本發(fā)明涉及植物抗除草劑和分子育種領域，具體涉及具有除草劑抗性的乙酰乳酸合酶突變蛋白及其應用。更具體地，涉及甘藍型油菜高抗除草劑的乙酰乳酸合酶編碼基因的分離、載體構建、培育高抗除草劑植物的方法。

背景技術：

油菜(brassicanapusl.)是我國第一大油料作物之一，為我國半數以上的人口提供食用油來源。近年來，隨著我國油菜種植方式由傳統(tǒng)的勞動密集型向規(guī)?；C械化生產發(fā)展，雜草有效防治已成為油菜全程機械化生產、輕簡化栽培的重要環(huán)節(jié)?；瘜W除草是控制農田雜草經濟有效手段。遺憾的是，由于缺少商業(yè)化的抗除草劑油菜品種，致使當前我國油菜生產化除面積非常有限。北美、歐洲等發(fā)達國家早以通過種植抗除草劑油菜實施化學除草?？钩輨┑钠贩N類型主要有孟山都公司的抗草甘膦油菜、拜耳公司的抗草胺膦油菜和巴斯夫公司的抗咪唑啉酮油菜。這些抗性基因受國際知識產權保護，在我國商業(yè)化種植需要交納昂貴的專利費，這將大幅度提高油菜生產成本，違背了種植抗除草劑作物的初衷。同時抗草甘膦油菜和抗草胺膦油菜均為轉基因品種，在中國尚未批準商業(yè)化種植，無法在生產上應用。而咪唑啉酮類除草劑在土壤中殘留期長，僅能在一熟制地區(qū)使用，在我國油菜主產區(qū)長江流域多熟制地區(qū)未能登記發(fā)放。因此，創(chuàng)制具有自主知識產權、適合我國生產需求的抗除草劑油菜新種質、挖掘抗性基因對油菜抗除草劑品種選育均具有十分重要的現實意義。

乙酰乳酸合酶(acetolactatesynthase，als)，也叫乙酰羥基酸合酶(acetohydroxyacidsynthase,ahas)，是植物和微生物3種支鏈氨基酸生物合成過程中的關鍵酶(mccourtja,dugglebyrg.aminoacids,2006,31:173–210)。如果此酶的活力受到抑制或者喪失，會導致植物纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸合成受阻，影響蛋白質合成，最終導致植物生長受阻、直至死亡，因此以als為作用靶標開發(fā)了多種類型的高效除草劑，如磺酰脲類(sulfonylureas，su)、咪唑啉酮類(imidazolinones，imi)等。這些除草劑統(tǒng)稱為als抑制劑類除草劑或als類除草劑，具有選擇性強、殺草譜廣、使用劑量低、對哺乳動物毒性小等優(yōu)點，在生產上得到廣泛應用，已成為繼草甘膦后的第2大類除草劑。然而，商業(yè)化的als類除草劑對雙子葉作物油菜具有強烈的生長抑制作用，使其僅能在水稻、小麥、玉米等單子葉作物中應用。為此，培育抗性油菜品種，拓寬現有als類除草劑的應用范圍，可有效解決這一難題。但是，由于缺少生具有產應用價值的抗性種質或基因，國內至今還沒有培育出商業(yè)化的抗性油菜品種。

als類除草劑的靶標als蛋白氨基酸位點的突變可以產生抗性植物，其中涉及氨基酸位點有gly95、ala96、ala122、pro171、pro196、pro197、ala205、asp376、trp537、trp548、trp552、trp557、trp563、trp574、ser621、ser627、ser638、ser653、gly654、val669等(以模式植物擬南芥的als氨基酸位置計算)，這在多種農作物(包括水稻、玉米、小麥、向日葵等)、模式植物擬南芥和雜草中均有報道(tanetal.,2005,pestmanagsci,61:246-257)。研究發(fā)現，抗性植物的抗性效應取決于als上氨基酸突變的位置、突變后的氨基酸種類以及突變氨基酸的數目(yuetal.,2010,jexpbotany,61:3925-3934)。同時不同遺傳背景下相同位置的氨基酸變異產生的除草劑抗性效應也會存在顯著差異，這很可能是由于不同遺傳背景下植物中的不同微效基因參與了除草劑抗性的協(xié)同作用。所以，對于復雜遺傳背景的作物(如油菜)，具有除草劑高度抗性的突變體及其確實能起決定性作用的物質(如蛋白、基因等)目前還沒有理論來定向設計出，只能依賴于科研人員艱苦實踐而獲得，尤其是依賴長期篩選與鑒定，并且憑借運氣才能獲得。對于異源四倍體作物油菜來說，情況更為復雜，我們很難提前預測als蛋白氨基酸位點的突變是否會產生除草劑抗性，抗性突變位點的抗性水平是否具有育種利用價值，抗性種質或基因能否適合生產實用價值。

