本發(fā)明涉及醫(yī)學(xué)工程技術(shù)領(lǐng)域，尤其是涉及一種mirna-485-5p核苷酸類似物及其反義核苷酸的應(yīng)用和應(yīng)用其的產(chǎn)品。

背景技術(shù)：

心血管疾病是威脅人類健康的頭號殺手，全球每10例死亡病例中就有1例因心血管疾病造成，由于其危害范圍非常廣，如無年齡，地域之分，已經(jīng)日益成為世人關(guān)注的一個熱點(diǎn)。我國心血管病人數(shù)一直在持續(xù)增加，每10秒就有一人死于心血管疾病，每5個成年人中就有1個心血管病患者。據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計(jì)，到2020年，中國每年因心血管疾病死亡的人數(shù)將可能達(dá)到400萬。因此如何通過有效的干預(yù)手段，降低心血管疾病發(fā)病率與死亡率，已經(jīng)成為我國乃至全世界一個日益迫切的重大公共衛(wèi)生問題。

心肌肥大分為生理性與病理性兩種，其中病理性心肌肥大是由許多因素如衰老，心肌缺血，及高血壓等引發(fā)的一種心肌組織,心室壁及間隔異常肥大的一種疾病。心肌肥大最初是一種對過壓及過氧的補(bǔ)償過程，然而，長期暴露于疾病相關(guān)的刺激下會引起心肌細(xì)胞病理性生長，細(xì)胞死亡最終心力衰竭而死。國內(nèi)外從多方面對心肌肥大發(fā)生機(jī)制進(jìn)行了研究，在細(xì)胞與分子水平研究較多的有結(jié)構(gòu)蛋白的遺傳突變，代謝的異常改變，心肌細(xì)胞的纖維化，心臟中各種類型細(xì)胞間的聯(lián)系及細(xì)胞器發(fā)生的有害改變，心肌細(xì)胞的異常增大，肌節(jié)結(jié)構(gòu)重排，胚胎基因的再表達(dá)及分子信號通路的改變都會導(dǎo)致心肌肥大乃至心力衰竭的發(fā)生。這些研究對認(rèn)識心肌細(xì)胞發(fā)生及發(fā)展病理性肥大的機(jī)制提供了重要理論，但是，由于心肌肥大發(fā)病原因及發(fā)展過程的復(fù)雜性，仍有許多重要問題尚待闡明。

microrna(mirna)是一類長約18-22個核苷酸的非編碼rna，主要通過結(jié)合到mrna的3’-utr區(qū)抑制基因的表達(dá)。許多研究表明mirna在心血管的病理及生理方面發(fā)揮著重要作用，被認(rèn)為能成為心血管疾病診斷及預(yù)后的標(biāo)記物及新穎的治療手段。因此，將mirna作為心臟疾病治療的靶點(diǎn)，開發(fā)相關(guān)藥物具有潛在的臨床應(yīng)用價值。單一的mirna可以同時作用與多個靶基因的mrna的表達(dá)，這樣藥物作用于一個mirna可以調(diào)節(jié)多個參與心臟發(fā)病基因的表達(dá)，影響多個信號通路，從整體上達(dá)到治療疾病的目的。由于mirna在心臟病理狀態(tài)下表達(dá)水平不同，因此可以通過檢測mirna的表達(dá)水平來預(yù)測診斷疾病。

盡管越來越多的mirna作為人類疾病的生物標(biāo)志物及治療靶點(diǎn)被發(fā)現(xiàn)，但在心臟肥厚和心肌纖維化等心臟疾病中的關(guān)鍵mirna仍沒有確定，其所發(fā)揮的功能是對該領(lǐng)域科研人員的挑戰(zhàn)。

有鑒于此，特提出本發(fā)明。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的第一個目的在于提供mirna-485-5p核苷酸類似物或其生物活性功能片段或變體在制備用于診斷和/或預(yù)后評估心臟疾病的產(chǎn)品中的應(yīng)用；

