本發(fā)明涉及一種基于常規(guī)pcr技術(shù)快速檢測煙粉虱體內(nèi)cardinium共生菌的引物及方法，屬于農(nóng)業(yè)生物技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

煙粉虱bemisiatabaci(gennadius)是一種世界性農(nóng)業(yè)害蟲，也是科技界有史以來唯一冠以“超級害蟲”稱謂的昆蟲。煙粉虱既通過吸取植物汁液直接為害宿主植物，又可以分泌蜜露而滋生煤污菌對宿主植物造成間接危害；更重要的是多數(shù)刺吸式昆蟲都是植物病毒傳播媒介，傳播植物病毒并引發(fā)植物病毒病是煙粉虱對農(nóng)作物的最主要危害方式。煙粉虱是一個(gè)包含多個(gè)隱種的復(fù)合種，其中b和q隱種是入侵性最強(qiáng)、分布最廣的兩種。2003年在云南昆明一品紅植株上首次發(fā)現(xiàn)q煙粉虱入侵中國后，在其他多數(shù)省份也陸續(xù)發(fā)現(xiàn)了q煙粉虱。目前，q煙粉虱已在全國范圍內(nèi)取代了b煙粉虱成為作物上煙粉虱優(yōu)勢種。

共生菌cardinium是q煙粉虱體內(nèi)一種重要次生內(nèi)共生菌，屬于擬桿菌門(bacteroidetes)鞘脂桿菌綱(sphingobacteria)，屈撓桿菌科(flexibacteraceae)。cardinium于2004年在恩蚜小蜂屬(encarsia)寄生蜂中首次報(bào)道，目前已發(fā)現(xiàn)在蛛形綱以及昆蟲綱的膜翅目和半翅目等類群中廣泛存在。cardinium對寄主的調(diào)控功能基本與wolbachia一致，能夠引起宿主的雌性化，誘導(dǎo)產(chǎn)雌孤雌生殖和誘導(dǎo)胞質(zhì)不親和等生殖異?，F(xiàn)象。此外，研究還表明cardinium能提高種群的繁殖率進(jìn)而提高其適合度。

共生菌cardinium的傳播方式主要是通過雌蟲產(chǎn)卵垂直傳給下一代。目前使用傳統(tǒng)的cardinium檢測方法檢測已知感染cardinium煙粉虱，即提取單頭煙粉虱dna，以dna為模板，利用cardinium的16srrna基因進(jìn)行常規(guī)pcr擴(kuò)增(尹祥杰，孫秀新，muhammadzahmed，任順祥，邱寶利.2015.南方部分地區(qū)煙粉虱及其寄生蜂內(nèi)共生菌cardinium的檢測及其系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，應(yīng)用昆蟲學(xué)報(bào)，52(4)：1014-1022.)，發(fā)現(xiàn)在已知感染cardinium的煙粉虱種群中cardinium檢測率僅有30％左右。使用現(xiàn)有常用引物(card-f：5’-acgggaggcagcagta-3’；card-r：5’-ccgcagggattgtttt-3’)檢測已確定感染cardinium煙粉虱種群發(fā)現(xiàn)，該引物對煙粉虱體內(nèi)cardinium具有非特異性擴(kuò)增現(xiàn)象。另外，雖然利用熒光定量pcr與常規(guī)pcr相結(jié)合的方法能夠在煙粉虱體內(nèi)全部檢出cardinium(張文平，劉佰明，張珊，萬方浩，褚棟.2015.基于epg技術(shù)的煙粉虱兩個(gè)品系取食行為的比較，中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，2016，49(13)：2544-2552.)，但操作步驟繁瑣且耗時(shí)耗力。

綜上所述，目前對q煙粉虱體內(nèi)共生菌cardinium的檢測存在著檢出率低或者操作步驟繁瑣且浪費(fèi)人力、物力、財(cái)力的不足。因此，目前急需一種快速高效檢測q煙粉虱體內(nèi)cardinium共生菌的引物及方法。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種快速有效的檢測q煙粉虱體內(nèi)共生菌cardinium的引物及方法。

本發(fā)明技術(shù)方案如下：

一種快速檢測q煙粉虱體內(nèi)共生菌cardinium的基因片段，核苷酸序列如seqidno.3所示。

一種快速檢測q煙粉虱體內(nèi)共生菌cardinium的引物，所述引物為一對，上游引物核苷酸序列如seqidno.1所示，下游引物核苷酸序列如seqno.2所示。

上游引物ceper1-f：5’-ttcaaagcagaggtgccaaa-3’；seqidno.1

下游引物ceper1-r：5’-caaaatagtagaagcacagccaatc-3’；seqidno.2

一種快速檢測煙粉虱體內(nèi)cardinium共生菌的方法，步驟如下：

(1)提取q煙粉虱基因組dna，制得基因組dna溶液；

(2)以步驟(1)制得的基因組dna為模板，利用上述的引物對基因組dna進(jìn)行pcr擴(kuò)增，制得pcr擴(kuò)增產(chǎn)物；

(3)對步驟(2)制得的pcr擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分析，使用2％瓊脂糖凝膠電泳結(jié)束后在紫外凝膠成像儀上成像，當(dāng)pcr擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖譜顯示被測樣品有147bp的一條條帶時(shí)，則該被檢測樣品為cardinium感染q煙粉虱；當(dāng)pcr擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖譜顯示被測樣品無條帶時(shí)，則為cardinium未感染q煙粉虱。