技術實現要素：

發(fā)明目的：本發(fā)明所要解決的技術問題是提供具有除草劑抗性的乙酰乳酸合酶突變體。

本發(fā)明還要解決的技術問題是提供了編碼該蛋白的核酸以及表達盒、載體和細胞等。

本發(fā)明還要解決的技術問題是提供了獲得具有除草劑抗性的植物的方法和應用。

本發(fā)明還要解決的技術問題是提供了判斷植物是否采用本發(fā)明方法獲得的鑒定方法。

本發(fā)明人正是經過長期而艱苦的研究實踐，憑借運氣偶然地利用苯磺隆在油菜n131的兩輪ems誘變的突變體庫中發(fā)現了一株高抗除草劑種質，該種質攜帶的乙酰乳酸合酶突變體屬于雙基因雙位點突變，編碼的蛋白具有對除草劑的高度抗性，從而賦予油菜具有對除草劑高度的抗性。截至本專利申請之前，此種類型油菜突變體在國內外均未見公開報道。

本發(fā)明所述的乙酰乳酸合酶突變體與其他野生型乙酰乳酸合酶相比具有雙基因雙位點突變，將編碼該突變酶的基因轉育或轉化到植物中，可使油菜、擬南芥等植物具有高抗als抑制劑類除草劑的特性。

技術方案：為解決上述技術問題，本發(fā)明采用的技術方案如下：本發(fā)明提供了使得植物具有除草劑抗性的als突變蛋白，其在als1氨基酸序列的第182位氨基酸由脯氨酸變?yōu)榱涟彼幔赼ls3的第556位氨基酸由色氨酸變?yōu)榱涟彼?。目前還沒有報道表明，在來自甘藍型油菜基因組中上述的雙基因雙突變，會使得油菜具有als抑制劑類除草劑高度抗性。

優(yōu)選本發(fā)明的第一方面的als1蛋白帶有pro182leu突變，als3蛋白帶有trp556leu，除了本發(fā)明具有的實施方式所述的突變植株篩選或擴增方法之外，在蛋白質序列已知的情形下，本領域技術人員有能力通過改變已知蛋白質的編碼基因序列并將其導入載體，就可以制備出取代、添加或缺失了氨基酸殘基的蛋白質，這些方法均為常規(guī)手段。在本發(fā)明的具體實施方式中，具有除草劑抗性的als蛋白，其als1氨基酸序列如seqidno：2所示，als3氨基酸序列如seqidno：4所示。該蛋白經過證實為對su類除草劑苯磺隆(2-[n-(4-甲氧基-6-甲基-1,3,5-三嗪-2-基)-n-甲基氨基甲酰胺基磺?；鵠苯甲酸甲酯)和甲基二磺隆(甲基-2[3-(4，6-＝甲氧基嘧啶-2-基)一脲基磺酰基l-4-甲磺?；被郊姿狨?不敏感的乙酰乳酸合酶。

本發(fā)明的第二方面提供了核酸，其編碼本發(fā)明第一方面的蛋白質。在本發(fā)明中，核酸可以是dna、rna，其中優(yōu)選為dna。在已知曉所編碼蛋白序列或核酸序列的前提下，通過常規(guī)的密碼子對應關系和宿主表達頻率，運用pcr方法、dna重組法或人工合成的方法，本領域技術人員有能力獲得并優(yōu)化編碼本發(fā)明第一方面的蛋白質的核酸。一旦獲得該核酸，就可以將其克隆入載體，再轉化或轉染入相應的細胞，然后通過常規(guī)的宿主細胞進行增殖，從中分離得到大量的核酸。優(yōu)選本發(fā)明第二方面的核酸，其als1核苷酸序列如seqidno：1所示，als3核苷酸序列如seqidno：3所示。具體的，本發(fā)明的dna序列，其als1核苷酸序列在第+545處發(fā)生點突變，核苷酸由c突變?yōu)閠，其als3核苷酸在第+1667處發(fā)生點突變，核苷酸由g變?yōu)閠。

