本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及一種抗原特異性t細(xì)胞及其制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

近年來，自體免疫細(xì)胞治療腫瘤成為繼手術(shù)、放療、化療后最有前景的腫瘤治療方法。dc細(xì)胞(dendriticcell，樹突狀細(xì)胞)是人體已知的最重要的抗原呈遞細(xì)胞，在介導(dǎo)腫瘤抗原特異性細(xì)胞免疫及腫瘤免疫應(yīng)答方面所起的作用成為人們研究之熱點(diǎn)。dc細(xì)胞介導(dǎo)的腫瘤特異性抗原呈遞及t細(xì)胞免疫應(yīng)答，既是腫瘤發(fā)病早期機(jī)體對(duì)抗腫瘤的有效手段，也是腫瘤發(fā)生免疫逃逸的重要機(jī)制。

在體內(nèi)dc細(xì)胞與t細(xì)胞(thymus-dependentlymphocyte，胸腺依賴性淋巴細(xì)胞)進(jìn)行抗原傳遞的過程中有一個(gè)關(guān)鍵的步驟：形成免疫突觸(immunologicsynapse，is)結(jié)構(gòu)。免疫突觸的結(jié)構(gòu)請(qǐng)參閱圖1，具體形成過程如下：大量t細(xì)胞游走于淋巴結(jié)等淋巴器官，當(dāng)t細(xì)胞遇到dc細(xì)胞時(shí)其運(yùn)動(dòng)速度減低并被dc細(xì)胞捕獲，接受外源信號(hào)后t細(xì)胞發(fā)生極化反應(yīng)，t細(xì)胞產(chǎn)生偽足，并形成適合分子信號(hào)傳遞的三維空間結(jié)構(gòu)。細(xì)胞質(zhì)內(nèi)以微管組織中心(microtubuleorganizationcenter,mtoc)移動(dòng)到靠近dc細(xì)胞的一側(cè)邊緣為基本特征的一系列細(xì)胞器重組變化發(fā)生，其表面粘附分子通過受體－配體相互作用得以緊密接觸dc細(xì)胞，形成了一個(gè)臨時(shí)性結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)以tcr-mhc-抗原肽三元結(jié)構(gòu)為簇狀中心，周圍環(huán)形分布著粘附分子，該結(jié)構(gòu)即為免疫突觸(immunologicsynapse，is)結(jié)構(gòu)。

然而，目前體外培養(yǎng)的dc細(xì)胞-t細(xì)胞之間存在抗原呈遞效率不高，t細(xì)胞特異性免疫應(yīng)答效果不理想等缺陷。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

基于此，有必要提供一種能夠制備特異性免疫應(yīng)答效果好的抗原特異性t細(xì)胞及其應(yīng)用。

一種抗原特異性t細(xì)胞的制備方法，包括以下步驟：

提供t細(xì)胞；

向所述t細(xì)胞內(nèi)導(dǎo)入基因表達(dá)沉默劑，得到重組t細(xì)胞，所述基因表達(dá)沉默劑用于沉默tao-1蛋白磷酸激酶基因的表達(dá)；

將所述重組t細(xì)胞與負(fù)載有抗原的dc細(xì)胞混合，并置于含有四環(huán)素的培養(yǎng)基中共同培養(yǎng)；以及

收集共同培養(yǎng)后的所述重組t細(xì)胞，得到所述抗原特異性t細(xì)胞。

在一個(gè)實(shí)施方式中，所述基因表達(dá)沉默劑為所述tao-1蛋白磷酸激酶的shrna。

在一個(gè)實(shí)施方式中，所述tao-1蛋白磷酸激酶的shrna的正義鏈的堿基序列如seqidno.1所示，所述tao-1蛋白磷酸激酶的shrna的反義鏈的堿基序列如seqidno.2所示。

在一個(gè)實(shí)施方式中，所述含有四環(huán)素的培養(yǎng)基中，所述四環(huán)素的終濃度為0.5mg/ml～5mg/ml。

在一個(gè)實(shí)施方式中，所述含有四環(huán)素的培養(yǎng)基中還含有酶活為1×10²u/ml～1×10⁴u/ml的il-2和體積分?jǐn)?shù)為0.1％～15％的血漿。

在一個(gè)實(shí)施方式中，所述將所述重組t細(xì)胞與負(fù)載有抗原的dc細(xì)胞混合，并置于含有四環(huán)素的培養(yǎng)基中共同培養(yǎng)的操作中，所述重組t細(xì)胞與所述dc細(xì)胞的個(gè)數(shù)比為1～20：1，所述共同培養(yǎng)的時(shí)間為1天～15天。

