本發(fā)明屬于病原檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種蜜蜂幼蟲(chóng)腐臭病病原雙重taqman熒光定量pcr檢測(cè)方法。

背景技術(shù)：

蜜蜂美洲幼蟲(chóng)腐臭病(americanfoulbrood，afb)和歐洲幼蟲(chóng)腐臭病(europeanfoulbrood，efb)，是蜜蜂幼蟲(chóng)兩種重要的細(xì)菌性疾病，病原體分別為幼蟲(chóng)芽孢桿菌(paenibacilluslarvae，p.larvae)和蜂房蜜蜂球菌(melissococcuspluton，m.pluton)，呈世界性分布，世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(oie)將其列為法定報(bào)告動(dòng)物疫病，我國(guó)將其列為二類(lèi)動(dòng)物疫病和進(jìn)境動(dòng)物檢疫疫病，是我國(guó)轉(zhuǎn)地養(yǎng)蜂和世界各國(guó)在進(jìn)境蜂及蜂產(chǎn)品中重點(diǎn)檢疫的兩種蜜蜂疫病。p.larvae在一定條件下能產(chǎn)生芽孢，具有特別強(qiáng)的生存能力，病原很難控制和凈化；m.pluton雖不產(chǎn)生芽孢，但對(duì)外界不良環(huán)境的抵抗力強(qiáng)，能在蜂尸上存活數(shù)年，在蜂蜜里也能保持長(zhǎng)久的毒性，傳染性極強(qiáng)。afb和efb均感染和危害蜜蜂幼蟲(chóng)，且病癥相似，易發(fā)生誤診，因此開(kāi)展對(duì)afb和efb的同步鑒別及早期診斷研究具有重要意義。目前，afb和efb的實(shí)驗(yàn)室診斷方法主要包括細(xì)菌涂片鏡檢、分離培養(yǎng)、凝集試驗(yàn)和核酸檢測(cè)等方法，已有診斷方法全部是基于病原分離培養(yǎng)鑒定基礎(chǔ)之上的，由于幼蟲(chóng)芽孢桿菌和蜂房蜜蜂球菌對(duì)培養(yǎng)條件要求極其苛刻，分離培養(yǎng)困難，上述診斷方法很難對(duì)美洲幼蟲(chóng)腐臭病和歐洲幼蟲(chóng)腐臭病做出準(zhǔn)確診斷和推廣應(yīng)用，已報(bào)道的afb和efb多重pcr診斷方法為普通pcr，該方法只能對(duì)終產(chǎn)物進(jìn)行分析，無(wú)法對(duì)起始模版準(zhǔn)確定量和對(duì)擴(kuò)增反應(yīng)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)，必須在擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后借助電泳方法分析，流程較復(fù)雜，且在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)使用eb等有毒物質(zhì)，已報(bào)道的熒光定量pcr均為單重pcr方法，無(wú)法實(shí)現(xiàn)在同一反應(yīng)管中同時(shí)檢測(cè)兩種病原的目的，國(guó)內(nèi)外未見(jiàn)有afb和efb病原菌雙重taqman熒光定量pcr檢測(cè)方法的報(bào)道。

綜上所述，現(xiàn)有技術(shù)存在的問(wèn)題是：

1.分離培養(yǎng)、凝集試驗(yàn)等方法全部是基于病原分離培養(yǎng)鑒定基礎(chǔ)之上的，幼蟲(chóng)芽孢桿菌和蜂房蜜蜂球菌對(duì)培養(yǎng)條件要求極其苛刻，分離培養(yǎng)困難，對(duì)該病很難做出準(zhǔn)確診斷，診斷方法也很難推廣應(yīng)用。

2.國(guó)外在afb和efb的實(shí)驗(yàn)室診斷方面建立了多種pcr方法，但我國(guó)缺少具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的快速、準(zhǔn)確、高通量、易于推廣的pcr方法，不利于我國(guó)蜜蜂疫病的防控。

