本申請大體涉及蛋白質(zhì)工程領域，更具體而言，本申請涉及波形蛋白的制備方法，特別是體外重折疊波形蛋白的方法及其應用。

背景技術：

在類風濕性關節(jié)炎病人中已發(fā)現(xiàn)，波形蛋白含兩個甘氨酸到精氨酸的突變，并且蛋白表面的精氨酸脫氨瓜氨酸化。用體外重組表達的瓜氨酸化突變型波形蛋白(mutantcitrullinatedvimentin，mcv)作為抗原來檢測血清中抗體含量，是一種新的類風濕性關節(jié)炎檢測方法，其靈敏度和特異性都比現(xiàn)有的類風濕性關節(jié)炎因子和環(huán)瓜氨酸肽臨床檢測方法高。

波形蛋白是細胞骨架中間絲家族成員之一。波形蛋白的完整三維結構迄今未知，雖然在pdb(proteindatabank)有多個已報道的波形蛋白片段結構(4ypc、4yv3、3g1e、3s4r、3ssu、3swk、3trt、3uf1、3klt)，但是最大片段也僅覆蓋100多個氨基酸。異源表達的人波形蛋白及突變型波形蛋白可溶性差，需要體外變性后進行重折疊。然而，人波形蛋白及突變型波形蛋白的重折疊的體外條件目前報道的方法不明確。例如，已有報道使用層析法，用多組氨酸標記突變型波形蛋白，將其在變性條件下親和層析結合在鎳柱上，再用不含變性劑的含咪唑的緩沖液洗脫。但是，此方法的重復性較差，變性后的突變型波形蛋白無法洗脫，或洗脫后呈沉淀狀態(tài)，明顯未能正確折疊。此外，波形蛋白折疊后的蛋白構型尚無定性標準，折疊后易形成不同分子量大小的中間絲，無法準確定量用于后續(xù)的抗體含量檢測。

因而，迫切需要建立正確折疊波形蛋白和/或質(zhì)量控制的方法，以滿足簡便且低耗地診斷類風濕性關節(jié)炎的需求。

技術實現(xiàn)要素：

第一方面，本申請?zhí)峁w外重折疊野生型或突變型波形蛋白的方法，包括以下步驟：使重組表達獲得的野生型或突變型波形蛋白制備物與ph為6-10的包含變性劑和還原劑的緩沖液接觸以溶解所述制備物，并獲得蛋白溶液；以及在氧化還原混合物存在下，通過透析法階段式降低蛋白溶液中變性劑的濃度，以重折疊野生型或突變型波形蛋白。

在一些實施方案中，階段式降低蛋白溶液中變性劑的濃度包括通過透析法將所述包含變性劑和還原劑的緩沖液中變性劑的濃度階段性地降低至初始濃度的50％、25％和0％。在一些實施方案中，通過使用包含所述變性劑并且所述變性劑的濃度梯度降低的三種透析液，所述三種透析液中變性劑的濃度分別為所述包含變性劑和還原劑的緩沖液中變性劑的濃度的50％、25％和0％。

在一些實施方案中，野生型或突變型波形蛋白制備物通過以下步驟獲得：使宿主細胞表達野生型或突變型波形蛋白；裂解宿主細胞，獲得包涵體形式的野生型或突變型波形蛋白制備物。

在一些實施方案中，變性劑為尿素和/或鹽酸胍。在一些實施方案中，包含變性劑和還原劑的緩沖液中尿素和/或鹽酸胍的濃度為1～10m。在一些實施方案中，包含變性劑和還原劑的緩沖液中尿素和/或鹽酸胍的濃度為4～8m。在一些實施方案中，包含變性劑和還原劑的緩沖液中尿素和/或鹽酸胍的濃度為8m。在該具體實施方案中，階段式降低蛋白溶液中變性劑的濃度可以使用三種透析液依次實施透析，所述三種透析液中尿素和/或鹽酸胍的濃度分別為4m、2m和0m。

在一些實施方案中，還原劑為二硫蘇糖醇(dtt)或β巰基乙醇。在一些實施方案中，包含變性劑和還原劑的緩沖液中二硫蘇糖醇或β巰基乙醇的濃度為1～20mm。在一些實施方案中，包含變性劑和還原劑的緩沖液中二硫蘇糖醇或β巰基乙醇的濃度為5～15mm。在一些實施方案中，包含變性劑和還原劑的緩沖液中二硫蘇糖醇或β巰基乙醇的濃度為10mm。