本發(fā)明的第二個目的在于提供一種用于診斷和/或預(yù)后評估心臟疾病的藥物；

本發(fā)明的第三個目的在于提供一種用于診斷和/或預(yù)后評估心臟疾病的試劑盒；

本發(fā)明的第四個目的在于提供mirna-485-5p反義核苷酸在制備用于預(yù)防和/或治療心臟疾病的產(chǎn)品中的應(yīng)用；

本發(fā)明的第五個目的在于提供一種用于預(yù)防和/或治療心臟疾病的藥物。

本發(fā)明提供了mirna-485-5p核苷酸類似物或其生物活性功能片段或變體在制備用于診斷和/或預(yù)后評估心臟疾病的產(chǎn)品中的應(yīng)用；

所述mirna-485-5p核苷酸類似物含有seqidno.1所示的序列。

進(jìn)一步地，所述產(chǎn)品為藥物或試劑盒。

進(jìn)一步地，所述mirna-485-5p核苷酸類似物的核苷酸序列中每個堿基均進(jìn)行了化學(xué)修飾。

本發(fā)明還提供了一種用于診斷和/或預(yù)后評估心臟疾病的藥物，所述藥物包括mirna-485-5p核苷酸類似物或其生物活性功能片段或變體。

本發(fā)明還提供了一種用于診斷和/或預(yù)后評估心臟疾病的試劑盒，所述試劑盒包括用于特異性檢測mirna-485-5p核苷酸類似物的探針或引物。

本發(fā)明還提供了mirna-485-5p反義核苷酸在制備用于預(yù)防和/或治療心臟疾病的產(chǎn)品中的應(yīng)用；

所述mirna-485-5p反義核苷酸含有seqidno.2所示的序列。

進(jìn)一步地，所述產(chǎn)品為藥物。

另外，本發(fā)明還提供了一種用于預(yù)防和/或治療心臟疾病的藥物，所述藥物包括mirna-485-5p反義核苷酸。

進(jìn)一步地，所述藥物的給藥方式包括口服給藥或注射給藥。

進(jìn)一步地，所述心臟疾病包括心肌肥厚、心肌纖維化、冠心病、心肌炎、心瓣膜疾病、高血壓和心衰的一種或多種。

本發(fā)明提供的mirna-485-5p核苷酸類似物通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在肥大的心肌細(xì)胞中表達(dá)顯著下調(diào)，過表達(dá)mir-485-5p能顯著抑制線粒體分裂；對其進(jìn)行肥大指標(biāo)的檢測發(fā)現(xiàn)，能夠明顯抑制心肌肥大的指標(biāo)。以上說明，mi-485-5p能夠抑制心肌肥大的發(fā)生。這意味著mir-485-5p可作為一種早期診斷和早期預(yù)防心肌肥大，心肌纖維化等心臟疾病的生物標(biāo)志物。因此，通過檢測外周血血漿中mirna-485-5p核苷酸的表達(dá)水平，用于對許多心臟疾病具有診斷和/或預(yù)后評估的潛在價值。

附圖說明

為了更清楚地說明本發(fā)明具體實(shí)施方式或現(xiàn)有技術(shù)中的技術(shù)方案，下面將對具體實(shí)施方式或現(xiàn)有技術(shù)描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹，顯而易見地，下面描述中的附圖是本發(fā)明的一些實(shí)施方式，對于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來講，在不付出創(chuàng)造性勞動的前提下，還可以根據(jù)這些附圖獲得其他的附圖。

圖1為本發(fā)明實(shí)施例1提供的心臟肥大刺激及去氧腎上腺素(pe)誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥大過程mirna-485-5p表達(dá)水平的變化結(jié)果圖；

圖2為本發(fā)明實(shí)施例2提供的原代心肌細(xì)胞轉(zhuǎn)染mirna-485-5p核苷酸類似物后，mirna-485-5p表達(dá)水平的變化結(jié)果圖；

圖3a為本發(fā)明實(shí)施例2提供的過表達(dá)mirna-485-5p，抑制去氧腎上腺素誘導(dǎo)的促線粒體蛋白mapl表達(dá)增加的結(jié)果圖；