在一個(gè)實(shí)施方式中，所述負(fù)載有抗原的dc細(xì)胞為負(fù)載有乳腺癌抗原的dc細(xì)胞。

一種抗原特異性t細(xì)胞，所述抗原特異性t細(xì)胞通過上述的抗原特異性t細(xì)胞的制備方法制備得到。

上述抗原特異性t細(xì)胞的制備方法制備得到的抗原特異性t細(xì)胞在制備抗腫瘤的藥物中的應(yīng)用。

在一個(gè)實(shí)施方式中，所述抗原特異性t細(xì)胞用于制備抗乳腺癌的藥物。

上述抗原特異性t細(xì)胞的制備方法，通過向t細(xì)胞內(nèi)導(dǎo)入基因表達(dá)沉默劑從而得到重組t細(xì)胞，并將重組t細(xì)胞與負(fù)載有抗原的dc細(xì)胞混合，置于含有四環(huán)素的培養(yǎng)基中共同培養(yǎng)。四環(huán)素能夠調(diào)控重組t細(xì)胞內(nèi)的基因表達(dá)沉默劑的開關(guān)，在dc細(xì)胞和t細(xì)胞相互接觸并形成免疫突觸結(jié)構(gòu)的過程中抑制具有負(fù)調(diào)控作用的tao-1蛋白磷酸激酶的基因表達(dá)，提高形成的免疫突觸的穩(wěn)定性，增加免疫突觸形成的時(shí)間和強(qiáng)度。而一旦dc細(xì)胞與t細(xì)胞抗原呈遞結(jié)束，即可在去掉四環(huán)素，恢復(fù)t細(xì)胞內(nèi)tao-1蛋白磷酸激酶的表達(dá)，保證了t細(xì)胞在非抗原呈遞階段的正常生理功能不受影響。結(jié)果表明，上述方法制備得到的抗原特異性t細(xì)胞cd3和hla-dr雙陽(yáng)性的t細(xì)胞比例高，t細(xì)胞分化更加成熟，dc細(xì)胞-t細(xì)胞之間的抗原呈遞的效率高，t細(xì)胞的免疫應(yīng)答效果好。

附圖說明

圖1為一實(shí)施方式dc細(xì)胞與t細(xì)胞進(jìn)行抗原傳遞形成免疫突觸的示意圖；

圖2為一實(shí)施方式的制備抗原特異性t細(xì)胞的流程圖；

圖3為實(shí)施例1中構(gòu)建的plko-tet-on/tao-1-shrna慢病毒表達(dá)質(zhì)粒經(jīng)過xhoi單酶切后得到的產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖；

圖4為實(shí)施例2制備的四組t細(xì)胞的cd3⁺及hla-dr⁺的流式檢測(cè)對(duì)比圖；

圖5為實(shí)施例2制備的四組t細(xì)胞對(duì)正常細(xì)胞系mcf-10a以及乳腺癌mcf-7細(xì)胞的殺傷效率的流式檢測(cè)對(duì)比圖。

具體實(shí)施方式

為使本發(fā)明的上述目的、特征和優(yōu)點(diǎn)能夠更加明顯易懂，下面結(jié)合具體實(shí)施例及附圖對(duì)本發(fā)明的具體實(shí)施方式做詳細(xì)的說明。在下面的描述中闡述了很多具體細(xì)節(jié)以便于充分理解本發(fā)明。但是本發(fā)明能夠以很多不同于在此描述的其它方式來實(shí)施，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以在不違背本發(fā)明內(nèi)涵的情況下做類似改進(jìn)，因此本發(fā)明不受下面公開的具體實(shí)施的限制。

請(qǐng)參閱圖2，一實(shí)施方式的抗原特異性t細(xì)胞的制備方法，包括以下步驟s110～s140。

s110、提供t細(xì)胞。

具體地，t細(xì)胞為生物內(nèi)正常的t細(xì)胞，可以通過提取外周血中的細(xì)胞獲得，也可以是傳代培養(yǎng)t細(xì)胞株獲得。

本實(shí)施方式中，t細(xì)胞為人源t細(xì)胞。

具體地，t細(xì)胞通過以下制備方法獲得：抽取健康志愿者的外周血，肝素抗凝，用淋巴細(xì)胞分離液分離外周血的單個(gè)核細(xì)胞。然后重懸單個(gè)核細(xì)胞，培養(yǎng)1h～4h后，洗滌并收集未貼壁的細(xì)胞，得到t細(xì)胞。

具體地，收集的t細(xì)胞置于含有cd3單克隆抗體、il-2(白細(xì)胞介素-2)和血漿的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)基中cd3單克隆抗體的終濃度為10ng/ml～100ng/ml，培養(yǎng)基中il-2的酶活為1×10²u/ml～1×10⁴u/ml，培養(yǎng)基中血漿的體積分?jǐn)?shù)為0.1％～15％，促進(jìn)t細(xì)胞的生長(zhǎng)。

s120、向s110中的t細(xì)胞內(nèi)導(dǎo)入基因表達(dá)沉默劑，得到重組t細(xì)胞，該基因表達(dá)沉默劑用于沉默tao-1蛋白磷酸激酶基因的表達(dá)。