在一些實施方案中，氧化還原混合物為還原型谷胱甘肽/氧化型谷胱甘肽。在一些實施方案中，還原型谷胱甘肽與氧化型谷胱甘肽的比例為1:10。

在一些實施方案中，緩沖液的ph為8，并且包含：300mmnacl，10mmdtt，1mmedta，以及8m尿素或鹽酸胍。

在一些實施方案中，波形蛋白為人波形蛋白。

在一些實施方案中，宿主細胞為大腸桿菌。在一些實施方案中，大腸桿菌表達由seqidno.2所示的dna序列編碼的突變型波形蛋白。

第二方面，本申請?zhí)峁┯糜隗w外重折疊野生型或突變型波形蛋白的試劑盒，其包含ph為6-10、包含變性劑和還原劑的緩沖液，以及包含所述變性劑并且所述變性劑的濃度梯度降低的多種透析液。

在一些實施方案中，試劑盒還包含氧化還原混合物。

在一些實施方案中，變性劑為尿素和/或鹽酸胍。在一些實施方案中，所述包含變性劑和還原劑的緩沖液中尿素和/或鹽酸胍的濃度為1～10m。在一些實施方案中，所述包含變性劑和還原劑的緩沖液中尿素和/或鹽酸胍的濃度為4～8m。在一些實施方案中，所述包含變性劑和還原劑的緩沖液中尿素和/或鹽酸胍的濃度為8m。

在一些實施方案中，還原劑為二硫蘇糖醇(dtt)。在一些實施方案中，所述包含變性劑和還原劑的緩沖液中二硫蘇糖醇的濃度為1～20mm。在一些實施方案中，所述包含變性劑和還原劑的緩沖液中二硫蘇糖醇的濃度為5～15mm。在一些實施方案中，所述包含變性劑和還原劑的緩沖液中二硫蘇糖醇的濃度為10mm。

在一些實施方案中，氧化還原混合物為還原型谷胱甘肽/氧化型谷胱甘肽。在一些實施方案中，還原型谷胱甘肽與氧化型谷胱甘肽的比例為1:10。

在一些實施方案中，緩沖液的ph為8，包含：300mmnacl，10mmdtt，1mmedta，以及8m尿素或鹽酸胍。在該具體實施方案中，試劑盒包含尿素或鹽酸胍的濃度分別為4m、2m和0m的三種透析液。

第三方面，本申請?zhí)峁╄b定正確重折疊的波形蛋白的方法，包括利用圓二色譜法檢測波形蛋白樣品，如果檢測到α螺旋構型且不存在β折疊構型，則指示波形蛋白正確重折疊。

在一些實施方案中，圓二色譜法檢測包括如下條件：在室溫下，對波形蛋白樣品進行180-600nm平面偏振光的掃描檢測，檢測左右旋圓偏振光的吸收系數(shù)差。

第四方面，本申請?zhí)峁┩ㄟ^第一方面所述的方法制備的重折疊的突變型人波形蛋白。在一些實施方案中，所述突變型人波形蛋白相對于人野生型波形蛋白，在16和59位氨基酸殘基突變?yōu)榫彼帷Ｔ谝恍嵤┓桨钢?，利用seqidno:2所示編碼序列產(chǎn)生所述突變型人波形蛋白。本申請還提供了seqidno:2所示編碼突變型人波形蛋白的核酸分子。

第五方面，本申請?zhí)峁┩ㄟ^第一方面所述的方法制備的重折疊的野生型或突變型波形蛋白在制備用于檢測個體的生物樣本中抗波形蛋白抗體的試劑中的用途。

本申請還提供用于檢測個體的生物樣本中抗波形蛋白抗體的試劑，其包含通過第一方面所述的方法制備的重折疊的野生型或突變型波形蛋白。

如上文所述，類風濕性關節(jié)炎患者的血液中含有突變型波形蛋白，其包含三處精氨酸突變，并且蛋白表面的精氨酸脫氨瓜氨酸化。因此，將通過第一方面所述方法獲得的對應突變型波形蛋白在體外經(jīng)多肽精氨酸脫氨酶處理而瓜氨酸化后，可用于檢測血液或血清等組織液中人的抗突變型瓜氨酸化波形蛋白抗體含量，進而診斷類風濕性關節(jié)炎。