3.目前，已建立的afb和efb多重pcr診斷方法為普通pcr，只能對(duì)終產(chǎn)物進(jìn)行分析，無(wú)法對(duì)起始模版準(zhǔn)確定量和對(duì)擴(kuò)增反應(yīng)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)，必須在擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后借助電泳方法分析，流程較復(fù)雜，且在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)使用eb等有毒物質(zhì)。

4.目前，已建立的afb和efb熒光定量pcr均為單重pcr方法，無(wú)法實(shí)現(xiàn)在同一反應(yīng)管中同時(shí)檢測(cè)兩種病原的目的。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)存在的問(wèn)題，本發(fā)明提供了一種蜜蜂幼蟲(chóng)腐臭病病原雙重taqman熒光定量pcr檢測(cè)方法。

本發(fā)明是這樣實(shí)現(xiàn)的，一種蜜蜂幼蟲(chóng)腐臭病病原雙重taqman熒光定量pcr檢測(cè)方法，所述蜜蜂幼蟲(chóng)腐臭病病原雙重taqman熒光定量pcr檢測(cè)方法利用兩條探針，一條探針5′端采用比較成熟的fam作為熒光報(bào)告基團(tuán)，另一條探針5′端選擇vic作為標(biāo)記，兩條探針3′端選用bhq1非熒光淬滅基團(tuán)。

進(jìn)一步，具體檢測(cè)流程為：

1、dna抽提：采用ctab法或煮沸法或其它常規(guī)dna抽提方法提取樣品、陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照中的dna；

2、對(duì)照設(shè)置：幼蟲(chóng)芽孢桿菌、蜂房蜜蜂球菌或含有目的dna片段的陽(yáng)性質(zhì)粒作為陽(yáng)性對(duì)照、健康蜜蜂幼蟲(chóng)dna作為陰性對(duì)照，同時(shí)設(shè)立無(wú)模板空白對(duì)照；

3、25μlpcr反應(yīng)體系配置：在pcr管中加入premixextaq(2×)12.5μl，p.larvaef(10μmol/l)1μl，p.larvaer(10μmol/l)1μl，p.larvaep(10μmol/l)1μl，m.plutonf(10μmol/l)1μl，m.plutonr(10μmol/l)1μl，m.plutonp(10μmol/l)1μl，模板dna1μl，加滅菌ddh2o5.5μl，使反應(yīng)總體積為25.0μl；

4、pcr反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性2min；94℃變性15s、59℃退火延伸50s，共40個(gè)循環(huán)，退火延伸時(shí)收集熒光信號(hào)；

