本發(fā)明涉及一種微管蛋白(tubulin)探針，具體地說是一種具有微管蛋白識(shí)別功能的銥配合物及其制備方法和用途。

背景技術(shù)：

微管作為所有真核細(xì)胞的細(xì)胞骨架的主要組成部分，它是由微管蛋白和微管結(jié)合蛋白組成，而微管蛋白是由α-微管蛋白和β-微管蛋白連接在一起形成的二聚體。微管蛋白作為一種動(dòng)態(tài)的細(xì)胞骨架蛋白，它的裝配動(dòng)態(tài)性使其在細(xì)胞分裂中具有獨(dú)特作用。特別是在細(xì)胞有絲分裂時(shí)期，在中心體的調(diào)控下，微管能進(jìn)一步聚合形成紡錘體，并引導(dǎo)細(xì)胞從中期到后期的分化。由于微管網(wǎng)的重組是細(xì)胞生命周期和細(xì)胞分裂功能的必需過程，所以微管蛋白的含量異常和正常排列、聚合的破壞都與細(xì)胞的癌變有關(guān)。已報(bào)道靶向微管蛋白的熒光探針多為有機(jī)小分子化合物，而有機(jī)小分子斯托克位移和熒光壽命都較短，易受細(xì)胞內(nèi)自發(fā)熒光的影響。因此，設(shè)計(jì)合成大斯托克位移和長(zhǎng)熒光壽命的微管蛋白探針對(duì)于進(jìn)一步探究微管與癌癥之間的關(guān)系具有重要意義。

近幾十年來，金屬有機(jī)配合物由于其較長(zhǎng)的熒光壽命和斯托克位移在活細(xì)胞顯微成像方面的應(yīng)用越來越廣泛，相繼報(bào)道了具有特異性靶向的金屬有機(jī)配合物熒光探針，例如，具有脂質(zhì)體靶向功能的配合物探針[accountsofchemicalresearch,2015,48,2985]、具有dna靶向[naturechemistry,2009,1,662]和具有bsa靶向功能的配合物探針[chemistry-aeuropeanjournal2009,15,3652]。但到目前為止，靶向微管蛋白的三線態(tài)發(fā)光銥配合物探針尚未見報(bào)道。

申請(qǐng)人對(duì)本申請(qǐng)的主題進(jìn)行了如下的文獻(xiàn)檢索：

1、xueshu.glgoo.com網(wǎng)檢索結(jié)果：(2017/07/05)

2、中國(guó)知網(wǎng)檢索結(jié)果：

檢索方式一：

篇名-具有微管蛋白識(shí)別功能的銥配合物：無相關(guān)文獻(xiàn)。

篇名-一種具有微管蛋白識(shí)別功能的銥配合物及其制備方法：無相關(guān)文獻(xiàn)。

檢索方式二：

全文-具有微管蛋白識(shí)別功能的銥配合物：無相關(guān)文獻(xiàn)。

全文-一種具有微管蛋白識(shí)別功能的銥配合物及其制備方法：無相關(guān)文獻(xiàn)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明旨在提供一種具有微管蛋白識(shí)別功能的銥配合物及其制備方法和用途。本發(fā)明選擇苯并噻唑衍生物作為主配體調(diào)節(jié)配合物發(fā)光，通過引入鄰菲羅啉擴(kuò)大配合物的共軛體系，設(shè)計(jì)合成了銥配合物ir-tb。研究發(fā)現(xiàn)，配合物具有較大的斯托克位移和長(zhǎng)的熒光壽命，且目標(biāo)分子ir-tb能夠靶向活細(xì)胞內(nèi)微管蛋白，通過標(biāo)記微管結(jié)構(gòu)觀察細(xì)胞有絲分裂不同時(shí)期，該化合物在生命科學(xué)研究領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。

苯并噻唑與長(zhǎng)春花堿(一種已知的微管蛋白探針)結(jié)構(gòu)相似，可以通過功能化苯并噻唑末端基團(tuán)，增加化合物與微管蛋白相互作用(氫鍵、π-π堆積作用等)的結(jié)合位點(diǎn)，提高化合物靶向微管蛋白的專一性。