因此，本申請?zhí)峁┩ㄟ^第一方面所述的方法制備的重折疊的突變型人波形蛋白(例如，相對于人野生型波形蛋白在16、59位突變?yōu)榫彼?以及任選的精氨酸脫氨酶在制備用于檢測個體的生物樣本中抗突變型瓜氨酸化波形蛋白抗體的試劑以及用于診斷類風濕性關節(jié)炎的試劑中的用途。

本申請還提供用于檢測個體的生物樣本中抗突變型瓜氨酸化波形蛋白抗體的試劑或用于診斷類風濕性關節(jié)炎的試劑，其包含通過第一方面所述的方法制備的重折疊的突變型人波形蛋白(例如，相對于人野生型波形蛋白在16、59位突變?yōu)榫彼?以及任選的精氨酸脫氨酶。

附圖簡要說明

圖1示出所構建的表達突變型波形蛋白的質(zhì)粒圖譜。

圖2示出已重折疊的突變型波形蛋白的圓二色譜譜圖。

圖3示出重折疊的突變型波形蛋白經(jīng)多肽精氨酸脫氨酶處理前后的電泳結果，其中，泳道1為蛋白分子量標識；泳道2為1μg人突變型波形蛋白(g16/59r)+0.2μg多肽精氨酸脫氨酶(peptidylargininedeaminase,pad)，立即與sds上樣緩沖液混合上樣；泳道3為1μg人突變型波形蛋白(g16/59r)+0.2μgpad，55℃反應3個小時后再與sds上樣緩沖液混合上樣；泳道4和5分別為2與3雙倍的蛋白上樣。

圖4顯示了利用本申請的示例性瓜氨酸化突變型波形蛋白檢測類風濕性關節(jié)炎患者和健康個體血清中抗瓜氨酸化突變型波形蛋白抗體的結果。

序列簡要說明

seqidno:1顯示了ncbi數(shù)據(jù)庫中記錄的野生型人波形蛋白的氨基酸序列。

seqidno:2顯示了本申請的示例性突變波形蛋白的編碼序列，其中人野生型波形蛋白的16和59位甘氨酸密碼子被突變?yōu)榫彼崦艽a子，另外還進行了密碼子優(yōu)化等優(yōu)化設計。

seqidno:3顯示了本申請的示例性突變波形蛋白的氨基酸序列。

發(fā)明詳細描述

除非另作說明，本申請所涉及的術語均按照相關領域普通技術人員的常規(guī)理解。

第一方面，本申請?zhí)峁w外重折疊野生型或突變型波形蛋白的方法，包括以下步驟：使重組表達獲得的野生型或突變型波形蛋白制備物與ph為6-10的包含變性劑和還原劑的緩沖液接觸以溶解所述制備物，并獲得蛋白溶液；以及在氧化還原混合物存在下，通過透析法階段式降低蛋白溶液中變性劑和還原劑的濃度，以重折疊野生型或突變型波形蛋白。

該方法適用于野生型/天然波形蛋白或者本領域已知的任何突變型波形蛋白的體外重折疊。

在一些實施方案中，突變型波形蛋白包括人天然波形蛋白中第16和第59位的甘氨酸突變?yōu)榫彼?。該突變體為類風濕性關節(jié)炎的一種血液標志物，因此通過本申請方法制備的重折疊的該突變體可用于檢測個體的生物樣本中由該突變體引發(fā)的抗體，進而診斷或輔助診斷類風濕性關節(jié)炎。

在一些實施方案中，野生型或突變型波形蛋白制備物通過以下步驟獲得：使宿主細胞表達野生型或突變型波形蛋白；裂解宿主細胞，獲得包涵體形式的野生型或突變型波形蛋白制備物。