此外，本發(fā)明突變前的野生型甘藍型油菜為野生型油菜品系n131，在甘藍型油菜基因組內共存在3個具有功能的als基因(genebank登錄號z11524、z11525、z11526)。

本發(fā)明的第三方面的內容包括表達盒、重組載體或細胞，其含有上述的第二方面的核酸。

本發(fā)明第四方面內容還包括上述的具有除草劑抗性的als蛋白、核酸、表達盒、重組載體或細胞在植物抗除草劑方面的應用。

其中，上述植物為油菜或擬南芥等。

本發(fā)明第五方面的內容還包括獲得具有除草劑抗性的植物的方法，包括如下步驟：

1)使植物包含本發(fā)明所述的核酸；或

2)使植物表達所述的蛋白。

其中，上述的方法，包括轉基因、雜交、回交或無性繁殖等步驟。

本發(fā)明第六方面的內容包括鑒定植物的方法，其中植物是包含所述的核酸的植物、表達所述的蛋白的植物或所述的方法獲得的植物，具體包括以下步驟：

1)測定所述植物是否包含所述的核酸；或，

2)測定所述植物是否表達所述的蛋白。

本發(fā)明內容還包括具體地將本發(fā)明編碼乙酰乳酸合酶的基因通過雜交轉育到野生型油菜中，在轉育的油菜和野生型油菜苗期噴施als抑制劑類除草劑，處理3周后，野生型油菜植株全部死亡，而轉育含有本發(fā)明編碼乙酰乳酸合酶的突變基因油菜植株全部存活；將編碼乙酰乳酸合酶的基因轉化到擬南芥中，在轉基因擬南芥和野生型擬南芥苗期噴施als抑制劑類除草劑，處理3周后，野生型擬南芥植株全部死亡，而轉基因擬南芥植株全部存活。因此，含有本發(fā)明編碼乙酰乳酸合酶基因的植物具有抗als抑制劑類除草劑的特性。

有益效果：與現有技術相比，本發(fā)明具有下列優(yōu)點和效果：

1)本發(fā)明是在我國油菜中首次發(fā)現的雙基因雙突變位點的甘藍型油菜高抗als抑制劑類除草劑乙酰乳酸合酶突變體，本發(fā)明的乙酰乳酸合酶突變體編碼基因的核酸序列，可以顯著提高其它對als抑制劑類除草劑無抗性的植物對als抑制劑類除草劑的耐受性；

2)在田間噴施als抑制劑類除草劑苯磺隆甲基二磺隆的實驗結果表明，含有本發(fā)明的als突變蛋白的油菜ds3在3-4葉期施用16倍的雜草防治推薦使用濃度(苯磺隆為360ga.i.ha^–1、甲基二磺隆為180ga.i.ha^–1)后，植株仍然正常生長發(fā)育和結實，而野生型油菜在3-4葉期施用1倍的雜草防治推薦使用濃度(苯磺隆為22.5ga.i.ha^–1、甲基二磺隆為11.25ga.i.ha^–1)3周后表現為整株死亡。

附圖說明

圖1在油菜田中發(fā)現了本發(fā)明的抗als抑制劑類除草劑油菜突變植株ds3；

圖2不同濃度的苯磺隆對野生型和突變型的als酶活性體外抑制；

圖3不同濃度的甲基二磺隆對野生型和突變體的als酶活性體外抑制；

圖4pcr擴增油菜als1基因；泳道1，dna分子量標準，片段從小到大依次為500bp、800bp、1200bp、2000bp、3000bp、4500bp；泳道2至4為n131的dna，泳道5至7為em28的dna，泳道8至10為ds3的dna，每個樣品3個重復；泳道11為對照水。

圖5pcr擴增油菜als2基因；泳道1，dna分子量標準，片段從小到大同圖4；泳道2至4為n131的dna，泳道5至7為em28的dna，泳道8至10為ds3的dna，每個樣品3個重復；泳道11為對照水；