5、結(jié)果判定：陰性對(duì)照和空白對(duì)照無(wú)fam和vic熒光信號(hào)檢出，無(wú)ct值，并且無(wú)擴(kuò)增曲線(xiàn)，陽(yáng)性對(duì)照同時(shí)使用幼蟲(chóng)芽孢桿菌和蜂房蜜蜂球菌dna或混合陽(yáng)性質(zhì)粒，應(yīng)同時(shí)有fam和vic熒光信號(hào)檢出，且出現(xiàn)典型的擴(kuò)增曲線(xiàn)，ct值均≤35.0，對(duì)分別只單獨(dú)使用幼蟲(chóng)芽孢桿菌dna或蜂房蜜蜂球菌dna或其陽(yáng)性質(zhì)粒，則各管對(duì)應(yīng)只出現(xiàn)fam或vic熒光信號(hào)，各熒光信號(hào)有明顯擴(kuò)增曲線(xiàn)，且ct值都分別≤35.0，說(shuō)明試驗(yàn)為有效試驗(yàn)，否則試驗(yàn)無(wú)效；在試驗(yàn)有效的情況下，待測(cè)樣品有fam和vic熒光同時(shí)被檢出，且出現(xiàn)典型的擴(kuò)增曲線(xiàn)，ct值均≤35.0，判定為陽(yáng)性，表明從樣品中同時(shí)檢出幼蟲(chóng)芽孢桿菌和蜂房蜜蜂球菌，只有fam熒光被檢出，且出現(xiàn)典型的擴(kuò)增曲線(xiàn)，ct值≤35.0，判定為陽(yáng)性，表明從樣品中只檢出幼蟲(chóng)芽孢桿菌，只有vic熒光被檢出，且出現(xiàn)典型的擴(kuò)增曲線(xiàn)，ct值≤35.0，判定為陽(yáng)性，表明從樣品中只檢出蜂房蜜蜂球菌，無(wú)fam或vic熒光被檢出，且無(wú)擴(kuò)增曲線(xiàn)，無(wú)ct值，判定為陰性，表明從樣品中未檢出幼蟲(chóng)芽孢桿菌或蜂房蜜蜂球菌；待測(cè)樣品ct值>35.0的樣品重新檢測(cè)，重新檢測(cè)結(jié)果無(wú)fam或vic熒光被檢出，判定為陰性，表明從樣品中未檢出幼蟲(chóng)芽孢桿菌或蜂房蜜蜂球菌，重新檢測(cè)結(jié)果有fam或vic熒光被檢出，判定為陽(yáng)性，表明從樣品中檢出幼蟲(chóng)芽孢桿菌或蜂房蜜蜂球菌。重新檢測(cè)需從提取dna開(kāi)始重新檢測(cè)，可從多個(gè)方面盡量提高檢出率，根據(jù)各種具體情況在可選使用量的幾個(gè)因素中調(diào)整優(yōu)化檢測(cè)過(guò)程，如增加樣品取樣量、減少溶解dna的te劑量、增加pcr反應(yīng)中加入的模板量、適當(dāng)增加pcr反應(yīng)循環(huán)數(shù)等。也可以針對(duì)其中一種可疑存在的病原菌進(jìn)行單一熒光定量pcr檢測(cè)。

本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)及積極效果為：為快速鑒別診斷蜜蜂美洲幼蟲(chóng)腐臭病(afb)和歐洲幼蟲(chóng)腐臭病(efb)，根據(jù)genbank中登陸的幼蟲(chóng)芽孢桿菌(p.larvae)和蜂房蜜蜂球菌(m.pluton)16srrna基因序列分別設(shè)計(jì)特異性引物和探針，建立了雙重taqman熒光定量pcr檢測(cè)方法。結(jié)果表明：本發(fā)明的方法與其它病原無(wú)交叉反應(yīng)；對(duì)p.larvae和m.pluton的檢測(cè)靈敏度均達(dá)10拷貝/μl的陽(yáng)性質(zhì)粒；重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果顯示批內(nèi)、批間變異系數(shù)均小于2％。對(duì)200份實(shí)驗(yàn)室模擬樣品和200份臨床樣品進(jìn)行了檢測(cè)，與預(yù)期結(jié)果一致。

本發(fā)明建立的方法可用于afb與efb的快速鑒別診斷、早期監(jiān)測(cè)、蜂產(chǎn)品中p.larvae和m.pluton的定量分析；建立afb和efb病原雙重taqman熒光定量pcr檢測(cè)方法，為afb和efb的早期同步診斷、蜂及蜂產(chǎn)品中p.larvae和m.pluton的檢驗(yàn)檢疫提供技術(shù)保障。

本發(fā)明建立的蜜蜂幼蟲(chóng)腐臭病病原雙重taqman熒光定量pcr檢測(cè)方法可直接用于臨床樣品及受污染的蜂產(chǎn)品中幼蟲(chóng)芽孢桿菌和蜂房蜜蜂球菌的檢測(cè)，無(wú)需病原培養(yǎng)，操作簡(jiǎn)單，結(jié)果準(zhǔn)確，適用于早期監(jiān)測(cè)，易于推廣應(yīng)用。