在一些實施方案中，宿主細胞為大腸桿菌。在一些實施方案中，大腸桿菌表達由seqidno.2所示的dna序列編碼的突變型波形蛋白。在具體實施方案中，可以將野生型或突變型波形蛋白的編碼序列置于強啟動子(如t7或pbad等)控制下的質(zhì)粒中，導入大腸桿菌，誘導表達后，野生型或突變型波形蛋白以不可溶的形式存在于包涵體內(nèi)。

裂解宿主細胞的步驟可在下面描述的溶解步驟之前或同時進行細胞裂解。細胞裂解可通過例如機械剪切如法式壓迫細胞(frenchpressurecell)、酶消化、超聲處理、勻漿化、玻璃珠渦流、洗滌劑處理、有機溶劑、凍融、氧化鋁或沙研磨、變性劑處理等等來完成?；蛘?，可在二硫鍵還原劑或半胱氨酸阻斷劑存在下裂解細胞。

上述方法包括使野生型或突變型波形蛋白制備物(例如，不可溶的包涵體形式)與包含變性劑和還原劑的緩沖液接觸，以使其溶解?？墒褂萌珉x心、過濾(包括超濾法)、沉淀、絮凝或固定等多種方法使不溶或聚集物質(zhì)與可溶蛋白分離，以獲得蛋白溶液。

在一些實施方案中，包含變性劑和還原劑的緩沖液的ph為6～10。在一些實施方案中，包含變性劑和還原劑的緩沖液的ph為6～8。在一些實施方案中，包含變性劑和還原劑的緩沖液的ph為約8。

重折疊的目的在于獲得蛋白的天然構象和天然二硫鍵。在本申請中，波形蛋白的重折疊是通過使蛋白溶液中變性劑的濃度通過透析法階段式降低至足以允許蛋白復性為可溶生物活性形式的水平。

在一些實施方案中，階段式降低蛋白溶液中變性劑的濃度包括通過透析法將所述包含變性劑和還原劑的緩沖液中變性劑的濃度階段性地降低至低于初始濃度的數(shù)個階段直至0。作為非限制性的實例，階段式降低蛋白溶液中變性劑的濃度可以包括將緩沖液中變性劑的濃度階段性地降低至初始濃度的50％、25％和0％。作為非限制性的實例，階段式降低蛋白溶液中變性劑的濃度可以通過使用包含對應于希望的各個階段濃度的變性劑進行透析。在一些實施方案中，可以使用包含變性劑并且變性劑的濃度梯度降低的三種透析液，所述三種透析液中變性劑的濃度分別為包含變性劑和還原劑的緩沖液中變性劑的濃度的50％、25％和0％。

在透析液中添加氧化劑或氧化還原混合物能允許天然二硫鍵重建，從而促進重折疊。氧化劑的實例包括但不限于氧、胱氨酸、氧化型谷胱甘肽、胱胺和乙二硫醇酸。氧化還原混合物的實例包括但不限于半胱氨酸/氧、半胱氨酸/胱氨酸、半胱氨酸/胱胺、半胱胺/胱胺、還原型谷胱甘肽/氧化型谷胱甘肽等等。

在一些實施方案中，變性劑為尿素和/或鹽酸胍。在一些實施方案中，包含變性劑和還原劑的緩沖液中尿素和/或鹽酸胍的濃度為1～10m。在一些實施方案中，包含變性劑和還原劑的緩沖液中尿素和/或鹽酸胍的濃度為4～8m。在一些實施方案中，包含變性劑和還原劑的緩沖液中尿素和/或鹽酸胍的濃度為8m。在該具體實施方案中，階段式降低蛋白溶液中變性劑的濃度可以使用三種透析液依次實施透析，所述三種透析液中尿素和/或鹽酸胍的濃度分別為4m、2m和0m。

在一些實施方案中，還原劑為二硫蘇糖醇(dtt)或β巰基乙醇。在一些實施方案中，包含變性劑和還原劑的緩沖液中二硫蘇糖醇或β巰基乙醇的濃度為1～20mm。在一些實施方案中，包含變性劑和還原劑的緩沖液中二硫蘇糖醇或β巰基乙醇的濃度為5～15mm。在一些實施方案中，包含變性劑和還原劑的緩沖液中二硫蘇糖醇或β巰基乙醇的濃度為10mm。