圖3b為本發(fā)明實(shí)施例2提供的過表達(dá)mirna-485-5p，阻斷去氧腎上腺素誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞線粒體分裂的發(fā)生的結(jié)果圖；

圖4為本發(fā)明實(shí)施例2提供的原代心肌細(xì)胞轉(zhuǎn)染mirna-485-5p核苷酸類似物后對心肌細(xì)胞表面積的影響結(jié)果圖；

圖5為本發(fā)明實(shí)施例2提供的原代心肌細(xì)胞轉(zhuǎn)染mirna-485-5p核苷酸類似物后對肥大標(biāo)記物anp表達(dá)水平的影響結(jié)果圖；

圖6為本發(fā)明實(shí)施例2提供的原代心肌細(xì)胞轉(zhuǎn)染mirna-485-5p核苷酸類似物后對肥大標(biāo)記物β-mhc表達(dá)水平的影響結(jié)果圖。

具體實(shí)施方式

下面將結(jié)合附圖對本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實(shí)施例是本發(fā)明一部分實(shí)施例，而不是全部的實(shí)施例?；诒景l(fā)明中的實(shí)施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒有做出創(chuàng)造性勞動前提下所獲得的所有其他實(shí)施例，都屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。

本發(fā)明提供了mirna-485-5p核苷酸類似物或其生物活性功能片段或變體在制備用于診斷和/或預(yù)后評估心臟疾病的產(chǎn)品中的應(yīng)用，mirna-485-5p類似物苷酸的序列如下(seqidno.1)：

5’-agaggcuggccgugaugaauuc-3’。

其中，mirna-485-5p核苷酸類似物的生物活性功能片段或變體，例如可以為，但不限于如下(1)-(3)：

(1)含有mirna-485-5p核苷酸類似物的編碼基因的重組載體；

(2)含有mirna-485-5p核苷酸類似物的編碼基因的重組病毒；

(3)含有mirna-485-5p核苷酸類似物的編碼基因的重組病毒載體。

在本發(fā)明中，產(chǎn)品為藥物或試劑盒。

在本發(fā)明中，mirna-485-5p核苷酸類似物的核苷酸序列中每個堿基均進(jìn)行了化學(xué)修飾。

其中，化學(xué)修飾例如可以為，但不限于核糖修飾，堿基修飾或磷酸骨架修飾。

在一個優(yōu)選的實(shí)施方式中，mirna-485-5p核苷酸類似物的核苷酸序列中每個堿基均進(jìn)行了2’-甲氧基修飾。

本發(fā)明還提供了一種用于診斷和/或預(yù)后評估心臟疾病的藥物，包括mirna-485-5p核苷酸類似物或其生物活性功能片段或變體。

本發(fā)明還提供了一種用于診斷和/或預(yù)后評估心臟疾病的試劑盒，包括用于特異性檢測mirna-485-5p核苷酸類似物的探針或引物。

其中，用于特異性檢測mirna-485-5p核苷酸類似物的引物序列為：

反轉(zhuǎn)錄引物：

5’-ctcaactggtgtcgtggagtcggcaattcagttgaggaattcat-3’(seqidno.3)；

上游引物：5’-cagaggctggccgtga-3’(seqidno.4)；

下游引物：5’-tggtgtcgtggagtcg-3’(seqidno.5)。

另外，本發(fā)明還提供了mirna-485-5p反義核苷酸在制備用于預(yù)防和/或治療心臟疾病的產(chǎn)品中的應(yīng)用，mirna-485-5p反義核苷酸的序列如下(seqidno.2)：