本發(fā)明建立的蜜蜂幼蟲(chóng)腐臭病病原雙重taqman熒光定量pcr檢測(cè)方法的引物和探針是自行設(shè)計(jì)，通過(guò)試驗(yàn)參數(shù)優(yōu)化獲得最佳反應(yīng)體系和反應(yīng)條件，填補(bǔ)了國(guó)內(nèi)外使用該方法對(duì)蜜蜂美洲幼蟲(chóng)腐臭病和歐洲幼蟲(chóng)腐臭病開(kāi)展同時(shí)鑒別診斷的空白，屬我國(guó)自主研發(fā)的蜂病診斷方法，為我國(guó)蜂病防控提供新的有效的技術(shù)手段。

本發(fā)明建立的蜜蜂幼蟲(chóng)腐臭病病原雙重taqman熒光定量pcr檢測(cè)方法試驗(yàn)過(guò)程全封閉，儀器自動(dòng)分析和獲取試驗(yàn)結(jié)果，無(wú)后續(xù)試驗(yàn)操作，可對(duì)起始模版準(zhǔn)確定量和擴(kuò)增反應(yīng)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)，方法特異性、靈敏度、自控化程度等均高于普通pcr。

本發(fā)明建立的蜜蜂幼蟲(chóng)腐臭病病原雙重taqman熒光定量pcr檢測(cè)方法可在同一反應(yīng)管同步檢測(cè)幼蟲(chóng)芽孢桿菌和蜂房蜜蜂球菌兩種病原，也可以針對(duì)其中一種可疑存在的病原菌進(jìn)行單一熒光定量pcr檢測(cè)，具有快速、靈敏、高通量等特點(diǎn)，節(jié)省檢測(cè)時(shí)間和檢測(cè)費(fèi)用。

附圖說(shuō)明

圖1是本發(fā)明實(shí)施例提供的蜜蜂幼蟲(chóng)腐臭病病原雙重taqman熒光定量pcr檢測(cè)方法流程圖。

圖2是本發(fā)明實(shí)施例提供的p.larvae陽(yáng)性模板的擴(kuò)增示意圖；

圖中：m：dl2000dnamarker；1：pcrproduct；2：negativecontrol。

圖3是本發(fā)明實(shí)施例提供的m.pluton陽(yáng)性模板的擴(kuò)增示意圖；

圖中：m：dl2000dnamarker；1：pcrproduct；2：negativecontrol。

圖4是本發(fā)明實(shí)施例提供的雙重?zé)晒舛縫cr檢測(cè)pxt-p標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)示意圖。

圖5是本發(fā)明實(shí)施例提供的雙重?zé)晒舛縫cr檢測(cè)pxt-m標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)示意圖。

圖6是本發(fā)明實(shí)施例提供的雙重?zé)晒舛縫cr特異性試驗(yàn)擴(kuò)增曲線(xiàn)示意圖；

圖中：1：m.pluton；2：p.larvae；3：nosemaapis；4：asosphaeraapis；5：sacbroodbeevirus；6：chronicbeeparalysisvirus；7：健康蜜蜂幼蟲(chóng)。

圖7是本發(fā)明實(shí)施例提供的雙重?zé)晒舛縫cr敏感性試驗(yàn)示意圖；

圖中：1-8：p.larvae1.3×10⁷copies/μl～1.3×10⁰copies/μl；a-h：m.pluton1.0×10⁷copies/μl～1.0×10⁰copies/μl；n：negativecontrol。

圖8是本發(fā)明實(shí)施例提供的普通pcr敏感性試驗(yàn)示意圖。

具體實(shí)施方式

為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點(diǎn)更加清楚明白，以下結(jié)合實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實(shí)施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。

下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明的應(yīng)用原理作詳細(xì)的描述。

本發(fā)明實(shí)施例提供的蜜蜂幼蟲(chóng)腐臭病病原雙重taqman熒光定量pcr檢測(cè)方法利用一條探針5′端采用比較成熟的fam作為熒光報(bào)告基團(tuán)，另一條探針5′端選擇vic作為標(biāo)記，兩條探針3′端選用bhq1非熒光淬滅基團(tuán)。一對(duì)幼蟲(chóng)芽孢桿菌引物p.larvaef/p.larvaerseqidno：1和一條探針p.larvaepseqidno：2、一對(duì)蜂房蜜蜂球菌引物m.plutonf/m.plutonrseqidno：3和一條探針m.plutonpseqidno：4。