發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，在免疫突觸(is)形成過程中細(xì)胞骨架的動(dòng)態(tài)變化及調(diào)控是實(shí)現(xiàn)其生理功能的重要基礎(chǔ)。它不僅為is的形成提供三維空間構(gòu)型的基礎(chǔ)，還將眾多信號(hào)分子帶到這一區(qū)域內(nèi)，同時(shí)為抗原呈遞及細(xì)胞信號(hào)傳遞提供保障。is形成需要較長(zhǎng)時(shí)間，體外實(shí)驗(yàn)觀察t細(xì)胞需要與dc細(xì)胞緊密結(jié)合數(shù)小時(shí)以上才能夠形成免疫突觸結(jié)構(gòu)。免疫突觸形成的這一特點(diǎn)需要維持支持其3d結(jié)構(gòu)的細(xì)胞骨架維持較長(zhǎng)的時(shí)間不發(fā)生解聚。這是保障后續(xù)抗原交換、細(xì)胞激活信號(hào)傳遞、t細(xì)胞激活等一系列細(xì)胞生物學(xué)行為發(fā)生的重要前提和基礎(chǔ)。因此，免疫細(xì)胞調(diào)控is部位細(xì)胞骨架的信號(hào)分子及其調(diào)控機(jī)制就成為理解整個(gè)is生理功能的關(guān)鍵。

而tao-1蛋白磷酸激酶(thousand-and-oneaminoacids)是sterile-20家族的成員之一，在所有真核細(xì)胞中高保留表達(dá)。它們的共同特征是都擁有一個(gè)絲氨酸/蘇氨酸激酶結(jié)構(gòu)域。tao家族蛋白的一個(gè)重要功能是激活mapk(mitogen-activatedproteinkinase)細(xì)胞信號(hào)傳到通路，以蛋白磷酸化和去磷酸化的方式調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)因子，從而調(diào)控細(xì)胞的增殖和分裂。此外，tao-1蛋白磷酸激酶還可以在微管延長(zhǎng)端到達(dá)細(xì)胞邊緣過渡增長(zhǎng)時(shí)誘發(fā)微管的去穩(wěn)定性，同時(shí)可以通過調(diào)控rhogtpase(rhogtp酶)在細(xì)胞表面的位置從而動(dòng)態(tài)的調(diào)控細(xì)胞極化過程。發(fā)明人猜測(cè)tao-1在細(xì)胞骨架相互作用的動(dòng)態(tài)調(diào)控中扮演著重要角色，tao-1在dc細(xì)胞和t細(xì)胞相互接觸，形成免疫突觸結(jié)構(gòu)的過程中發(fā)揮著關(guān)鍵的負(fù)調(diào)控作用。因此通過向t細(xì)胞內(nèi)導(dǎo)入基因表達(dá)沉默劑，在dc細(xì)胞和t細(xì)胞相互接觸形成免疫突觸結(jié)構(gòu)的過程沉默t細(xì)胞內(nèi)的tao-1蛋白磷酸激酶的基因表達(dá)，控制細(xì)胞接觸部位微管和細(xì)胞骨架的穩(wěn)定性，從而控制免疫突觸形成的時(shí)間和強(qiáng)度，提高形成的免疫突觸的穩(wěn)定性。

在一個(gè)實(shí)施方式中，基因表達(dá)沉默劑為tao-1蛋白磷酸激酶的shrna。將tao-1蛋白磷酸激酶的shrna導(dǎo)入進(jìn)入t細(xì)胞中，shrna與tao-1蛋白磷酸激酶的mrna互補(bǔ)結(jié)合序列特異性地實(shí)現(xiàn)靶mrna降解。通過基因敲除的方法對(duì)t細(xì)胞中的tao-1蛋白磷酸激酶表達(dá)基因進(jìn)行沉默，從而提高t細(xì)胞和dc細(xì)胞相互接觸形成免疫突觸的穩(wěn)定性。

具體地，tao-1蛋白磷酸激酶的shrna的正義鏈的堿基序列如seqidno.1所示，tao-1蛋白磷酸激酶的shrna的反義鏈的堿基序列如seqidno.2所示。上述堿基序列的tao-1蛋白磷酸激酶的shrna特異性好，對(duì)目的基因沉默效果穩(wěn)定。

在一個(gè)實(shí)施方式中，基因表達(dá)沉默劑負(fù)載在慢病毒中，通過慢病毒轉(zhuǎn)染進(jìn)入t細(xì)胞內(nèi)，并在轉(zhuǎn)染過程中加入聚凝胺(polybrane)，促進(jìn)慢病毒的轉(zhuǎn)染。具體地，加入的聚凝胺的終濃度為1μg/ml～100μg/ml。