圖6pcr擴增油菜als3基因；泳道1，dna分子量標準，片段從小到大同圖4；泳道2至4為n131的dna，泳道5至7為em28的dna，泳道8至10為ds3的dna，每個樣品3個重復；泳道11為對照水。

具體實施方式

下面將結合實施例對本發(fā)明的實施方案進行詳細描述，但是本領域技術人員將會理解，下列實施例僅用于說明本發(fā)明，而不應視為限定本發(fā)明的范圍。實施例中未注明具體條件者，按照常規(guī)條件或制造商建議的條件進行。所用試劑或儀器未注明生產廠商者，均為可以通過市購獲得的常規(guī)產品。

實施例1：高抗除草劑的甘藍型油菜乙酰乳酸合酶突變體的創(chuàng)制過程

油菜播種前，對野生型油菜品系n131(公知公用，見浦惠明等，江蘇農業(yè)學報，2010，26(6)：1432-1434)進行甲磺酸乙酯(ems)誘變處理，具體處理過程如下：播種前1天，將0.5kg的n131種子裝入尼龍網袋，放入盛滿清水的容器中浸泡12h，將尼龍網袋掛于高處待水份基本瀝干后，置于0.4％ems溶液(v/v)中處理8h，將處理種子用流水沖洗4h后，再次將尼龍網袋掛于高處將水瀝干后，立即將種子(mo)撒播于具有隔離條件的6×50m隔離大棚內。當年春，油菜開花后用尼龍網罩隔離保純，5月底收獲成熟的m1種子。10月初，采用集團混合法將m1種子播種于具有隔離條件的6×50m隔離大棚內。次年春油菜開花后用尼龍網罩隔離保純，夏收m2代種子。秋播m2代，待菜苗長至3-4葉期時，噴施磺酰脲類除草劑苯磺隆(2倍的雜草防治推薦使用濃度)進行抗除草劑突變體的篩選。處理3周后，田間發(fā)現有20多株菜苗存活，其余油菜均死亡。待存活菜苗生長至5-6葉期后，移至油菜育種大田，套袋自交收獲得m3種子。在光照培養(yǎng)室內，對m3種子苗期進行抗性效應鑒定，發(fā)現其中編號為em28(保藏編號：cgmccno.14299)的株系抗性穩(wěn)定，且其他性狀表現與野生型n131相似。我們將該em28植株種子于2017年06月19日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(cgmcc)，地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，郵編：100101，保藏編號為cgmccno.14299，該菌株的分類命名為：甘藍型油菜(brassicanapus)。遺傳研究發(fā)現，em28的抗性性狀是由1個核基因控制的不完全顯性性狀，當em28中的抗性基因表現純合型時，它的抗性效應是苯磺隆除草劑雜草防治的推薦使用濃度3-4倍，因為在4倍的雜草防治推薦使用濃度處理后，em28葉片表現出生長受到抑制癥狀(表1)。后續(xù)在雜交油菜品種選育中研究發(fā)現，當通過常規(guī)育種手段將em28的抗性性狀導入到cms恢復系中，然后與不育系進行配組，選育的抗性雜交組合f1抗性基因型表現為雜合型，其抗性效應是除草劑雜草防治推薦使用濃度1.5-2倍之間，這造成選育的抗除草劑雜交油菜品種在生產上推廣應用存在較大風險，因為當農戶使用除草劑進行田間雜草防治時，如果除草劑噴施濃度使用不當或噴施不均勻極易導致實際使用的除草劑濃度超出雜種f1的抗性效應范圍，造成油菜產生除草劑藥害癥狀。因此，em28的抗性性狀在抗除草劑油菜品種選育中的應用具有一定的局限性。

為此，期望獲得更高抗性效應的抗除草劑油菜種質或資源才能滿足抗除草劑油菜品種選育的需求。我們擴繁了em28種子，再次對抗性材料em28種子進行ems誘變并結合高濃度的除草劑篩選，田間除草劑噴施濃度為8倍的苯磺隆雜草防治推薦使用濃度，具體ems誘變流程和篩選、鑒定過程同上。我們很幸運的發(fā)現，高濃度的苯磺隆除草劑處理3周后，編號為ds3的菜苗田間長勢良好(圖1)，待植株種子成熟后，收獲保存。至此，我們獲得了高抗除草劑的甘藍型油菜乙酰乳酸合酶突變體ds3，我們將該甘藍型油菜乙酰乳酸合酶突變體ds3于2017年06月19日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(cgmcc)，地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，郵編：100101，保藏編號為cgmccno.14298，該菌株的分類命名為：甘藍型油菜(brassicanapus)。