如圖1所示，本發(fā)明實(shí)施例提供的蜜蜂幼蟲(chóng)腐臭病病原雙重taqman熒光定量pcr檢測(cè)方法包括以下步驟：

s101：dna抽提：采用ctab法或煮沸法或其它常規(guī)dna抽提方法提取樣品、陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照中的dna；

s102：對(duì)照設(shè)置：幼蟲(chóng)芽孢桿菌、蜂房蜜蜂球菌或含有目的dna片段的陽(yáng)性質(zhì)粒作為陽(yáng)性對(duì)照、健康蜜蜂幼蟲(chóng)dna作為陰性對(duì)照，同時(shí)設(shè)立無(wú)模板空白對(duì)照；

s103：25μlpcr反應(yīng)體系配置：在pcr管中加入premixextaq(2×)12.5μl，p.larvaef(10μmol/l)1μl，p.larvaer(10μmol/l)1μl，p.larvaep(10μmol/l)1μl，m.plutonf(10μmol/l)1μl，m.plutonr(10μmol/l)1μl，m.plutonp(10μmol/l)1μl，模板dna1μl，加滅菌ddh2o5.5μl，使反應(yīng)總體積為25.0μl；

s104：pcr反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性2min；94℃變性15s、59℃退火延伸50s，共40個(gè)循環(huán)，退火延伸時(shí)收集熒光信號(hào)；

s105：結(jié)果判定：陰性對(duì)照和空白對(duì)照無(wú)fam和vic熒光信號(hào)檢出，無(wú)ct值，并且無(wú)擴(kuò)增曲線(xiàn)，陽(yáng)性對(duì)照同時(shí)使用幼蟲(chóng)芽孢桿菌和蜂房蜜蜂球菌dna或混合陽(yáng)性質(zhì)粒，應(yīng)同時(shí)有fam和vic熒光信號(hào)檢出，且出現(xiàn)典型的擴(kuò)增曲線(xiàn)，ct值均≤35.0，對(duì)分別只單獨(dú)使用幼蟲(chóng)芽孢桿菌dna或蜂房蜜蜂球菌dna或其陽(yáng)性質(zhì)粒，則各管對(duì)應(yīng)只出現(xiàn)fam或vic熒光信號(hào)，各熒光信號(hào)有明顯擴(kuò)增曲線(xiàn)，且ct值都分別≤35.0，說(shuō)明試驗(yàn)為有效試驗(yàn)，否則試驗(yàn)無(wú)效。

下面結(jié)合試驗(yàn)對(duì)本發(fā)明的應(yīng)用效果作詳細(xì)的描述。

1材料與方法

1.1菌/毒/蟲(chóng)株p.larvae購(gòu)自北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院，m.pluton購(gòu)自美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，蜜蜂微孢子蟲(chóng)(nosemaapis)、蜜蜂球囊菌(asosphaeraapis)、囊狀幼蟲(chóng)病毒(sacbroodbeevirus)、慢性蜜蜂麻痹病病毒(chronicbeeparalysisvirus)由伊犁出入境檢驗(yàn)檢疫局綜合技術(shù)服務(wù)中心分離保存。

1.2主要試劑和儀器基因組dna提取試劑盒、rna提取試劑盒購(gòu)自qiagen公司；premixextaq(probeqpcr)、primescriptrt-pcrkit、pxt19-tvector、膠回收試劑盒、質(zhì)粒小量提取試劑盒等購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司。abi7500realtimepcrsystem購(gòu)自美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司。

1.3引物和探針的設(shè)計(jì)與合成根據(jù)genbank登錄的p.larvae和m.pluton16srrna基因保守序列，使用primerprimier5和primerexpress3.0軟件分別設(shè)計(jì)一對(duì)幼蟲(chóng)芽孢桿菌引物p.larvaef/p.larvaerseqidno：1和一條探針p.larvaepseqidno：2、一對(duì)蜂房蜜蜂球菌引物m.plutonf/m.plutonrseqidno：3和一條探針m.plutonpseqidno：4(表1)。引物和探針由北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限公司合成。

