本發(fā)明涉及從重度污染的細(xì)胞培養(yǎng)液中挽救細(xì)胞的方法。

背景技術(shù)：

細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)是分子生物學(xué)研究中的重要手段，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于生物學(xué)、醫(yī)學(xué)等多個(gè)領(lǐng)域。廣大醫(yī)務(wù)人員需要在工作之余進(jìn)行以細(xì)胞培養(yǎng)為基礎(chǔ)的科研活動(dòng)，雖然細(xì)胞室有嚴(yán)格的無菌消毒制度，但是由于醫(yī)院環(huán)境復(fù)雜，各種污染菌很難被徹底清除，很容易導(dǎo)致培養(yǎng)的正常細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞被污染。傳統(tǒng)的使用雙抗即青霉素和鏈霉素來預(yù)防細(xì)胞污染，此種方法已經(jīng)無法消除一些院內(nèi)頑固菌株的污染，細(xì)胞培養(yǎng)污染是指培養(yǎng)環(huán)境中侵入了對(duì)細(xì)胞生存有害的成分和造成細(xì)胞變異的異物，體外細(xì)胞污染最常見且造成的后果也最為嚴(yán)重的是微生物性污染，培養(yǎng)的細(xì)胞一旦遭到微生物污染，將具有不可逆轉(zhuǎn)性，輕則污染細(xì)胞廢棄，重則連帶污染培養(yǎng)箱內(nèi)的其他細(xì)胞，甚至整個(gè)實(shí)驗(yàn)室的環(huán)境，給科研工作帶來嚴(yán)重的損失和威脅。培養(yǎng)細(xì)胞污染最常見的為細(xì)菌污染，細(xì)菌污染特點(diǎn)為污染速度快，易被發(fā)現(xiàn)。細(xì)菌污染后，培養(yǎng)基1～2d就會(huì)變渾濁，對(duì)細(xì)胞生長影響明顯，細(xì)胞污染后不僅可導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)失敗，還可能得到偏離正確方向的結(jié)果，導(dǎo)致研究結(jié)果偏離，所以通常在遇到上述情況時(shí)研究人員會(huì)選擇丟棄細(xì)胞，重新復(fù)蘇凍存細(xì)胞再培養(yǎng)傳代。對(duì)于凍存較少或較難獲得的細(xì)胞株來說，上述操作存在巨大的浪費(fèi)，如果可以有一種方法能夠挽救重度污染的細(xì)胞，解除其污染狀態(tài)并使其能夠再次被利用，將給細(xì)胞的保存、傳代和培養(yǎng)帶來巨大的便利，并有效避免細(xì)胞資源的浪費(fèi)，為科研工作的順利進(jìn)行提供有力保障。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有產(chǎn)品中的不足，提供一種從重度污染的細(xì)胞培養(yǎng)液中挽救細(xì)胞的方法。

為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：

一種從重度污染的細(xì)胞培養(yǎng)液中挽救細(xì)胞的方法，包括如下步驟：

a、取1瓶含有被細(xì)菌重度污染的細(xì)胞培養(yǎng)液，丟棄除貼壁細(xì)胞以外的上層被污染的細(xì)胞培養(yǎng)液，用無菌pbs緩沖液沖洗3次并且吹打，然后丟掉無菌pbs緩沖液，然后加入500μg/ml的左氧氟沙星培養(yǎng)液250μl使得左氧氟沙星培養(yǎng)液覆蓋培養(yǎng)瓶底部，然后將培養(yǎng)瓶置于co2的培養(yǎng)箱培養(yǎng)；

b、取完成步驟a的培養(yǎng)體系,吸棄除貼壁細(xì)胞以外的液體，用無菌pbs緩沖液沖洗3次并且吹打，然后丟掉無菌pbs緩沖液，然后加入200μg/ml的左氧氟沙星培養(yǎng)液3ml,然后在co2的培養(yǎng)箱培養(yǎng)；

c、取完成步驟b的培養(yǎng)體系，吸棄除貼壁細(xì)胞以外的液體，用無菌pbs緩沖液沖洗3次并且吹打，然后丟掉無菌pbs緩沖液，然后加入100μg/ml的左氧氟沙星培養(yǎng)液3ml，然后在co2的培養(yǎng)箱培養(yǎng)；