具體地，將tao-1蛋白磷酸激酶的shrna連接到經(jīng)agei和ecor1雙酶切后慢病毒載體plko-tet-on中，得到重組plko-tet-o載體。經(jīng)酶切鑒定正確后，將其與慢病毒包裝質(zhì)粒plp1、plp2、plp/vsvg共轉(zhuǎn)染293t細(xì)胞，制備出plko-tet-on/tao-1-shrna慢病毒，然后將plko-tet-on/tao-1-shrna慢病毒轉(zhuǎn)染進(jìn)入t細(xì)胞內(nèi)。

具體地，plko-tet-on/tao-1-shrna慢病毒轉(zhuǎn)染t細(xì)胞時(shí)，病毒滴度moi＝10～100。

通過將基因表達(dá)沉默劑負(fù)載在慢病毒中轉(zhuǎn)染到t細(xì)胞內(nèi)，轉(zhuǎn)染效率高，轉(zhuǎn)染效果好。

s130、將s120中得到的重組t細(xì)胞與負(fù)載有抗原的dc細(xì)胞混合，并置于含有四環(huán)素的培養(yǎng)基中共同培養(yǎng)。

具體地，可以根據(jù)需要，在dc細(xì)胞上負(fù)載不同的抗原。當(dāng)負(fù)載有抗原的dc細(xì)胞與重組t細(xì)胞相互接觸時(shí)，抗原刺激t細(xì)胞形成免疫突觸結(jié)構(gòu)。

本實(shí)施方式中，負(fù)載有抗原的dc細(xì)胞為負(fù)載有乳腺癌抗原的dc細(xì)胞。獲得的抗原特異性t細(xì)胞能夠特異性的抗乳腺癌。

具體地，向培養(yǎng)的dc細(xì)胞中加入一定量的抗原，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1～2天，使得dc細(xì)胞上負(fù)載抗原。

四環(huán)素能夠調(diào)控重組t細(xì)胞內(nèi)的基因表達(dá)沉默劑的開關(guān)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，只有在四環(huán)素存在的情況下，tao-1蛋白磷酸激酶基因表達(dá)沉默。而一旦dc細(xì)胞與t細(xì)胞抗原呈遞結(jié)束，即可去掉四環(huán)素，恢復(fù)t細(xì)胞內(nèi)tao-1蛋白磷酸激酶的表達(dá)，保證了t細(xì)胞在非抗原呈遞階段的正常生理功能不受影響。

在一個(gè)實(shí)施方式中，培養(yǎng)基中的四環(huán)素的終濃度為0.5mg/ml～5mg/ml。例如0.8mg/ml、1mg/ml、2mg/ml或4mg/ml等等。四環(huán)素的濃度適宜，調(diào)控重組t細(xì)胞內(nèi)的基因表達(dá)沉默劑，在dc細(xì)胞和t細(xì)胞相互接觸并形成免疫突觸結(jié)構(gòu)的過程中，抑制tao-1蛋白磷酸激酶的基因表達(dá)。

在一個(gè)實(shí)施方式中，含有四環(huán)素的培養(yǎng)基中還含有酶活為1×10²u/ml～1×10⁴u/ml的il-2和體積分?jǐn)?shù)為0.1％～15％的血漿。具體地，含有四環(huán)素的培養(yǎng)基的基礎(chǔ)培養(yǎng)基為無血清培養(yǎng)基，例如alys-505培養(yǎng)基。向基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入0.5mg/ml～5mg/ml的四環(huán)素、1×10²u/ml～1×10⁴u/ml的il-2和體積分?jǐn)?shù)為0.1％～15％的血漿后獲得該含有四環(huán)素的培養(yǎng)基。

本實(shí)施方式中，含有四環(huán)素的培養(yǎng)基的基礎(chǔ)培養(yǎng)基為alys-505培養(yǎng)基，培養(yǎng)基中四環(huán)素的終濃度為1mg/ml，il-2的酶活為1×10³u/ml，血漿的體積分?jǐn)?shù)為0.5％。

具體地，血漿與提取t細(xì)胞的外周血為同源的。培養(yǎng)基中加入cd3單克隆抗體、il-2和血漿能夠促進(jìn)t細(xì)胞的生長(zhǎng)、增強(qiáng)t細(xì)胞的免疫活性。