表1引物和探針序列

1.4標(biāo)準(zhǔn)品的制備提取p.larvae和m.pluton基因組作為模板，應(yīng)用特異性引物分別進(jìn)行普通pcr擴(kuò)增，分別將pcr產(chǎn)物克隆至pxt19-tvector，構(gòu)建重組質(zhì)粒pxt-p和pxt-m，轉(zhuǎn)化至e.colidh5α感受態(tài)細(xì)胞，37℃過(guò)夜搖菌后提取質(zhì)粒進(jìn)行普通pcr和測(cè)序驗(yàn)證，鑒定正確的重組質(zhì)粒測(cè)定濃度，作為雙重?zé)晒舛縫cr的標(biāo)準(zhǔn)品。

1.5反應(yīng)體系和條件優(yōu)化單重、雙重?zé)晒舛縫cr均采用premixextaq(probeqpcr)試劑，在abi7500型熒光定量pcr儀上進(jìn)行試驗(yàn)。雙重?zé)晒舛縫cr反應(yīng)體系中引物、探針濃度和反應(yīng)條件中退火、延伸溫度和時(shí)間在單重?zé)晒舛縫cr反應(yīng)體系和反應(yīng)條件的基礎(chǔ)上優(yōu)化。

1.6標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的建立將pxt-p和pxt-m標(biāo)準(zhǔn)品做10倍系列稀釋?zhuān)貌煌♂屘荻鹊臉?biāo)準(zhǔn)品作為模板，按優(yōu)化好的體系條件進(jìn)行雙重?zé)晒舛縫cr，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。

1.7特異性試驗(yàn)分別提取p.larvae、m.pluton、nosemaapis、asosphaeraapis、sacbroodbeevirus、chronicbeeparalysisvirus、健康蜜蜂幼蟲(chóng)核酸，sacbroodbeevirus和chronicbeeparalysisvirusrna反轉(zhuǎn)錄成cdna后，進(jìn)行單一及雙重?zé)晒舛縫cr檢測(cè)，確定該方法的特異性。

1.8敏感性試驗(yàn)用已知濃度的pxt-p和pxt-m標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行10倍系列稀釋8個(gè)梯度(10⁷拷貝/μl～10⁰拷貝/μl)，分別作為模板，按優(yōu)化好的體系條件進(jìn)行雙重?zé)晒舛縫cr，確定反應(yīng)的最小檢出量。同時(shí)進(jìn)行普通pcr反應(yīng)，比較兩種檢測(cè)方法的敏感性。

1.9重復(fù)性試驗(yàn)選取5個(gè)10倍系列稀釋的pxt-p和pxt-m標(biāo)準(zhǔn)品分別作為模板，各濃度進(jìn)行3次重復(fù)檢測(cè)，根據(jù)ct值計(jì)算批內(nèi)變異系數(shù)；以上述不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品分別作為模板，在3個(gè)不同時(shí)間進(jìn)行熒光定量pcr檢測(cè)，根據(jù)ct值計(jì)算批間變異系數(shù)，評(píng)價(jià)該方法的重復(fù)性和穩(wěn)定性。

1.10實(shí)驗(yàn)室模擬樣品和臨床樣品檢測(cè)將定量的不同稀釋度的pxt-p和pxt-m標(biāo)準(zhǔn)品摻入幼蟲(chóng)、蜂蛹、成蜂、蜂蜜、蜂膠、蜂王漿和花粉樣品中制成200份實(shí)驗(yàn)室模擬樣品；采自新疆的200份蜜蜂幼蟲(chóng)及蜂產(chǎn)品作為臨床樣品，應(yīng)用建立的雙重?zé)晒舛縫cr方法進(jìn)行檢測(cè)。