優(yōu)選的，所述步驟(2)中pcr擴(kuò)增的擴(kuò)增體系為：

基因組dna溶液2μl，10μm引物0.26μl，5u/μltaq酶0.13μl，10×taqbuffer(緩沖液)1.3μl，10mmdntp0.26μl，ddh2o補(bǔ)至13μl；

優(yōu)選的，所述步驟(2)中pcr擴(kuò)增的擴(kuò)增條件如下：

94℃預(yù)變性3分鐘；94℃變性30秒，64℃退火30秒，72℃延伸30秒，進(jìn)行35個(gè)循環(huán)；72℃延伸3分鐘。

上述步驟(1)中提取q煙粉虱基因組dna和步驟(3)中瓊脂糖凝膠電泳分析均按本領(lǐng)域常規(guī)技術(shù)操作。上述實(shí)驗(yàn)步驟如無特別說明均可參見《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》第三版(北京：科學(xué)出版社，2002)。

有益效果

1、本發(fā)明根據(jù)共生菌cardinium的基因組中的ceper1基因片段設(shè)計(jì)引物。該基因片段具有物種特異性，通過對該片段設(shè)計(jì)特異引物，可以顯助提高檢測的準(zhǔn)確性，并且減少了操作步驟，降低了檢測成本，大大提高了cardinium在q煙粉虱體內(nèi)的檢測效率；

2、本發(fā)明從分子水平探索建立了q煙粉虱體內(nèi)共生菌cardinium的檢測技術(shù)，為今后q煙粉虱與共生菌cardinium的互作機(jī)制研究奠定了基礎(chǔ)。

附圖說明

圖1、實(shí)施例1中pcr產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖；

圖中：a、已知cardinium感染q煙粉虱種群，b、已知cardinium未感染q煙粉虱種群，m、dl2000dnamarker；

圖2、實(shí)施例2中pcr產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖；

圖中：a、山東省棗莊地區(qū)q煙粉虱種群，b、山東省濟(jì)南地區(qū)q煙粉虱種群，m、dl2000dnamarker；

圖3、實(shí)施例3中海南省陵水黎族自治縣q煙粉虱pcr產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖；

圖中：m、dl2000dnamarker，+、陽性對照，-、陰性對照；

圖4、對比例1擴(kuò)增已知感染cardinium的q煙粉虱瓊脂糖凝膠電泳圖；

圖中：a、已知cardinium感染q煙粉虱種群，b、已知cardinium未感染q煙粉虱種群，m、dl2000dnamarker；

圖5、對比例2擴(kuò)增已知感染cardinium的q煙粉虱瓊脂糖凝膠電泳圖；

圖中：a、已知cardinium感染q煙粉虱種群，b、已知cardinium未感染q煙粉虱種群，m、dl2000dnamarker。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合實(shí)施例及說明書附圖對本發(fā)明的技術(shù)方案做進(jìn)一步的闡述，但本發(fā)明所保護(hù)范圍不限于此。

生物樣品

實(shí)施例1、對比例1和對比例2中的已知cardinium感染與未感染q煙粉虱種群是根據(jù)青島農(nóng)業(yè)大學(xué)入侵生物實(shí)驗(yàn)室長期飼養(yǎng)種群，按照(張文平，劉佰明，張珊，萬方浩，褚棟.2015.基于epg技術(shù)的煙粉虱兩個(gè)品系取食行為的比較，中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，2016，49(13)：2544-2552.)中所記載方法建立種群；

實(shí)施例2中所述q煙粉虱于2015年采集于山東省棗莊市、濟(jì)南市。

實(shí)施例3中所述q煙粉虱于2016年采集于海南省陵水黎族自治縣。

實(shí)施例1

一種快速檢測q煙粉虱體內(nèi)共生菌cardinium的方法，步驟如下：

(1)將待檢測的單頭q煙粉虱置于含30μl堿裂解液0.2ml的離心管中，堿裂解液為：50mmol·l^-1tris-hcl(ph8.0)、20mmol·l^-1nacl、1mmol·l^-1edta(乙二胺四乙酸)、1％sds(十二烷基硫酸鈉)，用封口槍頭充分研磨勻漿后置于pcr儀(65℃15min，95℃10min)后，制得基因組dna溶液；

(2)以步驟(1)制得的基因組dna溶液為模板進(jìn)行pcr擴(kuò)增，制得pcr擴(kuò)增產(chǎn)物；

所述pcr擴(kuò)增的引物核苷酸序列如下：

上游引物ceper1-f：5’-ttcaaagcagaggtgccaaa-3’；seqidno.1

下游引物ceper1-r：5’-caaaatagtagaagcacagccaatc-3’；seqidno.2

所述pcr擴(kuò)增的體系如下：

q煙粉虱基因組dna溶液2μl；10μm引物0.26μl；5u/μltaq酶0.13μl；10×taqbuffer1.3μl；10mmdntp0.26μl；ddh20補(bǔ)至13μl；

