本發(fā)明涉及一株分泌潮霉素b特異性單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株zxl-1及其應(yīng)用，涉及潮霉素b單克隆抗體的制備方法，以及動(dòng)物源食品中潮霉素b的間接競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫檢測(cè)方法的建立，屬于免疫檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
潮霉素b，即hygromycinb（hb）是一種由吸水鏈霉菌產(chǎn)生的氨基糖苷類抗生素，它可以通過(guò)抑制蛋白質(zhì)合成殺死細(xì)菌、真菌和高級(jí)真核細(xì)胞。具有一定的驅(qū)蟲活性，在豬禽飼料中長(zhǎng)期添加，具有良好的驅(qū)線蟲效果。
動(dòng)物源性食品中獸藥殘留問(wèn)題是近年來(lái)國(guó)際社會(huì)研究的公共衛(wèi)生熱點(diǎn)一，受到人們的普遍關(guān)注。由于臨床已證明hb具有耳毒性和腎毒性，因此歐盟規(guī)定禁止使用hb作為家畜的生長(zhǎng)促進(jìn)劑。鑒于這類抗生素在臨床應(yīng)用方面的副作用及易使細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性，美國(guó)食品與藥品管理局（foodanddrugadministration）對(duì)動(dòng)物源性食品中氨基糖苷類獸藥殘留也極為關(guān)注。我國(guó)農(nóng)業(yè)部235公告中規(guī)定hb可做畜禽類動(dòng)物治療用藥，但不得在相關(guān)動(dòng)物性食品中檢出。
目前，hb的最常用的檢測(cè)方法為高效液相色譜法等儀器檢測(cè)方法，該種檢測(cè)方法耗時(shí)長(zhǎng)，操作需要掌握相關(guān)的專業(yè)技術(shù)，樣品前處理繁瑣等。而免疫分析方法具有低成本、高通量、高靈敏、對(duì)技術(shù)人員要求低等特點(diǎn)，因此適用于大量樣品的現(xiàn)場(chǎng)快速篩查。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的是提供一種能夠分泌潮霉素b特異性單克隆抗體的細(xì)胞株制備方法，建立檢測(cè)潮霉素b的免疫學(xué)檢測(cè)方法。
本發(fā)明的技術(shù)方案：一株分泌潮霉素b特異性單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株zxl-1，已保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，簡(jiǎn)稱cgmcc，保藏編號(hào)cgmccno.13097，保藏日期2016年10月31日，分類命名單克隆細(xì)胞株。
潮霉素b特異性單克隆抗體，其是由所述保藏編號(hào)cgmccno.13097的雜交瘤細(xì)胞株zxl-1分泌產(chǎn)生。
所述潮霉素b特異性單克隆抗體的應(yīng)用，用于動(dòng)物源食品中潮霉素b的快速免疫檢測(cè)。
提供的潮霉素b雜交瘤細(xì)胞株的制備方法基本步驟為：
1、免疫原和包被原的制備：采用戊二醛法，將hb與牛血清蛋白（bsa）偶聯(lián)得到的免疫原h(huán)b-bsa；采用碳化二亞胺法，與雞蛋清白蛋白（ova）偶聯(lián)得到的hb-ova作為包被抗原。
hb-bsa的具體合成步驟如下：
a、稱取10mghb，溶于1ml0.1mph7.4的磷酸鹽緩沖溶液中，再逐滴加入稀釋10倍后的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為25%的戊二醛溶液100μl，室溫?cái)嚢?0min后，得到活化液；
b、稱取50mgbsa，溶于5ml0.1mph9.0碳酸鹽緩沖溶液中，在不斷攪拌下，逐滴加入活化液，室溫下，反應(yīng)3～4h后，將反應(yīng)液用0.01mph7.4的磷酸鹽緩沖液透析，即可得到hb-bsa。
hb-ova的具體合成步驟如下：