在一個(gè)實(shí)施方式中，將重組t細(xì)胞與負(fù)載有抗原的dc細(xì)胞混合，并置于含有四環(huán)素的培養(yǎng)基中共同培養(yǎng)的操作中，重組t細(xì)胞與dc細(xì)胞的個(gè)數(shù)比為1～20：1，共同培養(yǎng)時(shí)間為1天～15天。在四環(huán)素存在的條件下，重組t細(xì)胞內(nèi)tao-1蛋白磷酸激酶基因表達(dá)受到抑制，將重組t細(xì)胞與dc細(xì)胞共同培養(yǎng)1天以上，形成穩(wěn)定的免疫突觸結(jié)構(gòu)，使得t細(xì)胞分化更加成熟，更具抗原特異性。

具體地，將重組t細(xì)胞與負(fù)載有抗原的dc細(xì)胞混合，置于含有四環(huán)素的培養(yǎng)基中共同培養(yǎng)共同培養(yǎng)1天～7天，例如2天、3天或4天等。

具體地，混合時(shí)，dc細(xì)胞為1×10⁵個(gè)/孔，重組t細(xì)胞約為1×10⁶個(gè)/孔。將重組t細(xì)胞加入在dc細(xì)胞的培養(yǎng)皿中共同培養(yǎng)，培養(yǎng)時(shí)隔天補(bǔ)加四環(huán)素。

s140、收集s130中共同培養(yǎng)后的重組t細(xì)胞，得到抗原特異性t細(xì)胞。

在四環(huán)素存在的條件下，將dc細(xì)胞與重組t細(xì)胞共同培養(yǎng)后，重組t細(xì)胞表面形成的表面突觸更加穩(wěn)定，t細(xì)胞分化更加成熟，dc細(xì)胞-t細(xì)胞之間的抗原呈遞的效率高，t細(xì)胞的免疫應(yīng)答效果好。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在四環(huán)素存在的條件下，負(fù)載有抗原的dc細(xì)胞刺激導(dǎo)入基因表達(dá)沉默劑的重組t細(xì)胞分化，上述方法制備的抗原特異性t細(xì)胞分化程度更高，活性更強(qiáng)。

在一個(gè)實(shí)施方式中，制備得到的抗原特異性t細(xì)胞中cd3和hla-dr雙陽(yáng)性的t細(xì)胞數(shù)量占總t細(xì)胞數(shù)量的60％以上。

進(jìn)一步地，制備得到的抗原特異性t細(xì)胞中cd3和hla-dr雙陽(yáng)性的t細(xì)胞數(shù)量占總t細(xì)胞數(shù)量的70％以上。

上述抗原特異性t細(xì)胞，在制備時(shí)，向t細(xì)胞內(nèi)導(dǎo)入基因表達(dá)沉默劑從而得到重組t細(xì)胞，并將重組t細(xì)胞與負(fù)載有抗原的dc細(xì)胞混合，置于含有四環(huán)素的培養(yǎng)基中共同培養(yǎng)。在重組t細(xì)胞與負(fù)載有抗原的dc細(xì)胞共同培養(yǎng)的過程中加入四環(huán)素，四環(huán)素能夠調(diào)控重組t細(xì)胞內(nèi)的基因表達(dá)沉默劑的開關(guān)，在dc細(xì)胞和t細(xì)胞相互接觸并形成免疫突觸結(jié)構(gòu)的過程中抑制具有負(fù)調(diào)控作用的tao-1蛋白磷酸激酶的基因表達(dá)，提高形成的免疫突觸的穩(wěn)定性，增加免疫突觸形成的時(shí)間和強(qiáng)度。而一旦dc細(xì)胞與t細(xì)胞抗原呈遞結(jié)束，即可在去掉四環(huán)素，恢復(fù)t細(xì)胞內(nèi)tao-1蛋白磷酸激酶的表達(dá)，保證了t細(xì)胞在非抗原呈遞階段的正常生理功能不受影響。結(jié)果表明，制備得到的抗原特異性t細(xì)胞cd3和hla-dr雙陽(yáng)性的t細(xì)胞比例高，t細(xì)胞分化更加成熟，dc細(xì)胞-t細(xì)胞之間的抗原呈遞的效率高，t細(xì)胞的免疫應(yīng)答效果好。

此外，本文還提供一實(shí)施方式的上述制備方法得到的抗原特異性t細(xì)胞在制備抗腫瘤的藥物中的應(yīng)用。

具體地，上述抗原特異性t細(xì)胞可以是應(yīng)用于預(yù)防腫瘤的疫苗，也可以是應(yīng)用于治療已經(jīng)確診為腫瘤甚至癌癥的藥物。

進(jìn)一步地，上述抗原特異性t細(xì)胞為用于制備抗乳腺癌的藥物。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，上述抗原特異性t細(xì)胞對(duì)乳腺癌有特異性的高效殺傷作用，而對(duì)正常的乳腺細(xì)胞的殺傷作用很小。因此，該抗原特異性t細(xì)胞有望應(yīng)用在抗腫瘤的藥物中，為腫瘤治療提供一種思路。