實施例2：除草劑抗性鑒定

抗性鑒定試驗分別采用田間鑒定和溫室盆栽試驗兩種方法對抗性突變體em28、ds3的抗性效應進行鑒定與評價。油菜田間鑒定試驗在江蘇省農業(yè)科學院油菜隔離繁殖區(qū)進行，溫室盆栽試驗在恒溫培養(yǎng)室中進行。待處理對照材料野生型n131(公知公用，見浦惠明等，江蘇農業(yè)學報，2010，26(6)：1432-1434)、本發(fā)明的em28、ds3播種出苗生長至3-4葉苗齡，分別噴施不同濃度的su類除草劑苯磺隆(2-[n-(4-甲氧基-6-甲基-1,3,5-三嗪-2-基)-n-甲基氨基甲酰胺基磺酰基]苯甲酸甲酯)甲基二磺隆(甲基-2[3-(4，6-＝甲氧基嘧啶-2-基)一脲基磺酰基l-4-甲磺?；被郊姿狨?。噴藥3周后，根據菜苗的生長表現確定它們的在不同用藥濃度下的抗性效應，結果如表1所示。從表1可以看出，抗性材料ds3對su類除草劑苯磺隆和甲基二磺隆抗性最強，抗性效應濃度在除草劑雜草防治的推薦使用濃度12-16倍之間，遠遠超過em28對以上兩種除草劑的抗性效應，em28抗性效應濃度在除草劑雜草防治的推薦使用濃度3-4倍之間。因此，我們認為高抗材料ds3比em28在油菜育種中更具有利用價值。

表1不同濃度的除草劑處理3個油菜后的抗性表現

表注：1x代表除草劑雜草防治的推薦使用濃度1倍，依次類推，其中苯磺隆除草劑雜草防治的推薦使用濃度1倍是22.5ga.i.ha^–1，甲基二磺隆除草劑雜草防治的推薦使用濃度1倍是11.25ga.i.ha^–1；r代表除草劑處理后油菜植株生長良好，無藥害表現；r^-代表除草劑處理后油菜植株生長受到一定的抑制，但是植株不會死亡，能正常結實；s代表除草劑處理后油菜植株生長受到嚴重抑制，藥害表現明顯，最終植株死亡(以下同)。

實施例3：als酶活性離體測定

ds3在表型上表現對su類除草劑具有高度抗性，所以選用這類除草劑在體外進行酶活性離體測定試驗，比較ds3、em28和原始野生型n131對除草劑的抗性差異。測定參照singh等的方法(singhbk,etal.,analyticalbiochemistry,1988,171:173-179)。具體的，分別取0.2g葉片樣品，在研缽中用液氮研磨粉碎，將磨好的樣品加入含有4.5ml的初酶提取液[100mmk2hpo4、0.5mmmgcl2、0.5mm硫胺素焦磷酸(tpp)、10μm黃素腺嘌呤雙核苷酸(fad)、10mm丙酮酸鈉、10％(v/v)丙三醇、1mm二硫蘇糖醇、1mm苯甲基磺酰氟(pmsf)、0.5％(w/v)聚乙烯基吡咯烷酮]中，于4℃、12000rpm離心20min。取上清液，加入等體積的飽和(nh4)2so4，于冰上放置30min后，4℃、12000rpm離心20min，棄上清液，加入1ml初酶提取液，振蕩溶解，獲得每個樣品的als酶液。取200μl提取好的als酶液，分別加入360μl50mmhepes-naoh(ph＝7.5)酶反應緩沖液、80μl20mmtpp、80μl200μmfad、80μl2m丙酮酸鈉+200mmmgcl2和不同濃度的苯磺隆和甲基二磺隆除草劑，混勻、放入37℃反應1h后，加入160μl3mh2so4終止反應，60℃脫羧15min。然后加入780μl5.5％α-萘酚溶液和780μl0.55％肌酸，65℃顯色15min，在530nm比色，讀取吸光值，根據標準曲線計算酶活性。將未加入除草劑對照的als酶活性分別記為100％，計算苯磺隆和甲基二磺隆除草劑對ds3、em28和原始野生型n131的als酶活性的影響。