本發(fā)明具有微管蛋白識(shí)別功能的銥配合物(ir-tb)的結(jié)構(gòu)式為：

本發(fā)明具有微管蛋白識(shí)別功能的銥配合物的制備方法，包括如下步驟：

步驟1：中間體m的合成

通n2氣保護(hù)下，將配體l0.60g(2.2mmol)溶于20ml乙二醇單乙醚和蒸餾水混合溶劑(3:1,v/v)中，待溶解后加入到錫箔紙包裹的100ml史萊克瓶，再加入溶解于10ml水的三水合氯化銥溶液0.33g(1.0mmol)，110℃下回流反應(yīng)24h；反應(yīng)結(jié)束后冷卻至室溫，過濾并用少量蒸餾水洗滌沉淀，真空干燥箱中干燥12h，得到橙色固體粉末，即為中間體m。

配體l的合成參照文獻(xiàn)方法(bioorganic&medicinalchemistryletters,2011,21(8),2445-2449)。

步驟2：目標(biāo)產(chǎn)物ir-tb的合成

錫箔紙包裹100ml史萊克反應(yīng)瓶，通n2氣保護(hù)下，稱取中間體m0.68g(0.50mmol)和鄰菲羅啉0.36g(2mmol)溶于50ml二氯甲烷和甲醇混合溶劑(1:1,v/v)中，然后在70℃下反應(yīng)24h；反應(yīng)結(jié)束后冷卻到室溫，加入過量六氟磷酸銨0.10g(0.50mmol)，常溫?cái)嚢?2h，得到紅色溶液，加熱蒸去大部分溶劑，抽濾，得到紅色粗產(chǎn)物1.80g，柱層析分離(洗脫液為二氯甲烷和甲醇按體積比100:1混合得到)后得到橙紅色固體0.81g，即為目標(biāo)產(chǎn)物ir-tb,收率76.20％。

本發(fā)明銥配合物的合成路線如下：

本發(fā)明具有微管蛋白識(shí)別功能的銥配合物的用途，是作為識(shí)別活細(xì)胞內(nèi)微管蛋白的熒光探針的應(yīng)用。

本發(fā)明ir-tb的生物學(xué)研究如下：

將肝癌細(xì)胞(hepg2)種在激光共聚焦小皿上，每個(gè)孔接種10⁴個(gè)細(xì)胞，用1.5ml的培養(yǎng)基培養(yǎng)24-36h。ir-tb配成10^-3m的母液，向培養(yǎng)基中加入15μl的ir-tb母液，在細(xì)胞培養(yǎng)箱中染色30min，用pbs洗三遍，可直接用于顯影。

本發(fā)明的有益效果體現(xiàn)在：

1、本發(fā)明ir-tb的原料廉價(jià)易得，合成簡(jiǎn)單高效，使其商業(yè)化成為可能。

2、本發(fā)明ir-tb的毒性低(圖2)，具有良好的生物相容性，便于應(yīng)用于生物體。

3、本發(fā)明ir-tb可特異性識(shí)別細(xì)胞內(nèi)的微管蛋白(圖4)，ir-tb與tubulin-免疫熒光蛋白(tb-ab)在細(xì)胞內(nèi)共定位效果好，皮爾森系數(shù)可達(dá)到89.72％。

4、本發(fā)明ir-tb能通過標(biāo)記微管蛋白，觀察細(xì)胞不同有絲分裂時(shí)期紡錘絲、紡錘體的結(jié)構(gòu)變化，從而判斷細(xì)胞的分裂時(shí)期(圖5)。

5、本發(fā)明ir-tb不僅可以作為靶向活細(xì)胞微管蛋白探針，還能夠用于組織顯影(圖6)。不存在類似可利用的商業(yè)生物熒光探針，具有較高的商業(yè)價(jià)值。

附圖說明

圖1是ir-tb的單晶橢球圖(略去陰離子和h原子)，表明合成的銥配合物是尚未見報(bào)道且結(jié)構(gòu)明確的新物質(zhì)。

圖2是不同濃度下的配合物ir-tb與肝癌細(xì)胞培養(yǎng)24h后的細(xì)胞毒性測(cè)試，說明ir-tb的細(xì)胞毒性低，具有良好的生物相容性。

圖3(a)是本發(fā)明ir-tb、商染dapi和tubulin-免疫熒光蛋白tb-ab在活細(xì)胞內(nèi)的共定位顯影圖，從圖中可以看出ir-tb與tb-ab的染色重合率較高，而ir-tb與細(xì)胞核染料dapi的染色重合率較低；(b)是ir-tb與tubulin-免疫熒光蛋白tb-ab共定位相關(guān)系數(shù)圖，皮爾森系數(shù)高達(dá)0.8972，說明ir-tb能夠靶向活細(xì)胞內(nèi)的微管蛋白。