d、取完成步驟c的培養(yǎng)體系，吸光培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)液，用無菌pbs緩沖液沖洗2次，加入體積為1ml到2ml的0.25％胰蛋白酶液，靜置2mim-10min，吸去胰蛋白酶液，加入常規(guī)培養(yǎng)液2ml，用吸管吸取瓶內(nèi)培養(yǎng)液，反復(fù)吹打瓶壁細(xì)胞，形成細(xì)胞懸液，把細(xì)胞懸液放入離心管中，然后在離心機(jī)內(nèi)進(jìn)行離心，離心后棄上清，得到細(xì)胞沉淀，然后將細(xì)胞沉淀和3ml常規(guī)培養(yǎng)液加入到培養(yǎng)瓶中，然后置于co2的培養(yǎng)箱進(jìn)行正常培養(yǎng)；；

所述常規(guī)培養(yǎng)液為含體積比為8％的胎牛血清的rpmi-1640培養(yǎng)基；所述細(xì)胞培養(yǎng)液為一株貼壁生長的鼻咽癌hk-1細(xì)胞培養(yǎng)液。

無菌pbs緩沖液的ph為7.4，其濃度為0.01mol/l。

所述co2的培養(yǎng)箱內(nèi)溫度為37℃,co2的濃度為5.0％。

所述重度污染的細(xì)胞培養(yǎng)液的活力為30％到39％。

所述離心機(jī)的轉(zhuǎn)速為1000rad/min。

本發(fā)明的有益效果如下：本發(fā)明采用了左氧氟沙星培養(yǎng)液來處理細(xì)胞培養(yǎng)液，對(duì)于重度污染的細(xì)胞中使用左氧氟沙星是最敏感的，可有效的阻止所有細(xì)菌dna的合成和復(fù)制而導(dǎo)致細(xì)菌死亡，使得重度污染的細(xì)胞恢復(fù)細(xì)胞活性，完成細(xì)胞傳代；本發(fā)明取料方便，操作步驟簡單，工作效率高。

附圖說明

圖1為重度球菌污染細(xì)胞情況圖；

圖2為重度桿菌污染細(xì)胞情況圖；

圖3為挽救的重度球菌污染細(xì)胞48小時(shí)后的細(xì)胞情況圖；

圖4為挽救的重度桿菌污染細(xì)胞48小時(shí)后的細(xì)胞情況圖；

圖5為正常培養(yǎng)細(xì)胞的情況圖。

下面結(jié)合說明書附圖對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案作進(jìn)一步說明：

一種從重度污染的細(xì)胞培養(yǎng)液中挽救細(xì)胞的方法，包括如下步驟：

a、取1瓶含有被細(xì)菌重度污染的細(xì)胞培養(yǎng)液，丟棄除貼壁細(xì)胞以外的上層被污染的細(xì)胞培養(yǎng)液，用無菌pbs緩沖液沖洗3次并且輕輕吹打，然后丟掉無菌pbs緩沖液，然后加入500μg/ml的左氧氟沙星培養(yǎng)液250μl使得左氧氟沙星培養(yǎng)液覆蓋培養(yǎng)瓶底部，然后將培養(yǎng)瓶置于co2的培養(yǎng)箱培養(yǎng)10min；

b、取完成步驟a的培養(yǎng)體系,吸棄除貼壁細(xì)胞以外的液體，用無菌pbs緩沖液沖洗3次并且吹打，然后丟掉無菌pbs緩沖液，然后加入200μg/ml的左氧氟沙星培養(yǎng)液3ml,然后在co2的培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h；

c、取完成步驟b的培養(yǎng)體系，吸棄除貼壁細(xì)胞以外的液體，用無菌pbs緩沖液沖洗3次并且輕輕吹打，然后丟掉無菌pbs緩沖液，然后加入100μg/ml的左氧氟沙星培養(yǎng)液3ml，然后在co2的培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h；

d、取完成步驟c的培養(yǎng)體系，吸光培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)液，用無菌pbs緩沖液沖洗2次，加入體積為1ml到2ml的0.25％胰蛋白酶液，靜置2mim-10min，吸去胰蛋白酶液，加入常規(guī)培養(yǎng)液2ml，用吸管吸取瓶內(nèi)培養(yǎng)液，反復(fù)吹打瓶壁細(xì)胞，形成細(xì)胞懸液，把細(xì)胞懸液放入離心管中，然后在離心機(jī)內(nèi)進(jìn)行離心，離心后棄上清，得到細(xì)胞沉淀，然后將細(xì)胞沉淀和3ml常規(guī)培養(yǎng)液加入到培養(yǎng)瓶中，然后置于co2的培養(yǎng)箱進(jìn)行正常培養(yǎng)；