在一些實施方案中，氧化還原混合物為還原型谷胱甘肽/氧化型谷胱甘肽。在一些實施方案中，還原型谷胱甘肽與氧化型谷胱甘肽的比例為1:10。

在一些實施方案中，緩沖液的ph為8，并且包含：300mmnacl，10mmdtt，1mmedta，以及8m尿素或鹽酸胍。

第二方面，本申請?zhí)峁┯糜隗w外重折疊野生型或突變型波形蛋白的試劑盒，其包含ph為6-10、包含變性劑和還原劑的緩沖液，以及包含所述變性劑并且所述變性劑的濃度梯度降低的多種透析液。

在一些實施方案中，試劑盒還包含氧化還原混合物。

在一些實施方案中，變性劑為尿素和/或鹽酸胍。在一些實施方案中，所述包含變性劑和還原劑的緩沖液中尿素和/或鹽酸胍的濃度為1～10m。在一些實施方案中，所述包含變性劑和還原劑的緩沖液中尿素和/或鹽酸胍的濃度為4～8m。在一些實施方案中，所述包含變性劑和還原劑的緩沖液中尿素和/或鹽酸胍的濃度為8m。

在一些實施方案中，還原劑為二硫蘇糖醇(dtt)。在一些實施方案中，所述包含變性劑和還原劑的緩沖液中二硫蘇糖醇的濃度為1～20mm。在一些實施方案中，所述包含變性劑和還原劑的緩沖液中二硫蘇糖醇的濃度為5～15mm。在一些實施方案中，所述包含變性劑和還原劑的緩沖液中二硫蘇糖醇的濃度為10mm。

在一些實施方案中，氧化還原混合物為還原型谷胱甘肽/氧化型谷胱甘肽。在一些實施方案中，還原型谷胱甘肽與氧化型谷胱甘肽的比例為1:10。

在一些實施方案中，緩沖液的ph為8，包含：300mmnacl，10mmdtt，1mmedta，以及8m尿素或鹽酸胍。在該具體實施方案中，試劑盒包含尿素或鹽酸胍的濃度分別為4m、2m和0m的三種透析液。

第三方面，本申請?zhí)峁╄b定正確重折疊的波形蛋白的方法，包括利用圓二色譜法檢測波形蛋白樣品，如果檢測到α螺旋構型且不存在β折疊構型，則指示波形蛋白正確重折疊。

本申請發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，在適當?shù)柠}濃度和ph條件下，波形蛋白形成低聚體形式而不會形成分子量大小不一的中間絲，并進而首次發(fā)現(xiàn)正確重折疊的波形蛋白的二級結構超過90％為α螺旋，例如如圖2所示。因此，在一些實施方案中，如果檢測到具有圖2所示構型的圓二色譜結果，則指示波形蛋白正確重折疊。

在一些實施方案中，圓二色譜法檢測包括如下條件：在室溫下，對波形蛋白樣品進行180-600nm平面偏振光的掃描檢測，檢測左右旋圓偏振光的吸收系數(shù)差。作為非限制性的實例，圓二色譜法檢測包括如下條件：在室溫下，對2mm光徑的比色皿中0.08mg/ml的波形蛋白樣品進行180-600nm平面偏振光的掃描檢測，檢測左右旋圓偏振光的吸收系數(shù)差。

第四方面，本申請?zhí)峁┩ㄟ^第一方面所述的方法制備的重折疊的突變型人波形蛋白。在一些實施方案中，所述突變型人波形蛋白相對于人野生型波形蛋白，在16和59位氨基酸殘基突變?yōu)榫彼帷Ｔ谝恍嵤┓桨钢?，利用seqidno:2所示編碼序列產(chǎn)生所述突變型人波形蛋白。本申請還提供了seqidno:2所示編碼突變型人波形蛋白的核酸分子。seqidno.2所示的編碼序列經(jīng)過本申請發(fā)明人的優(yōu)化，因而特別適于本申請的方法。