a、稱取20mgova，溶于3ml0.1mph6.0的一水合2-（n-嗎啡啉）乙磺酸（mes）溶液中；不斷攪拌下，先加入24mgn-羥基琥珀酰亞胺，15min后，再加入31mg1-乙基-3-（3-二甲基氨基丙基-碳二亞胺）；在室溫下，攪拌2h，得到活化液；
b、稱取5mghb，溶于1ml0.1mph9.0碳酸鹽緩沖溶液中；在不斷攪拌下，逐滴加入活化液，室溫下，反應(yīng)4h后，將反應(yīng)液用0.01mph7.4的磷酸鹽緩沖液透析，即可得到hb-ova。
2、動(dòng)物免疫與效價(jià)測(cè)定：采用小劑量短周期方案免疫健康balb/c雌性小鼠，首次免疫用100μghb-bsa與等量弗氏完全佐劑混勻后進(jìn)行皮下注射，間隔3周后，再用100μghb-bsa與等量弗氏不完全佐劑加強(qiáng)免疫，此后每隔3周用半量hb-bsa加強(qiáng)免疫一次；沖刺免疫劑量減半，與等體積的生理鹽水混合后采用腹腔免疫，用hb與雞蛋清白蛋白（ova）的偶聯(lián)物hb-ova作為包被抗原，通過(guò)間接競(jìng)爭(zhēng)elisa檢測(cè)血清效價(jià)和抑制；
其具體elisa程序如下：
（1）包被：將包被抗原用0.05mph9.6碳酸鹽緩沖液梯度稀釋，100μl/孔，37℃孵育2h；
（2）洗滌：將板內(nèi)溶液傾去，每孔注入200μlpbst溶液，置于搖床上振蕩3min，甩干，洗滌3次；以下洗滌方法相同；
（3）封閉：拍干后，加入200μl/孔封閉液，37℃孵育2h；洗滌后烘干備用；
（4）加樣：酶標(biāo)板上半部分加入0.01mph7.4磷酸鹽緩沖溶液，50μl/孔（上半部分稱為0標(biāo)），下半部分加入不同濃度的用0.01mph7.4磷酸鹽緩沖溶液稀釋的hb標(biāo)準(zhǔn)品，將抗血清從1:1000開始梯度稀釋，50μl/孔（下半部分稱為加標(biāo)），上下部分對(duì)應(yīng)加入不同稀釋梯度包被抗原的孔中，37℃孵育30min；充分洗滌后，加入1:3000稀釋的鼠二抗，100μl/孔，37℃孵育30min，洗滌后拍干；
（5）顯色：將酶標(biāo)板取出，充分洗滌后，每孔加入100μl的顯色液（tmb與底物液體積比例1:5），37℃避光反應(yīng)15min；
（6）終止和測(cè)定：取出酶標(biāo)板，每孔加入50μl終止液（2mol/l的硫酸）終止反應(yīng)，然后用酶標(biāo)儀測(cè)定各孔的吸光值od450；
（7）結(jié)果判讀：以od值大于或等于陰性血清對(duì)照孔的2.1倍（即p/n≥2.1）所對(duì)應(yīng)的血清最高稀釋倍數(shù)即為血清的elisa效價(jià)；上下部分對(duì)照，加標(biāo)od值為0標(biāo)一半的即是所加的標(biāo)準(zhǔn)品濃度；
3、細(xì)胞融合與篩選：在沖擊免疫三天后，按照常規(guī)peg（聚乙二醇，分子量為1450）方法進(jìn)行細(xì)胞融合，具體步驟如下：
a、無(wú)菌取小鼠脾臟，研磨并通過(guò)200目細(xì)胞篩網(wǎng)得到脾細(xì)胞懸液，并進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)；
b、收集sp2/0細(xì)胞，懸浮于rpmi-1640基礎(chǔ)培養(yǎng)液中，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)；
c、將脾細(xì)胞和sp2/0細(xì)胞按照10:1（數(shù)量比）的比例混合，離心后用50%peg融合，時(shí)間1min，之后按照從慢到快，加入rpmi-1640基礎(chǔ)培養(yǎng)液，離心后懸浮于含20%胎牛血清、2%的50×hat的rpmi-1640篩選培養(yǎng)液中，加到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，置于37℃、5%co2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。在細(xì)胞融合的第三天對(duì)融合細(xì)胞進(jìn)行rpmi-1640篩選培養(yǎng)液半換液，第6天用含20%胎牛血清、1%的100×ht的rpmi-1640過(guò)渡培養(yǎng)液進(jìn)行全換液，在第9天取細(xì)胞上清進(jìn)行篩選；