下面為具體實(shí)施例部分。

以下實(shí)施例中，如無特別說明，未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，例如參見薩姆布魯克、ef弗里奇、t曼尼阿蒂斯等(金冬雁，黎孟楓等譯)所著的分子克隆實(shí)驗(yàn)指南[m](北京：科學(xué)出版社，1992)中所述的條件或者試劑盒生產(chǎn)廠家推薦的方法實(shí)現(xiàn)。實(shí)施例中所使用的試劑均為市售。

未特別說明，nc-t表示t細(xì)胞與dc細(xì)胞共同培養(yǎng)后，收集的第一陰性對(duì)照t細(xì)胞。elv-t表示plko-tet-on空載體慢病毒感染t細(xì)胞與dc細(xì)胞共同培養(yǎng)后，收集的第二陰性對(duì)照t細(xì)胞。tlv-t表示plko-tet-on/tao-1-shrna慢病毒感染t細(xì)胞與dc細(xì)胞共同培養(yǎng)后，收集的第三陰性對(duì)照t細(xì)胞。tet-tlv-t(抗原特異性t細(xì)胞)表示plko-tet-on/tao-1-shrna慢病毒感染t細(xì)胞與dc細(xì)胞在四環(huán)素的條件下共同培養(yǎng)后，收集的抗原特異性t細(xì)胞。

實(shí)施例1

制備基因表達(dá)沉默劑

(1)設(shè)計(jì)tao-1蛋白磷酸激酶的shrna

利用thermo網(wǎng)站的shrna序列在線設(shè)計(jì)程序(http://rnaidesigner.thermofisher.com/rnaiexpress/setoption.do？designoption＝shrna&pid＝-2900031043253144145)，設(shè)計(jì)出tao-1shrnaoligos序列，如下所示：

正義鏈:

5’-ccggggaagtcaagtttctacaaagctcgagctttgtagaaacttgacttccttttt-3’(seqidno.1)。

反義鏈:

5’-aattggaagtcaagtttctacaaagctcgagctttgtagaaacttgacttcc-3’(seqidno.2)。

(2)制備plko-tet-on/tao-1-shrna慢病毒

將上述設(shè)計(jì)的tao-1蛋白磷酸激酶的shrna送交基因公司合成，利用agei和ecor1雙酶切慢病毒載體plko-tet-on，將退火后的tao-1-shrna寡核苷酸鏈連接到plko-tet-on載體中，dna連接反應(yīng)體系如下：

室溫反應(yīng)3h后，對(duì)連接產(chǎn)物plko-tet-on/tao-1-shrna慢病毒表達(dá)質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定。構(gòu)建的plko-tet-on/tao-1-shrna慢病毒表達(dá)質(zhì)粒經(jīng)過xhoi單酶切后得到的產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果如圖3，分別在大約150bp、200bp和8kb處有三條清晰條帶，與預(yù)期片段數(shù)和片段大小一致(8kb條帶因?yàn)槁《据d體plko-tet-on中也有一個(gè)xhoi酶切位點(diǎn))。證明tao-1-shrna寡核苷酸成功插入到plko-tet-on載體中。經(jīng)酶切鑒定正確后，將其與三個(gè)慢病毒包裝質(zhì)粒plp1、plp2、plp/vsvg共轉(zhuǎn)染293t細(xì)胞，制備出plko-tet-on/tao-1-shrna慢病毒。

實(shí)施例2

dc細(xì)胞和t細(xì)胞共同培養(yǎng)制備抗原特異性t細(xì)胞

1、dc細(xì)胞和t細(xì)胞的培養(yǎng)

(1)抽取健康志愿者外周血50ml，肝素抗凝，用淋巴細(xì)胞分離液分離出外周血單個(gè)核細(xì)胞(pbmc)。

(2)用含10％自體血漿的alys-505培養(yǎng)液重懸pbmc細(xì)胞，分裝入六孔板中，5×10⁶個(gè)/ml，2ml/孔，置于飽和濕度、37℃、5.0％co2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2h。

(3)洗滌并收集(2)中未貼壁的細(xì)胞，該未貼壁細(xì)胞為t細(xì)胞。將未貼壁的細(xì)胞用含50ng/mlcd3單抗、1000u/ml的il-2和0.5％自體血漿的alys-505培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞密度為1×10⁶/ml，轉(zhuǎn)入六孔板中，2ml/孔，同時(shí)每孔添加1000u/ml的ifn-γ，置于飽和濕度、37℃、5.0％co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每3天調(diào)整細(xì)胞密度為1×10⁶/ml，添加含1000u/ml的il-2和0.5％自體血漿的alys-505培養(yǎng)液。