第五方面，本申請?zhí)峁┩ㄟ^第一方面所述的方法制備的重折疊的野生型或突變型波形蛋白在制備用于檢測個體的生物樣本中抗波形蛋白抗體的試劑中的用途。

本申請還提供用于檢測個體的生物樣本中抗波形蛋白抗體的試劑，其包含通過第一方面所述的方法制備的重折疊的野生型或突變型波形蛋白。

如上文所述，類風濕性關節(jié)炎患者的血液中含有突變型波形蛋白，其包含三處精氨酸突變，并且蛋白表面的精氨酸脫氨瓜氨酸化。因此，將本申請所獲得的突變型波形蛋白在體外經(jīng)多肽精氨酸脫氨酶處理而瓜氨酸化后，可用于簡便的檢測血液或血清等組織液中人的抗突變型瓜氨酸化波形蛋白抗體含量，進而診斷類風濕性關節(jié)炎。

作為非限制性的實例，可以使用elisa酶聯(lián)免疫反應(例如參見實施例)。但是應當理解，本申請?zhí)峁┑墓习彼峄蛔冃筒ㄐ蔚鞍滓策m用于其他免疫檢測方法來檢測血液或血清等組織液中人的抗突變型瓜氨酸化波形蛋白抗體含量，包括比濁法、膠體金法、poct、熒光、化學發(fā)光標記法等。

因此，本申請?zhí)峁┝艘环N新的體外重折疊野生型或突變型波形蛋白的方法及其相應的試劑盒。通過該方法可以實現(xiàn)異源表達的突變型波形蛋白的體外正確重折疊，使得基于檢測抗瓜氨酸化突變型波形蛋白抗體的類風濕性關節(jié)炎的診斷變得簡便和低耗。

在一些實施方案中，可以使用多肽精氨酸脫氨酶pad處理本申請?zhí)峁┑闹卣郫B的突變型波形蛋白。在一些實施方案中，pad和突變型波形蛋白的質(zhì)量比1:5，在55℃反應3小時。由此獲得的瓜氨酸化突變型波形蛋白經(jīng)sds凝膠電泳進行質(zhì)控檢測顯示蛋白精氨酸被瓜氨酸化，在凝膠電泳中遷移速率減慢。

在一些實施方案中，可以用本申請所提供的瓜氨酸化突變型波形蛋白進行微量滴定板板的包被。在一些具體實施方案中，包被后的平板與臨床經(jīng)ccp(環(huán)瓜氨酸化多肽)確診的類風濕性關節(jié)炎病人和健康人的100倍稀釋血清(100μl，實際使用1μl血清)共孵育20分鐘，三次洗板后，用hrp(辣根過氧化物酶)偶聯(lián)的抗人血清二抗共孵育20分鐘，三次洗板后，用3,3′,5,5′-四甲基聯(lián)苯胺(tmb)做底物進行免疫酶聯(lián)反應。

實施例

以下實施例僅用于說明而非限制本申請范圍的目的。若未特別指明，實施例均按照常規(guī)實驗條件，如sambrook等的《分子克隆實驗手冊》(sambrookj&russelldw,molecularcloning:alaboratorymanual,2001)，或者按照制造廠商說明書建議的條件。

實施例1突變型波形蛋白基因的合成和質(zhì)粒的構建

利用全基因合成的方式合成突變型波形蛋白，所構建的質(zhì)粒圖譜的示意圖如圖1所示。seqidno:1和3顯示了野生型人波形蛋白和本申請的示例性突變波形蛋白氨基酸序列，其中seqidno:3與seqidno:1相比，人野生型波形蛋白的16和59位甘氨酸密碼子被突變?yōu)榫彼帷?/p>

seqidno:1所示序列來自于波形蛋白(智人，染色體10,grch38.p2；nc_000010，基因ncbi登錄號gi:578818565，蛋白登錄號：p08670)。在引入突變密碼子之外，還針對表達用宿主細胞大腸桿菌bl21(de3)對編碼序列進行密碼子優(yōu)化，同時考慮以下因素：規(guī)避eagi、ecori、hindiii、kpni、ndei、ncoi、noti、saci、xbai、xhoi酶切位點，避免產(chǎn)生影響基因表達的二級結構，優(yōu)化后的序列如seqidno:2所示。另外，為了便于純化，在突變波形蛋白編碼序列后添加了六個組氨酸標簽的編碼序列。由專業(yè)公司合成設計好的序列并裝載入pet28a(+)載體上，組建表達單元：t7啟動子-lac操縱子-mcv-his標簽-t7終止子。