2結(jié)果

2.1標(biāo)準(zhǔn)品的制備將p.larvaedna和m.plutondna進(jìn)行普通pcr擴(kuò)增，獲得長(zhǎng)度約為130bp和160bp的目的片段(圖2，圖3)，pcr產(chǎn)物經(jīng)測(cè)序分析，與genbank中登錄序列的同源性達(dá)到100％。將目的片段克隆于pxt19-tvector中構(gòu)建pxt-p和pxt-m重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品，經(jīng)普通pcr和測(cè)序鑒定正確。

2.2反應(yīng)體系和反應(yīng)條件優(yōu)化通過(guò)采用矩陣法優(yōu)選引物、探針最佳濃度配比及退火、延伸溫度和時(shí)間。優(yōu)化后的雙重?zé)晒舛縫cr反應(yīng)體系和反應(yīng)條件(表2)。

表2雙重?zé)晒舛縫cr反應(yīng)體系和反應(yīng)條件

2.3標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的建立將pxt-p和pxt-m標(biāo)準(zhǔn)品10倍系列稀釋?zhuān)M(jìn)行雙重?zé)晒舛縫cr，獲得了標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，結(jié)果表明標(biāo)準(zhǔn)品濃度在10⁷拷貝/μl～10拷貝/μl具有良好的線(xiàn)性關(guān)性，兩條標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的相關(guān)系數(shù)均為r²＝0.999。線(xiàn)性方程分別為ct＝-3.381×logco+36.56(pxt-p)(圖4)和ct＝-3.495×logco+41.24(pxt-m)(圖5)。

2.4特異性試驗(yàn)雙重?zé)晒舛縫cr特異性檢測(cè)結(jié)果顯示，p.larvae及m.pluton均產(chǎn)生擴(kuò)增曲線(xiàn)，且循環(huán)閾值均小于35。而其它病原、健康蜜蜂幼蟲(chóng)均未產(chǎn)生擴(kuò)增曲線(xiàn)(圖6)。

2.5敏感性試驗(yàn)將10倍系列稀釋的8個(gè)梯度(10⁷拷貝/μl～10⁰拷貝/μl)的pxt-p和pxt-m標(biāo)準(zhǔn)品，分別作為模板進(jìn)行雙重?zé)晒舛縫cr和普通pcr檢測(cè)，結(jié)果顯示雙重?zé)晒舛縫cr最小檢出量為10拷貝/μl(圖7)，普通pcr最小檢出量為10³拷貝/μl(圖8)，表明熒光定量pcr的敏感性比普通pcr提高了約100倍。

2.6重復(fù)性試驗(yàn)選取5個(gè)10倍倍比稀釋的pxt-p和pxt-m標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行批內(nèi)和批間重復(fù)性試驗(yàn)，根據(jù)擴(kuò)增反應(yīng)的ct值，計(jì)算變異系數(shù)(cv)，結(jié)果顯示變異系數(shù)均小于2％(表3)，表明所建立的方法具有較好的重復(fù)性。

表3雙重?zé)晒舛縫cr重復(fù)性試驗(yàn)

2.7樣品檢測(cè)應(yīng)用建立的雙重?zé)晒舛縫cr方法和普通pcr方法對(duì)200份實(shí)驗(yàn)室模擬樣品和采自新疆的200份蜜蜂幼蟲(chóng)及蜂產(chǎn)品臨床樣品進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果加入pxt-p和pxt-m標(biāo)準(zhǔn)品濃度10拷貝/μl以上的實(shí)驗(yàn)室模擬樣品雙重?zé)晒舛縫cr檢測(cè)均為陽(yáng)性，加入pxt-p和pxt-m標(biāo)準(zhǔn)品濃度10³拷貝/μl以上的實(shí)驗(yàn)室模擬樣品普通pcr檢測(cè)均為陽(yáng)性，蜜蜂幼蟲(chóng)及蜂產(chǎn)品臨床樣品兩種檢測(cè)方法結(jié)果均為陰性，表明該雙重?zé)晒舛縫cr具有良好的臨床靈敏性和應(yīng)用性。