(4)保留(2)中貼壁細(xì)胞于六孔板中，貼壁細(xì)胞為dc細(xì)胞，向六孔板加入含100ng/mlgm-csf、10ng/ml的il-4及10％自體血漿的alys-505培養(yǎng)液，置于飽和濕度、37℃、5.0％co2培養(yǎng)箱中誘導(dǎo)培養(yǎng)dc細(xì)胞。培養(yǎng)3天后半量換液并補(bǔ)充新鮮的細(xì)胞因子，另外加入一支腫瘤抗原(本專利使用乳腺癌細(xì)胞系mcf-7的凍融抗原，1ml)對(duì)dc細(xì)胞進(jìn)行抗原負(fù)載，置于飽和濕度、37℃、5.0％co2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。培養(yǎng)48h后收集dc細(xì)胞，計(jì)數(shù)，離心后以含100ng/mlgm-csf、10ng/mlil-4及10％自體血漿的alys-505培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度，接種于6孔板中，1×10⁵個(gè)細(xì)胞/孔，共接種8個(gè)孔。

(5)將(3)培養(yǎng)的8×10⁶個(gè)t細(xì)胞平均分成四組，每組2個(gè)平行對(duì)照。4組細(xì)胞分別為陰性對(duì)照t細(xì)胞組(nc-t)、plko-tet-on空載體慢病毒感染t細(xì)胞組(elv-t)、plko-tet-on/tao-1-shrna慢病毒感染t細(xì)胞組(tlv-t)、四環(huán)素誘導(dǎo)的plko-tet-on/tao-1-shrna慢病毒感染t細(xì)胞組(tet-tlv-t)。按照moi＝10的比值，elv-t組加入plko-tet-on空載體慢病毒，tlv-t細(xì)胞組和tet-tlv-t細(xì)胞組分別加入plko-tet-on/tao-1-shrna慢病毒，同時(shí)加入8μg/ml的polybrane促進(jìn)慢病毒感染，病毒轉(zhuǎn)染后，培養(yǎng)24h。

(6)將(5)中培養(yǎng)的各組t細(xì)胞更換新鮮的含1000u/mlil-2和0.5％自體血漿的alys-505培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)24h。

(7)分別將各組t細(xì)胞加入(4)中dc細(xì)胞培養(yǎng)孔中，與dc細(xì)胞共培養(yǎng)。其中，tet-tlv-t細(xì)胞組額外加入1mg/ml四環(huán)素，共同培養(yǎng)48h。

(8)補(bǔ)加新鮮的t細(xì)胞完全培養(yǎng)基(含1000u/mlil-2和0.5％自體血漿的alys-505培養(yǎng)液)，tet-tlv-t細(xì)胞組額外加入1mg/ml四環(huán)素，繼續(xù)共同培養(yǎng)48h。

(9)補(bǔ)加新鮮的t細(xì)胞完全培養(yǎng)基，tet-tlv-t細(xì)胞組不再添加四環(huán)素，繼續(xù)共同培養(yǎng)48h。

(10)收獲四組經(jīng)過負(fù)載有mcf-7的凍融抗原的dc細(xì)胞刺激的t細(xì)胞(nc-t、elv-t、tlv-t、tet-tlv-t)，其中t細(xì)胞增殖較快，而dc細(xì)胞基本是不增值，共同培養(yǎng)后四組收集的基本為t細(xì)胞。然后檢測(cè)各組t細(xì)胞表面hla-dr的表達(dá)，以及t細(xì)胞對(duì)乳腺癌細(xì)胞系mcf-7的特異性殺傷作用。

t細(xì)胞成熟度的流式檢測(cè)

將實(shí)施例2中收取的第一陰性對(duì)照組、第二陰性對(duì)照組、第三陰性對(duì)照組以及實(shí)驗(yàn)組的四組t細(xì)胞(nc-t、elv-t、tlv-t、tet-tlv-t)分別取1×10⁶個(gè)細(xì)胞，pbs洗滌一次后，利用cd3-fitc抗體、hla-dr-percp抗體進(jìn)行染色，流式上樣檢測(cè)t細(xì)胞中cd3⁺以及hla-dr⁺的t細(xì)胞的比例，以鑒定四組t細(xì)胞在成熟度上的差異。