5’-gaauucaucacggccagccucu-3’。

在本發(fā)明中，產(chǎn)品為藥物。

本發(fā)明還提供了一種用于預(yù)防和/或治療心臟疾病的藥物，包括上述的mirna-485-5p反義核苷酸。

在本發(fā)明中，用于預(yù)防和/或治療心臟疾病的藥物還包括藥學(xué)上可接受的載劑或輔料。

其中，載劑或輔料例如可以為，但不限于殼聚糖、膽固醇、脂質(zhì)體、環(huán)糊精、微球、微囊中的一種或多種。

在本發(fā)明中，用于預(yù)防和/或治療心臟疾病的藥物的給藥方式包括口服給藥或注射給藥。

其中，注射給藥的方式例如可以為，但不限于靜脈注射、肌肉注射、冠狀動脈內(nèi)注射和心肌注射。

在本發(fā)明中，心臟疾病包括心肌肥厚、心肌纖維化、冠心病、心肌炎、心瓣膜疾病、高血壓和心衰的一種或多種。

為了有助于更清楚的理解本發(fā)明的內(nèi)容，現(xiàn)結(jié)合具體的實(shí)施例詳細(xì)介紹如下。如未明確指出，以下實(shí)施例中涉及的實(shí)驗(yàn)操作方法為本領(lǐng)域常規(guī)的分子生物學(xué)操作方法，涉及的試劑均為分析純級試劑，涉及的試劑或儀器均可從正規(guī)渠道商購獲得。

除非特別指出，以下各實(shí)施例中涉及的各種實(shí)驗(yàn)方法和操作，包括細(xì)胞培養(yǎng)，rna的提取，rcr擴(kuò)增，熒光定量pcr，細(xì)胞染色等等，均可參見以下文獻(xiàn)：wangk,etal,mir-361-regulatedprohibitininhibitsmitochondrialfissionandapoptosisandprotectsheartfromischemiainjury.celldeathdiffer.2015jun；22(6):1058-68.w.-q.tan,etal,foxo3ainhibitscardiomyocytehypertrophythroughtransactivatingcatalasejbiolchem.2008october31；283(44):29730-29739；wangk,etal,mir-9andnfatc3regulatemyocardinincardiachypertrophy,jbiolchem.2010apr16；285(16):11903-12；linz,etal,mir-23afunctionsdownstreamofnfatc3toregulatecardiachypertrophy,pnas,2009,106(29):12103-12108).上述文獻(xiàn)在此全文引入作為參考。

實(shí)施例1心臟肥大刺激及去甲腎上腺素誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥大過程中mirna-485-5p表達(dá)水平變化的檢測

對于心肌細(xì)胞肥大模型，采用本實(shí)驗(yàn)室已建立的方法培養(yǎng)大鼠乳鼠原代心肌細(xì)胞，對心肌細(xì)胞用50μm去甲腎上腺素進(jìn)行處理，在培養(yǎng)的不同時間，提取細(xì)胞的總rna，實(shí)時熒光定量pcr技術(shù)檢測mirna-485-5p的表達(dá)水平。本實(shí)施例采用對原代心肌細(xì)胞分別進(jìn)行甲腎上腺素處理0小時、4小時、8小時、16小時后，檢測mirna-485-5p在心臟中不同時間點(diǎn)的表達(dá)水平。提取心臟的總rna(用trizol試劑盒)，實(shí)時熒光定量pcr檢測mirna-485-5p的表達(dá)水平，結(jié)果見圖1。

從圖1中可以看出，在pe處理0、4、8、16小時后，mir-485-5p的水平以時間依賴的方式逐漸下降。

實(shí)施例2過表達(dá)mirna-485-5p抑制原代心肌細(xì)胞線粒體分裂及心肌細(xì)胞肥大的實(shí)驗(yàn)

本實(shí)施例中將實(shí)施例1提供的原代心肌細(xì)胞分為四組，分別為空白組，pe處理組，對照組及實(shí)驗(yàn)組，每組三個重復(fù)(細(xì)胞量約為1×10⁶)。

其中，空白組原代心肌細(xì)胞只使用正常細(xì)胞培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)。

pe處理組原代心肌細(xì)胞用50μm去甲腎上腺素進(jìn)行處理。

實(shí)驗(yàn)組對原代心肌細(xì)胞用50μm去甲腎上腺素進(jìn)行處理后，進(jìn)行mirna-485-5p核苷酸類似物(其序列為5’-agaggcuggccgugaugaauuc-3’，seqidno.1，委托上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司合成)的轉(zhuǎn)染。