圖4是利用細(xì)胞在不同分裂期，觀察ir-tb和核商染在各個(gè)分裂期的染色情況：(a)前期、(b)前中期、(c)中期、(d)末期。說明ir-tb能夠作為標(biāo)記紡錘體和紡錘絲內(nèi)微管蛋白的特征探針，可用于觀察處于有絲分裂各個(gè)時(shí)期的細(xì)胞。

圖5是本發(fā)明ir-tb、商染dapi和tubulin-免疫熒光蛋白tb-ab在活體腎臟組織內(nèi)的共定位顯影圖，說明ir-tb不僅可以作為細(xì)胞靶向微管蛋白探針，還能夠用于組織顯影。

具體實(shí)施方式

本發(fā)明具有微管蛋白識(shí)別功能的銥配合物(ir-tb)的結(jié)構(gòu)式為：

本發(fā)明具有微管蛋白識(shí)別功能的銥配合物的制備方法，包括如下步驟：

步驟1：中間體m的合成

通n2氣保護(hù)下，將配體l0.60g(2.2mmol)溶于20ml乙二醇單乙醚和蒸餾水混合溶劑(3:1,v/v)中，待溶解后加入到錫箔紙包裹的100ml史萊克瓶，再加入溶解于10ml水的三水合氯化銥溶液0.33g(1.0mmol)，110℃下回流反應(yīng)24h；反應(yīng)結(jié)束后冷卻至室溫，過濾并用少量蒸餾水洗滌沉淀，真空干燥箱中干燥12h，得到橙色固體粉末，即為中間體m。

配體l的合成參照文獻(xiàn)方法(bioorganic&medicinalchemistryletters,2011,21(8),2445-2449)。

步驟2：目標(biāo)產(chǎn)物ir-tb的合成

錫箔紙包裹100ml史萊克反應(yīng)瓶，通n2氣保護(hù)下，稱取中間體m0.68g(0.50mmol)和鄰菲羅啉0.36g(2mmol)溶于50ml二氯甲烷和甲醇混合溶劑(1:1,v/v)中，然后在70℃下反應(yīng)24h；反應(yīng)結(jié)束后冷卻到室溫，加入過量六氟磷酸銨0.10g(0.50mmol)，常溫?cái)嚢?2h，得到紅色溶液，加熱蒸去大部分溶劑，抽濾，得到紅色粗產(chǎn)物1.80g，柱層析分離(洗脫液為二氯甲烷和甲醇按體積比100:1混合得到)后得到橙紅色固體0.81g，即為目標(biāo)產(chǎn)物ir-tb,收率76.20％。

¹hnmr(400mhz,dmso-d6),δ(ppm):9.52(s,2h),8.92(d,j＝8.3hz,2h),8.49(d,j＝5.1hz,2h),8.32(s,2h),8.14(dd,j＝8.2,5.1hz,2h),8.04(d,j＝8.1hz,2h),7.52(s,2h),7.17(t,j＝7.7hz,2h),6.82(t,j＝7.9hz,2h),5.89(s,2h),5.60(d,j＝8.4hz,2h),4.17(m,4h),1.36(t,j＝6.9hz,6h)；¹³cnmr(100mhz,dmso-d6)δ(ppm):180.41,151.34,151.15,148.78,146.92,144.43,143.71,139.16,130.60,130.50,130.19,128.26,127.30,124.68,124.01,119.37,115.42,111.98,64.24,14.83；ir(kbr,cm^-1):3053.63(w),2359.43(w),2341.56(w),1602.77(s),1519.55(s),1480.79(s),1434.58(s),1408.33(m),1314.93(m),1227.40(s),1155.98(s),1097.13(m),967.47(s),835.99(s),807.76(m),755.37(s),728.819(s),696.45(m),622.35(s),550.68(m),522.19(m),498.99(m)；esi-ms:cal.913.13,found913.33.

本發(fā)明銥配合物的合成路線如下：

本發(fā)明ir-tb的生物學(xué)研究如下：

將肝癌細(xì)胞(hepg2)種在激光共聚焦小皿上，每個(gè)孔接種10⁴個(gè)細(xì)胞，用1.5ml的培養(yǎng)基培養(yǎng)24-36h。ir-tb配成10^-3m的母液，向培養(yǎng)基中加入15μl的ir-tb母液，在細(xì)胞培養(yǎng)箱中染色30min，用pbs洗三遍，可直接用于顯影。