篩選分兩步：第一步先用間接elisa篩選出陽(yáng)性細(xì)胞孔，第二步選用hb標(biāo)準(zhǔn)品，用間接競(jìng)爭(zhēng)elisa對(duì)陽(yáng)性細(xì)胞進(jìn)行抑制效果測(cè)定。選出對(duì)hb具有較好抑制的孔，采用有限稀釋法進(jìn)行亞克隆，用同樣的方法進(jìn)行檢測(cè)。重復(fù)三次，即可得到能穩(wěn)定分泌hb單克隆抗體的細(xì)胞株。
4、單克隆抗體的制備與鑒定：取8～10周齡balb/c小鼠，每只小鼠腹腔注射石蠟油1ml；7天后每只小鼠腹腔注射1×106雜交瘤細(xì)胞，從第七天開始收集腹水，將腹水通過(guò)辛酸-硫酸銨法純化，獲得的單抗置于-20℃保存。
本發(fā)明的有益效果：本發(fā)明將得到的特異性分泌hb抗體的雜交瘤細(xì)胞株zxl-1經(jīng)過(guò)腹水制備以及純化，即可得到抗hb單克隆抗體。該抗體可用于動(dòng)物源食品中hb殘留的免疫檢測(cè)，使用間接競(jìng)爭(zhēng)elisa和間接elisa，測(cè)定單克隆抗體對(duì)hb的半數(shù)抑制率ic50為9.26ng/ml；為動(dòng)物源食品中hb的快速免疫檢測(cè)提供了可能，滿足目前市場(chǎng)上對(duì)hb快速免疫檢測(cè)產(chǎn)品的需求。
生物材料樣品保藏：分泌潮霉素b特異性單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株zxl-1，已保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，簡(jiǎn)稱cgmcc，地址：北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，保藏編號(hào)為cgmccno.13097，保藏日期2016年10月31日，分類命名單克隆細(xì)胞株。
附圖說(shuō)明
圖1是本發(fā)明獲得的單克隆抗體檢測(cè)潮霉素b的elisa標(biāo)準(zhǔn)曲線。
具體實(shí)施方式
本發(fā)明下面的實(shí)施例僅作為本發(fā)明內(nèi)容的進(jìn)一步說(shuō)明，不能作為本發(fā)明的限定內(nèi)容或范圍，下面通過(guò)實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明。
本發(fā)明通過(guò)將完全抗原免疫小鼠，通過(guò)細(xì)胞融合，hat選擇性培養(yǎng)基培養(yǎng)，通過(guò)間接elisa和間接競(jìng)爭(zhēng)elisa篩選細(xì)胞上清，將篩選得到的對(duì)hb抑制較好的細(xì)胞株擴(kuò)大培養(yǎng)，并經(jīng)過(guò)腹水制備以及純化，最終得到了具有較好靈敏度的hb單克隆抗體。
實(shí)施例1hb單克隆抗體的制備
1、免疫原和包被原的制備：采用戊二醛法，將hb與牛血清蛋白（bsa）偶聯(lián)得到的免疫原h(huán)b-bsa；采用碳化二亞胺法，與雞蛋清白蛋白（ova）偶聯(lián)得到的hb-ova作為包被抗原。
hb-bsa的具體合成步驟如下：
a、稱取10mghb，溶于1ml0.1mph7.4的磷酸鹽緩沖溶液中，再逐滴加入稀釋10倍后的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為25%的戊二醛溶液100μl，室溫?cái)嚢?0min后，得到活化液；
b、稱取50mgbsa，溶于5ml0.1mph9.0碳酸鹽緩沖溶液中，在不斷攪拌下，逐滴加入活化液，室溫下，反應(yīng)3～4h后，將反應(yīng)液用0.01mph7.4的磷酸鹽緩沖液透析，即可得到hb-bsa。
hb-ova的具體合成步驟如下：
a、稱取20mgova，溶于3ml0.1mph6.0的一水合2-（n-嗎啡啉）乙磺酸（mes）溶液中；不斷攪拌下，先加入24mgn-羥基琥珀酰亞胺，15min后，再加入31mg1-乙基-3-（3-二甲基氨基丙基-碳二亞胺）；在室溫下，攪拌2h，得到活化液；