對照組與實(shí)驗(yàn)組的處理方法相同，僅將mirna-485-5p核苷酸類似物替換為無意義序列的陰性對照rna(agomir-control)。

本實(shí)施例中，對原代心肌細(xì)胞通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染mirna-485-5p核苷酸類似物后，能有效的促進(jìn)mirna-485-5p的表達(dá)檢測，結(jié)果見圖2。

從圖2中可以看出，在pe處理的原代心肌細(xì)胞中同時轉(zhuǎn)染mir-485-5pagomir，能夠有效增強(qiáng)原代心肌細(xì)胞中pe誘導(dǎo)降低的mir-485-5p的表達(dá)水平。

用mir-485-5p核苷酸類似物轉(zhuǎn)染心肌細(xì)胞以過表達(dá)mirna-485-5p，利用western-blot檢測心肌細(xì)胞促分裂蛋白mapl的表達(dá)情況，結(jié)果見圖3a；應(yīng)用mito-tracke染色技術(shù)檢測心肌細(xì)胞線粒體分裂情況，結(jié)果見圖3b；用鬼筆環(huán)肽標(biāo)記線粒體f-actin的方式，檢測心肌細(xì)胞表面積情況，結(jié)果見圖4；用熒光定量pcr的技術(shù)檢測心肌細(xì)胞肥大標(biāo)記物心房肽anp(見圖5)及β肌球蛋白重鏈β-mhc(見圖6)的表達(dá)。

從圖3a中可以看出，通過轉(zhuǎn)染mir-485-5pagomir增強(qiáng)mir-485-5p水平后，能夠下調(diào)pe誘導(dǎo)增加的促線粒體分裂蛋白mapl的表達(dá)。

從圖3b中可以看出，過表達(dá)mir-485-5p表達(dá)水平后能夠抑制pe誘導(dǎo)增加的線粒體分裂百分比。

從圖4中可以看出，mir-485-5pagomir誘導(dǎo)的mir-485-5p過表達(dá)能夠降低pe誘導(dǎo)增加的細(xì)胞表面積。

從圖5中可以看出，mir-485-5pagomir誘導(dǎo)的mir-485-5p過表達(dá)能夠降低pe誘導(dǎo)增加的心肌肥大標(biāo)記物anp的水平。

從圖6中可以看出，mir-485-5pagomir誘導(dǎo)的mir-485-5p過表達(dá)能夠降低pe誘導(dǎo)增加的心肌肥大標(biāo)記物β-mhc的表達(dá)水平。

綜上所述，mir-485-5p能夠促進(jìn)心肌肥大的發(fā)生。這意味著mir-485-5p可作為一種早期診斷和早期預(yù)防心肌肥大，心肌纖維化等心臟疾病的生物標(biāo)志物。因此，通過檢測外周血血漿中mirna-485-5p的表達(dá)水平，用于對許多心臟疾病具有診斷和/或預(yù)后評估的潛在價值；通過檢測抑制mirna-485-5p的表達(dá)水平，用于對許多心臟疾病具有預(yù)防和/或治療的潛在價值。

最后應(yīng)說明的是：以上各實(shí)施例僅用以說明本發(fā)明的技術(shù)方案，而非對其限制；盡管參照前述各實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)的說明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解：其依然可以對前述各實(shí)施例所記載的技術(shù)方案進(jìn)行修改，或者對其中部分或者全部技術(shù)特征進(jìn)行等同替換；而這些修改或者替換，并不使相應(yīng)技術(shù)方案的本質(zhì)脫離本發(fā)明各實(shí)施例技術(shù)方案的范圍。

sequencelisting

<110>青島大學(xué)

<120>mirna-485-5p核苷酸類似物及其反義核苷酸的應(yīng)用和應(yīng)用其的產(chǎn)品

<160>5

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>22

<212>rna

<213>人工序列

<400>1

agaggcuggccgugaugaauuc22

<210>2

<211>22

<212>rna

<213>人工序列

<400>2

gaauucaucacggccagccucu22

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<212>dna

<213>人工序列

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<212>dna

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<211>16

<212>dna

<213>人工序列

<400>5

tggtgtcgtggagtcg16