實施例2突變型波形蛋白的重折疊

將實施例1中所構建的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌bl21(de3)中。

經(jīng)誘導表達后，大腸桿菌細胞用高壓均質(zhì)儀或超聲法凍融法等方法破碎后，低速離心(3000g)去除未破碎細胞和細胞碎片，再經(jīng)高速離心(14000g)，收獲沉淀，即為包涵體——不可溶的突變型波形蛋白。

將包涵體溶解于ph為8.0、包含300mmnacl、10mmdtt、1mmedta、以及8m尿素的緩沖液中，室溫下孵育10分鐘，即可溶解包涵體。14000g離心去除沉淀，獲得上清液。

利用透析法(基礎透析液為100mm磷酸緩沖液，ph8.0，含氧化型和還原型的谷胱甘肽混合物(比例為1：10))階段性降低上清液中尿素的濃度。透析過程分三個階段進行，分別使用含4m、2m和0m的透析液進行。最后在含0m尿素的溶液中完成突變型波形蛋白的重折疊，獲得含重折疊的突變型波形蛋白的磷酸緩沖液。

實施例3突變型波形蛋白重折疊構型的鑒定

將實施例2所獲得的經(jīng)重折疊的突變型波形蛋白的濃度調(diào)節(jié)為約0.2mg/ml，用圓二色譜法進行檢測(在室溫下，對2mm光徑的比色皿中0.08mg/ml的波形蛋白樣品進行180-600nm平面偏振光的掃描檢測，檢測左右旋圓偏振光的吸收系數(shù)差)，結果如圖2所示。

由圖2可見，突變型波形蛋白在208和222nm吸收系數(shù)差呈明顯負值，在192nm吸收系數(shù)呈正值，表明經(jīng)重折疊的突變型波形蛋白含α螺旋為主的二級結構，蛋白折疊后呈正確構型。

實施例4突變型波形蛋白與多肽精氨酸脫氨酶的作用

本實施例證實了由實施例2所獲得的經(jīng)重折疊后構型正確的突變型瓜氨酸化波形蛋白可與多肽精氨酸脫氨酶發(fā)生反應。

用實施例2所獲得的突變型波形蛋白與多肽精氨酸脫氨酶(pad)反應，pad和突變型波形蛋白的質(zhì)量比1:5，在55℃反應3小時(ph7.45mmcacl2溶液中)。隨后將產(chǎn)物進行電泳(12％聚丙烯酰胺凝膠電泳，200v80分鐘，考馬斯亮藍染色、脫色)。

瓜氨酸化突變型波形蛋白在脫氨瓜氨酸化后由于與sds結合力的改變，在凝膠電泳中顯示不同的遷移速率，具體如圖3所示。由此獲得的瓜氨酸化突變型波形蛋白經(jīng)sds凝膠電泳進行質(zhì)控檢測顯示蛋白精氨酸被瓜氨酸化，在凝膠電泳中遷移速率減慢。

實施例5瓜氨酸化突變型波形蛋白檢測抗瓜氨酸化突變型波形蛋白抗體

用實施例4獲得的瓜氨酸化突變型波形蛋白進行96孔板的包被，包被后的平板與臨床經(jīng)ccp(環(huán)瓜氨酸化多肽)確診的類風濕性關節(jié)炎病人和健康人的100倍稀釋血清(100μl，實際使用1μl血清)共孵育20分鐘，三次洗板后，用hrp(辣根過氧化物酶)偶聯(lián)的抗人血清二抗共孵育20分鐘。三次洗板后，用3,3′,5,5′-tetramethylbenzidine(tmb)做底物進行免疫酶聯(lián)反應。如圖4所示，18個病人血清陽性率為100％，6個健康人也都呈現(xiàn)陰性結果。由此證實，根據(jù)本申請方法制備的瓜氨酸化突變型波形蛋白能有效用于檢測類風濕性關節(jié)炎中的抗瓜氨酸化突變型波形蛋白抗體。

序列表

<110>深圳市倍諾博生物科技有限公司

<120>體外重折疊波形蛋白的方法及其應用

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<223>在野生型波形蛋白16和59位氨基酸殘基引入精氨酸突變，并進行密碼子優(yōu)化

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