四組t細(xì)胞cd3⁺且hla-dr⁺比例的流式檢測(cè)結(jié)果如圖4所示。流式檢測(cè)圖中左上角內(nèi)的散點(diǎn)表示cd3^-且hla-dr⁺的t細(xì)胞，左下角內(nèi)的散點(diǎn)表示cd3^-且hla-dr^-的t細(xì)胞，右上角內(nèi)的散點(diǎn)表示cd3⁺且hla-dr⁺的t細(xì)胞，右下角內(nèi)的散點(diǎn)表示cd3⁺且hla-dr^-的t細(xì)胞。一般cd3⁺表示的淋巴細(xì)胞為t細(xì)胞，且hla-dr⁺表示分化后活性好的t細(xì)胞。右上角內(nèi)百分?jǐn)?shù)表示cd3⁺且hla-dr⁺的t細(xì)胞的比例。其中nc-t組比例最低，為17.62％。elv-t組和tlv-t組的cd3⁺且hla-dr⁺比例接近，分別為25.98％和26.82％。說明在沒有四環(huán)素誘導(dǎo)時(shí)，dc細(xì)胞對(duì)tlv-t細(xì)胞的刺激作用與空病毒載體感染elv-t細(xì)胞相比，沒有顯著差異。而tet-tlv-t細(xì)胞組的cd3⁺以及hla-dr⁺比例最高，達(dá)到79.30％，與其它組相比有顯著差異，說明在四環(huán)素誘導(dǎo)下，t細(xì)胞在抗原負(fù)載dc細(xì)胞的刺激下可以分化的更成熟、活化程度更高。

t細(xì)胞對(duì)靶細(xì)胞殺傷的流式檢測(cè)結(jié)果

(1)以實(shí)施例2中收取的第一陰性對(duì)照組、第二陰性對(duì)照組、第三陰性對(duì)照組以及實(shí)驗(yàn)組的四組t細(xì)胞nc-t、elv-t、tlv-t、tet-tlv-t分別作為效應(yīng)細(xì)胞，分別以cfse標(biāo)記的乳腺癌mcf-7細(xì)胞、cfse標(biāo)記的乳腺正常細(xì)胞系mcf-10a作為靶細(xì)胞，按照20:1的效靶比混合效應(yīng)細(xì)胞和靶細(xì)胞，輕輕混勻，置于5％co2，37℃培養(yǎng)箱中孵育。

(2)24h后，加入1μg/mlpi染液，混勻，室溫避光孵育15min后，利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)cfse⁺pi⁺細(xì)胞(死亡的靶細(xì)胞)的百分率。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖5所示：各組t細(xì)胞對(duì)正常細(xì)胞系mcf-10a的殺傷效率差異不大，均低于24％。而各組t細(xì)胞對(duì)乳腺癌mcf-7細(xì)胞的殺傷效率則有較大的區(qū)別：nc-dc-t細(xì)胞的殺傷效率最低，僅有19.28％的靶細(xì)胞被殺傷。t細(xì)胞在與dc共培養(yǎng)過程中若沒有添加四環(huán)素時(shí)，tlv-t細(xì)胞對(duì)mcf-7的殺傷比例為34.29％。而當(dāng)t細(xì)胞與dc細(xì)胞共培養(yǎng)時(shí)添加1mg/ml四環(huán)素獲得的tet-tlv-t細(xì)胞對(duì)mcf-7細(xì)胞的殺傷比例提高到了70.29％。這一結(jié)果說明，在四環(huán)素誘導(dǎo)下，經(jīng)負(fù)載乳腺癌抗原的dc細(xì)胞刺激的plko-tet-on/tao-1-shrna慢病毒感染t細(xì)胞(tet-tlv-t，抗原特異性t細(xì)胞)對(duì)乳腺癌細(xì)胞mcf-7有特異性的高效殺傷作用，而對(duì)正常的乳腺細(xì)胞mcf-10a的殺傷作用很小。

綜上，與對(duì)照組相比，經(jīng)plko-tet-on/tao-1-shrna慢病毒感染t細(xì)胞與負(fù)載抗原的dc細(xì)胞在四環(huán)素的條件下共同培養(yǎng)后，收集的抗原特異性t細(xì)胞的cd3和hla-dr雙陽(yáng)性的t細(xì)胞比例高，t細(xì)胞分化更加成熟，dc細(xì)胞-t細(xì)胞之間的抗原呈遞的效率高，t細(xì)胞的免疫應(yīng)答效果好。抗原特異性t細(xì)胞對(duì)乳腺癌有特異性的高效殺傷作用，而對(duì)正常的乳腺細(xì)胞的殺傷作用很小，有望應(yīng)用在抗腫瘤的藥物中，為腫瘤治療提供一種思路。

以上所述實(shí)施例僅表達(dá)了本發(fā)明的一種或幾種實(shí)施方式，其描述較為具體和詳細(xì)，但并不能因此而理解為對(duì)本發(fā)明專利范圍的限制。應(yīng)當(dāng)指出的是，對(duì)于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干變形和改進(jìn)，這些都屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。因此，本發(fā)明專利的保護(hù)范圍應(yīng)以所附權(quán)利要求為準(zhǔn)。

sequencelisting

<110>劉韜

<120>抗原特異性t細(xì)胞及其制備方法和應(yīng)用

<160>2

<170>patentinversion3.3

<210>1

<211>57

<212>dna

<213>人工序列

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<210>2

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<213>人工序列

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