afb和efb病原可以廣泛分布在病蜂接觸過(guò)的花粉、糖液、飼槽、巢脾等，這些都可以作為主要傳染源，p.larvae及m.pluton對(duì)外界都有著較強(qiáng)的抵抗力，同時(shí)盜蜂和迷巢蜂等使該病在蜂群中傳播，所以要徹底清除這些病原是相當(dāng)困難的，這也很大程度上影響著蜜蜂群勢(shì)及蜂產(chǎn)品的產(chǎn)量與質(zhì)量。兩種疫病臨床癥狀相似，易誤診，因此開(kāi)展對(duì)afb和efb的同步鑒別及早期診斷研究具有重要意義。

多重?zé)晒舛縫cr方法是在單重?zé)晒舛縫cr基礎(chǔ)上發(fā)展的技術(shù)，在同一個(gè)反應(yīng)體系中加入多套引物和探針，探針的5′端標(biāo)記不同波長(zhǎng)的發(fā)光基團(tuán)，可同時(shí)對(duì)多種目標(biāo)基因進(jìn)行檢測(cè)，具有快速、靈敏、高通量等特點(diǎn)，已成為實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)病原體及病理分析的主要手段之一。本發(fā)明建立了p.larvae及m.pluton的雙重taqman探針熒光定量pcr檢測(cè)方法，實(shí)現(xiàn)了在同一反應(yīng)管中同時(shí)檢測(cè)兩種病原的目的，節(jié)省了檢測(cè)時(shí)間和檢測(cè)費(fèi)用。通過(guò)反應(yīng)體系和條件優(yōu)化解決了兩對(duì)引物和探針之間相互干擾問(wèn)題，設(shè)計(jì)探針時(shí)，p.larvae和m.pluton探針5′端分別標(biāo)記熒光發(fā)射波長(zhǎng)處于不同光譜范圍的fam和vic報(bào)告基團(tuán)，不易互相干擾，3′端標(biāo)記bhq1作為熒光淬滅基團(tuán)，該修飾基團(tuán)本身不產(chǎn)生熒光，且淬滅效率更高，大大降低了本底信號(hào)的強(qiáng)度，提高了方法靈敏度。采用本發(fā)明建立的雙重?zé)晒舛縫cr和普通pcr檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室制備的200份模擬樣品和200份臨床樣品，結(jié)果表明本發(fā)明建立的雙重?zé)晒舛縫cr方法靈敏度更高，技術(shù)驗(yàn)證試驗(yàn)表明該方法具有良好的特異性、重復(fù)性和廣泛的適用性。本發(fā)明建立的taqman探針雙重?zé)晒舛縫cr方法可用于afb和efb的快速鑒別診斷、早期監(jiān)測(cè)、流行病學(xué)調(diào)查及蜂產(chǎn)品中p.larvae和m.pluton的定量分析。

以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)所作的任何修改、等同替換和改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。

<110>伊犁出入境檢驗(yàn)檢疫局綜合技術(shù)服務(wù)中心、新疆出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心、伊犁職業(yè)技術(shù)學(xué)院

<120>蜜蜂幼蟲(chóng)腐臭病病原雙重taqman熒光定量pcr檢測(cè)方法

<160>4

<210>1

<211>45

<212>rna

<213>人工序列

<400>核苷酸序列

p.larvaefctaatacatgcaagtcgagcgga

p.larvaerggtattagctcacgtttccgca

<210>2

<211>25

<212>rna

<213>人工序列

<400>核苷酸序列

p.larvaepfam-cttgtgtttctttcgggagacgcca-bhq1

<210>3

<211>43

<212>rna

<213>人工序列

<400>核苷酸序列

m.plutonfccatcagaaggggataacacttg

m.plutonratcgttgccttggtgagcct

<210>4

<211>25

<212>rna

<213>人工序列

<400>核苷酸序列

m.plutonpvic-cgcatgaagaggagttaaaaggcgc-bhq1