結果如圖2和3所示，當把su類除草劑苯磺隆和甲基二磺隆添加到酶促反應中，與野生型n131比較，ds3和em28的als酶都表現為對除草劑具有抗性，但它們對除草劑的抗性存在顯著差異，表現為隨除草劑濃度增加二者下降的趨勢不同。如當苯磺隆除草劑濃度為10μmoll^-1時，ds3中的als酶活性為對照(未用除草劑處理)的83％左右，em28的als酶活性是對照的51％左右；當苯磺隆除草劑濃度為20μmoll^-1時，ds3中的als酶活性是對照的80％左右，此時em28的als酶活性僅是對照的46％左右；當甲基二磺隆除草劑濃度達到10μmoll^-1時，ds3的als酶活性是對照的72％左右，而此時em28的als酶活性下降到44％左右。以上結果表明，突變體ds3中的als酶對除草劑的敏感性顯著低于em28中als酶，從而賦予了ds3比em28更高的除草劑抗性。

實施例4：als基因克隆

在甘藍型油菜基因組內共存在3個具有功能的als基因(genebank登錄號z11524、z11525、z11526)，根據這3個als基因序列，分別設計3對pcr引物。als1引物1：gtggatctaactgttcttga和引物2：agagatgaagctggtgatc。als2引物1：gagtgttgcgagaaattgctt和引物2：ttgattattctatgctctcttctg。als3引物1：atggttagatgagagagagagag和引物2：

ggtcgcactaagtactgagag。采用ctab法提取葉片基因組dna(胡茂龍等，中國油料作物學報，2011，33(4):331-337)，pcr克隆野生型與突變體als1、als2和als3基因。按東洋紡(上海)生物科技有限公司高保真性dna聚合酶kod-plus試劑盒說明書配制50μlpcr反應體系。在mjresearchptc-200型pcr儀上進行擴增，反應程序為94℃預變性5min；94℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸2.5min，共35個循環(huán)。產物經平末端加a后，在1.2％(v/w)瓊脂糖凝膠電泳分離后(圖4、圖5、圖6)，用北京tiangen公司生產的瓊脂糖凝膠dna回收試劑盒(目錄號：dp209)純化回收，連接于克隆載體peasy-t1(購自北京transgen生物技術有限公司)，熱激轉化dh5α。通過藍白斑篩選和菌落pcr鑒定，將陽性克隆送于南京金斯瑞生物有限公司測序。測序結果表明，突變體ds3中als2基因未發(fā)生任何堿基突變，但als1和als3基因都發(fā)生了點突變，其中als1基因的第+545處發(fā)生點突變，核苷酸由c突變?yōu)閠，核苷酸序列如seqidno：1所示，導致相應編碼蛋白的第182位脯氨酸(p)突變?yōu)榱涟彼?l)，氨基酸序列如seqidno：2所示；als3基因的第+1667處發(fā)生點突變，核苷酸由g變?yōu)閠，核苷酸序列如seqidno：3所示，導致相應編碼蛋白的第556位由色氨酸(w)變?yōu)榱涟彼?l)，氨基酸序列如seqidno：4所示，即突變株ds3中在als1的pro182leu和als3的trp556leu發(fā)生雙基因的氨基酸替換，比em28多了1處位點突變(p182l)。