所述常規(guī)培養(yǎng)液為含體積比為8％的胎牛血清的rpmi-1640培養(yǎng)基；所述細(xì)胞培養(yǎng)液為一株貼壁生長的鼻咽癌hk-1細(xì)胞培養(yǎng)液。。

無菌pbs緩沖液的ph為7.4，其濃度為0.01mol/l。

所述co2的培養(yǎng)箱內(nèi)溫度為37℃,co2的濃度為5.0％。

所述重度污染的細(xì)胞培養(yǎng)液的活力為30％到39％。

所述離心機(jī)的轉(zhuǎn)速為1000rad/min。

本發(fā)明將上述方法用于挽救重度球菌污染細(xì)胞、重度桿菌污染細(xì)胞。

圖1為重度球菌污染細(xì)胞情況圖，圖3為挽救重度球菌污染48小時(shí)后的細(xì)胞情況圖；圖5為正常細(xì)胞的情況圖。從圖3和圖5對(duì)比可以看出，圖3的污染程度和圖1相比，已經(jīng)大大完善，通過本發(fā)明的方法挽救重度球菌污染細(xì)胞，有效的阻止所有細(xì)菌dna的合成和復(fù)制而導(dǎo)致細(xì)菌死亡，使得重度污染的細(xì)胞恢復(fù)細(xì)胞活性，完成細(xì)胞傳代；

圖2為重度桿菌污染細(xì)胞情況圖，圖4為挽救重度桿菌污染48小時(shí)后的細(xì)胞情況圖，圖5為正常細(xì)胞的情況圖，由圖2、圖4、圖5對(duì)比可以得出，經(jīng)過48小時(shí)后，圖4的挽救重度桿菌污染48小時(shí)后的細(xì)胞情況圖與正常細(xì)胞的情況圖大體相同，可以得出圖4的細(xì)胞已經(jīng)是正常狀態(tài)了，可以得出本發(fā)明采用了左氧氟沙星培養(yǎng)液來處理細(xì)胞培養(yǎng)液，對(duì)于重度污染的細(xì)胞中使用左氧氟沙星是最敏感的，可有效的阻止所有細(xì)菌dna的合成和復(fù)制而導(dǎo)致細(xì)菌死亡，使得重度污染的細(xì)胞恢復(fù)細(xì)胞活性，完成細(xì)胞傳代；本發(fā)明取料方便，操作步驟簡單，工作效率高。

左氧氟沙星是喹諾酮類藥物中的一種，具有廣譜抗菌作用，抗菌作用強(qiáng)，對(duì)多數(shù)腸桿菌科細(xì)菌和部分葡萄球菌、肺炎鏈球菌、衣原體等也有良好的抗菌作用，其作用機(jī)制是通過抑制細(xì)菌dna解旋酶的活性，阻止細(xì)菌dna的合成和復(fù)制而導(dǎo)致細(xì)菌死亡。

由于細(xì)菌耐藥原因，傳統(tǒng)使用雙抗(青霉素和鏈霉素)預(yù)防細(xì)胞污染的方法已經(jīng)無法消除一些醫(yī)院內(nèi)頑固菌株的污染。但左氧氟沙星可有效的阻止細(xì)菌dna的合成和復(fù)制而導(dǎo)致細(xì)菌死亡，使得重度污染的細(xì)胞恢復(fù)細(xì)胞活性，完成細(xì)胞傳代；本發(fā)明取料方便，操作步驟簡單，工作效率高。

需要注意的是，以上列舉的僅是本發(fā)明的一種具體實(shí)施例。顯然，本發(fā)明不限于以上實(shí)施例，還可以有許多變形，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員能從本發(fā)明公開的內(nèi)容直接導(dǎo)出或聯(lián)想到的所有變形，均應(yīng)認(rèn)為是本發(fā)明的保護(hù)范圍。