式

下面結(jié)合具體的實施例對本發(fā)明做進一步的說明。

實施例：尖吻蝮蛇凝血酶重組蛋白表達的操作方法

1.實驗材料

1.1實驗儀器

pcr儀：bio-rad公司；電泳儀：北京君意東方電泳設(shè)備有限公司；凝膠成像系統(tǒng)：珠海黑馬醫(yī)學(xué)儀器有限公司；切膠儀：杭州米歐儀器有限公司；恒溫混勻儀：杭州米歐儀器有限公司；超微量紫外可見分光光度計：美國quawell公司0；2-8度冷藏箱：中科美菱低溫科技有限責(zé)任公司；-20度醫(yī)用低溫箱：中科美菱低溫科技有限責(zé)任公司；三孔電熱恒溫水槽：上海恒一科學(xué)儀器有限公司；細菌培養(yǎng)箱：上海恒一科學(xué)儀器有限公司；臥式全溫振蕩培養(yǎng)箱：上海知楚儀器有限公司；細胞培養(yǎng)搖床：adolfkuhner公司；超聲波細胞粉碎機：寧波新芝生物科技股份有限公司；磁力攪拌器：wiggens公司；ph計：奧豪斯儀器(上海)有限公司；雙人凈化工作臺：上海蘇凈實業(yè)有限公司；轉(zhuǎn)印系統(tǒng)：bio-rad公司；垂直電泳系統(tǒng)：bio-rad公司；脫色搖床：上海天能科技有限公司；高壓滅菌鍋：上海申安醫(yī)療器械廠。

1.2實驗試劑

表達載體pmcx、大腸桿菌dh5α、chodg44細胞均由廣州漢騰生物科技有限公司制備、提供。koddna聚合酶：東洋紡(上海)生物科技有限公司；t4dna連接酶：近岸蛋白質(zhì)科技有限公司；限制性內(nèi)切酶not?。簍hermofisherscientific公司；限制性內(nèi)切酶bamh?。簍hermofisherscientific公司；質(zhì)粒提取試劑盒：美國omega公司；dna瓊脂糖凝膠回收試劑盒：美國omega公司；dnamarker：thermofisherscientific公司；cho培養(yǎng)液：lonza公司；dmso：天津市化學(xué)試劑一廠；pei：sigmaaldrich公司；臺盼藍染液：sigmaaldrich公司；特異性多克隆抗體：cloud-clone公司；兔源igg抗體：proteintech公司；氨芐青霉素：生工生物科技有限公司；瓊脂粉：廣東環(huán)凱生物科技有限公司；酵母浸粉：oxoid公司；蛋白胨：oxoid公司。

2.實驗方法

2.1基因擴增

通過jcat(javacodonadaptationtool)把尖吻蝮蛇凝血酶的蛋白質(zhì)序列翻譯成dna序列，并根據(jù)哺乳動物的編碼偏好對序列進行了優(yōu)化，優(yōu)化后的基因序列見下圖1，該基因序列由廣州艾基生物技術(shù)有限公司合成。

根據(jù)合成的尖吻蝮蛇凝血酶基因設(shè)計上游引物和下游引物，引物中引入了notⅰ和bamhⅰ兩個酶切位點，另外還添加了一段分泌性信號肽序列，見表1。

表1重組尖吻蝮蛇凝血酶的pcr引物

該基因序列包含了蛋白質(zhì)的兩個亞基(a和b)序列，通過對上下游引物的調(diào)整，可分別擴增出蛋白質(zhì)基因序列全長、a亞基基因序列和b亞基基因序列。對合成基因進行pcr擴增，pcr產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳回收。

對擴增后的尖吻蝮蛇凝血酶基因進行內(nèi)切酶消化，使用t4連接酶把基因目的片段連接到表達載體上。選用氨芐青霉素(ampicillin,amp)作為篩選抗生素。

2.2表達載體構(gòu)建

將回收的pcr產(chǎn)物與pmcx克隆載體酶切連接，構(gòu)建agkis-pmcx質(zhì)粒。將agkis-pmcx質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細胞中擴增，經(jīng)amp抗性篩選出陽性克隆，送廣州艾基生物技術(shù)有限公司測序。提取測序正確的重組質(zhì)粒，用作后續(xù)的cho細胞轉(zhuǎn)染試驗。

2.3cho細胞轉(zhuǎn)染

轉(zhuǎn)染當天，記錄細胞密度(mioc/ml)，取細胞適量離心,1300rpm，3min；用新鮮溶液(31℃，提前預(yù)熱)重懸，使細胞終密度為5mioc/ml。離心時，將質(zhì)粒dna與pei在干凈的離心管中預(yù)混，輕輕吹打，室溫孵育3-5min。處理好的dna&pei混合物，加入到準備的細胞中，搖晃混勻，31℃培養(yǎng)。轉(zhuǎn)然后10min，加入適量的dmso，搖晃混勻，31℃培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染后取樣品進行檢測。其中包含蛋白質(zhì)基因全長的重組質(zhì)粒單獨轉(zhuǎn)染，含a亞基基因序列和b亞基基因序列的重組質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染至cho細胞。

2.4蛋白表達鑒定

(1)制樣

取培養(yǎng)了數(shù)天的細胞80ul，1300rpm離心3min后，分別收集上清和細胞沉淀，吸取上清約80ul加入20ul的5×loadingbuffer混勻，細胞加入80ul1×pbs(ph7.5)的緩沖液重懸細胞后加入20μl(reduced)5×loadingbuffer混勻后，100℃煮樣8min，12000rpm離心1min待用/儲存于-20℃冰箱。

(2)sds-page

電泳第一塊膠：事先配置的12％濃度的聚丙烯酰胺凝膠，每孔上樣15μl，用80v電壓跑至樣品出濃縮膠后將電壓調(diào)為120v后電泳約90min。第二塊膠：事先配置的12％濃度的聚丙烯酰胺凝膠，每孔上樣15μl，用80v電壓跑至樣品出濃縮膠后將電壓調(diào)為120v后電泳約90min。如圖2所示，其中，m為蛋白marker；cell為細胞破碎液；sup為細胞培養(yǎng)上清液。

(3)westernblot

80ma轉(zhuǎn)膜40min，加入5％脫脂奶粉室溫封閉1h。特異性抗體按照1：5000的比例室溫孵育2h；tbst洗滌3次，每次5min；兔源抗igg抗體室溫孵育1h；pbst洗滌3次，每次5min；ecl顯色，曝光1min拍照。如圖3所示，其中，m為蛋白marker；cell為細胞破碎液；sup為細胞培養(yǎng)上清液。

3實驗結(jié)果

sds-page電泳圖顯示，含有hgfs、heavy、acti、light、ha+hb、la+hb這六種重組載體的細胞破碎液內(nèi)均檢測有與目標蛋白分子量相近的蛋白質(zhì)，而細胞培養(yǎng)上清液中則近乎沒有可見條帶。westernblot進一步的檢測鑒定顯示，除了hgfs之外，heavy、acti、light、ha+hb、la+hb這五種重組載體的細胞破碎液內(nèi)均檢測有目標蛋白的表達，分子量在32kda左右；而細胞培養(yǎng)上清液中沒有可見條帶。