實施例5：乙酰乳酸合酶突變體編碼基因在野生型油菜中的表達分析

應用雜交轉育方法將該ds3中的乙酰乳酸合酶突變體編碼基因導入其它對als類除草劑無抗性的野生型油菜品種或品系。過程簡言之，用ds3分別與恢復系3075r(浦惠明等，2002，江蘇農業(yè)科學，4：33-34)和3018r(浦惠明等，1999，江蘇農業(yè)科學，6：32-33)配制雜交組合，當年收獲2個f1種子在油菜春化/培養(yǎng)室進行加代種植，花期選生長一致的單株套袋自交，收獲f2種子在南京江蘇省農科院溧水植物科學基地播種，每個f2群體播種20行，苗期取f2群體單株葉片，提取dna，pcr擴增als1和als3基因，產物按實例4步驟純化、回收、測序。根據測序結果，篩選具有ds3中的乙酰乳酸合酶突變體編碼基因的純合型f2單株，即該單株的als1序列如seqidno：2所示，als3的核苷酸序列如seqidno：4所示。于油菜花期對每個入選的f2單株套袋自交，收獲f3種子。按實施例2方法，采用田間鑒定和溫室盆栽試驗對f3苗期抗性進行鑒定。結果發(fā)現，經過濃度在12x以下的苯磺隆和甲基二磺隆除草劑處理3周后，所有入選f3菜苗生長狀態(tài)良好，16x處理后的油菜生長受到一定的抑制，表現為生長受抑，但植株不會死亡，而所有對照材料全部死亡，表明攜帶ds3中的乙酰乳酸合酶突變體的編碼基因純合型f3株系對兩種als類除草劑抗性效應濃度在除草劑雜草防治的推薦使用濃度12-16倍之間(表2)。

表2不同濃度的除草劑處理入選的油菜f3株系后的抗性表現

實施例6：乙酰乳酸合酶突變體編碼基因在擬南芥中的表達

采用常規(guī)的農桿菌介導法將上述ds3中兩個突變酶的編碼基因分別轉入野生型擬南芥植株，然后通過兩個轉基因系雜交，在后代中選擇具有ds3中兩個突變酶的編碼基因同時純合的轉基因擬南芥株系進行除草劑表型鑒定。過程簡言之，根據als1和als3基因序列分別設計特異引物，als1引物3：

5'cgcggtacctcatctctctctcctctaacc3'(下劃線序列為kpni酶識別位點，以下同)和als1引物4：5'cgcactagtgatcaccagcttcatctctc3'(下劃線序列為spei酶識別位點，以下同)；als3引物3：

5'cgcggtaccctctctctctctcatctaaccat3'和als3引物4：

5'cgcactagtctctcagtacttagtgcgacc3'。以突變體ds3的基因組dna為模板，pcr擴增獲得目的突變酶編碼基因p182l和w556l。pcr產物按實施例4方法經回收、克隆、測序，獲得帶有突變酶編碼基因的重組t載體。用kpni和spei雙酶切t載體獲得含目的基因的片段回收、連接到同樣經雙酶切的pcambia1390載體上(購自澳大利亞cambi公司)，得到重組的植物表達載體。將構建好的重組載體轉化大腸桿菌dh5α，提取質粒用于酶切和測序檢測。將檢測表明正確的含有目的基因的重組載體轉化農桿菌eh105α菌株，提取質粒進行pcr和酶切鑒定。培養(yǎng)獲得的重組菌株，利用農桿菌侵染花序法(flowerdipping)轉化擬南芥。t0代中在培養(yǎng)基上經抗生素篩選后，獲得t1代植株移栽到盆缽中，置于人工培養(yǎng)箱中生長，pcr篩選、擴繁獲得每個基因的t3代的純合轉基因株系。在t3代株系花期配制雜交組合，收獲2個f1種子，pcr篩選、擴繁獲得具有ds3中突變酶編碼基因純合轉基因株系f3。按實施例2方法，采用田間鑒定和溫室盆栽試驗對f3苗期抗性進行鑒定。經過濃度在12x以下的苯磺隆和甲基二磺隆除草劑處理3周后，所有轉基因擬南芥f3幼苗生長狀態(tài)良好，16x處理后的幼苗生長受到一定抑制，但是植株不會死亡，而所有未轉基因的擬南芥(wt)幼苗全部死亡，表明攜帶ds3中乙酰乳酸合酶突變體的編碼基因純合型轉基因擬南芥f3家系對兩種su類除草劑抗性效應濃度在除草劑雜草防治的推薦使用濃度12-16倍之間(表3)。

表3不同濃度除草劑處理的轉基因擬南芥雜交的f3株系后的抗性表現

盡管本發(fā)明的具體實施方式已經得到詳細描述，本領域技術人員將會理解，根據已經公開的所有教導，可以對那些細節(jié)進行各種修改和替換，這些均在本發(fā)明的保護范圍內。本發(fā)明的全部范圍由所附權利要求及其任何等同物給出。

sequencelisting

<110>江蘇省農業(yè)科學院

<120>具有除草劑抗性的乙酰乳酸合酶突變蛋白及其應用

<130>sg20170623001

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