所述pcr擴(kuò)增的程序如下：

94℃預(yù)變性3分鐘；94℃變性30秒，64℃退火30秒，72℃延伸30秒，進(jìn)行35個(gè)循環(huán)；72℃延伸3分鐘。

(3)用質(zhì)量百分比為2.0％的瓊脂糖凝膠電泳對步驟(2)制得的pcr擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測。

通過對已知cardinium感染與未感染q煙粉虱種群進(jìn)行上述檢測，cardinium感染q煙粉虱在成像膠片上均有一條片段長度147bp左右的條帶，經(jīng)檢測，序列如seqidno.3所示；cardinium未感染q煙粉虱在成像膠片上均無條帶，結(jié)果如圖1所示。

對比例1

如實(shí)施例1中檢測q煙粉虱體內(nèi)共生菌cardinium的方法，不同之處在于，所述引物為cfb-f：5’-gcggtgtaaaatgagcgtg-3’和cfb-r

5’-acctmttcttaactcaagcct-3’。(尹祥杰，孫秀新，muhammadzahmed，任順祥，邱寶利.2015.南方部分地區(qū)煙粉虱及其寄生蜂內(nèi)共生菌cardinium的檢測及其系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，應(yīng)用昆蟲學(xué)報(bào)，52(4)：1014-1022.)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在已知感染cardinium的煙粉虱種群中cardinium檢測率僅有30％左右(圖3)。

對比例2

如實(shí)施例1中檢測q煙粉虱體內(nèi)共生菌cardinium的方法，不同之處在于，所述引物為card-f：5’-acgggaggcagcagta-3’和card-r：5’-ccgcagggattgtttt-3’，檢測已確定感染cardinium煙粉虱種群發(fā)現(xiàn)，該引物對煙粉虱體內(nèi)cardinium具有非特異性擴(kuò)增現(xiàn)象(圖4)。

實(shí)施例2

如實(shí)施例1中檢測q煙粉虱體內(nèi)共生菌cardinium的方法，不同之處在于，所述q煙粉虱于2015年采集于山東省棗莊市、濟(jì)南市。

結(jié)果如圖2顯示，成像膠片上共有4條大約在147bp左右的條帶均采自于棗莊地區(qū)，表明在該地區(qū)隨機(jī)挑取的10頭q煙粉虱中共檢測到4頭感染cardinium煙粉虱；濟(jì)南地區(qū)隨機(jī)選取的10頭q煙粉虱中沒有檢測到感染cardinium煙粉虱。

實(shí)施例3

如實(shí)施例1中檢測q煙粉虱體內(nèi)共生菌cardinium的方法，不同之處在于，所述q煙粉虱于2017年采集于海南省陵水黎族自治縣。

結(jié)果如圖2顯示，成像膠片上共有5條大約在147bp左右的條帶均采自于陵水地區(qū)，表明在該地區(qū)隨機(jī)挑取的10頭q煙粉虱中共檢測到5頭感染cardinium煙粉虱。

以上結(jié)果表明本發(fā)明所述引物及方法能夠用來進(jìn)行田間采集煙粉虱種群中cardinium的檢測。

結(jié)果分析

通過以上實(shí)施例1和對比例1-2的結(jié)果可以看出，采用對比例1的檢測方法，在已知感染cardinium的煙粉虱種群中cardinium檢測率僅有30％左右。采用對比例2的檢測方法檢測已確定感染cardinium煙粉虱種群發(fā)現(xiàn)，該引物對煙粉虱體內(nèi)cardinium具有非特異性擴(kuò)增現(xiàn)象。而實(shí)施例1的檢測結(jié)果與實(shí)際結(jié)果完全吻合，并且檢測結(jié)果清晰可辨。為今后q煙粉虱與共生菌cardinium的互作機(jī)制研究奠定了基礎(chǔ)。

上述實(shí)施例僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例，并非用來限定本發(fā)明的實(shí)施范圍。即凡依本發(fā)明內(nèi)容所作的均等變化與修飾，都為本發(fā)明權(quán)利要求所要求保護(hù)的范圍所涵蓋。

sequencelisting

<110>青島農(nóng)業(yè)大學(xué)

<120>一種快速檢測q煙粉虱體內(nèi)共生菌cardinium的引物及方法

<160>3

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>20

<212>dna

<213>人工合成

<400>1

ttcaaagcagaggtgccaaa20

<210>2

<211>25

<212>dna

<213>人工合成

<400>2

caaaatagtagaagcacagccaatc25

<210>3

<211>147

<212>dna

<213>cardinium

<400>3

ttcaaagcagaggtgccaaacgcttggtgtaaccaaactgcaatcttcaatattgctgct60

gcttgcaaagaagacaacactaagctgagtagtgccactgttaccattggaaaaatgaca120

acgattggctgtgcttctactattttg147