b、稱取5mghb，溶于1ml0.1mph9.0碳酸鹽緩沖溶液中；在不斷攪拌下，逐滴加入活化液，室溫下，反應(yīng)4h后，將反應(yīng)液用0.01mph7.4的磷酸鹽緩沖液透析，即可得到hb-ova。
2、動(dòng)物免疫：采用小劑量短周期方案免疫健康balb/c雌性小鼠，首次免疫用100μghb-bsa與等量弗氏完全佐劑混勻后進(jìn)行皮下注射，間隔3周后，再用100μghb-bsa與等量弗氏不完全佐劑加強(qiáng)免疫，此后每隔3周用半量hb-bsa加強(qiáng)免疫一次；沖刺免疫劑量減半，與等體積的生理鹽水混合后采用腹腔免疫，用hb與雞蛋清白蛋白（ova）的偶聯(lián)物hb-ova作為包被抗原，通過(guò)間接競(jìng)爭(zhēng)elisa檢測(cè)血清效價(jià)和抑制；
其具體elisa程序如下：
（1）包被：將包被抗原用0.05mph9.6碳酸鹽緩沖液梯度稀釋，100μl/孔，37℃孵育2h；
（2）洗滌：將板內(nèi)溶液傾去，每孔注入200μlpbst溶液，置于搖床上振蕩3min，甩干，洗滌3次；以下洗滌方法相同；
（3）封閉：拍干后，加入200μl/孔封閉液，37℃孵育2h。洗滌后烘干備用；
（4）加樣：酶標(biāo)板上半部分加入0.01mph7.4磷酸鹽緩沖溶液，50μl/孔（上半部分稱為0標(biāo)），下半部分加入不同濃度的用0.01mph7.4磷酸鹽緩沖溶液稀釋的hb標(biāo)準(zhǔn)品，將抗血清從1:1000開始梯度稀釋，50μl/孔（下半部分稱為加標(biāo)），上下部分對(duì)應(yīng)加入不同稀釋梯度包被抗原的孔中，37℃孵育30min；充分洗滌后，加入1:3000稀釋的鼠二抗，100μl/孔，37℃孵育30min，洗滌后拍干；
（5）顯色：將酶標(biāo)板取出，充分洗滌后，每孔加入100μl的顯色液（tmb與底物液比例1:5），37℃避光反應(yīng)15min；
（6）終止和測(cè)定：取出酶標(biāo)板，每孔加入50μl終止液（2mol/l的硫酸）終止反應(yīng)，然后用酶標(biāo)儀測(cè)定各孔的吸光值od450；
（7）結(jié)果判讀：以od值大于或等于陰性血清對(duì)照孔的2.1倍（即p/n≥2.1）所對(duì)應(yīng)的血清最高稀釋倍數(shù)即為血清的elisa效價(jià)。上下部分對(duì)照，加標(biāo)od值為0標(biāo)一半的即是所加的標(biāo)準(zhǔn)品濃度；
3、細(xì)胞融合：在沖擊免疫三天后，按照常規(guī)peg（聚乙二醇，分子量為1450）方法進(jìn)行細(xì)胞融合，具體步驟如下：
（1）無(wú)菌取小鼠脾臟，研磨并通過(guò)200目細(xì)胞篩網(wǎng)得到脾細(xì)胞懸液，并進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)；
（2）收集sp2/0細(xì)胞，懸浮于rpmi-1640基礎(chǔ)培養(yǎng)液中，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)；
（3）將脾細(xì)胞和sp2/0細(xì)胞按照10:1（數(shù)量比）的比例混合，離心后用50%peg融合，時(shí)間1min，之后按照從慢到快，加入rpmi-1640基礎(chǔ)培養(yǎng)液，離心后懸浮于含20%胎牛血清、2%的50×hat的rpmi-1640篩選培養(yǎng)液中，加到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，置于37℃，5%co2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
4、細(xì)胞篩選與細(xì)胞株建立：在細(xì)胞融合的第三天對(duì)融合細(xì)胞進(jìn)行rpmi-1640篩選培養(yǎng)液半換液，第6天進(jìn)行用含20%胎牛血清、1%的100×ht的rpmi-1640過(guò)渡培養(yǎng)液進(jìn)行全換液，在第9天取細(xì)胞上清進(jìn)行篩選；
篩選分兩步：第一步先用間接elisa篩選出陽(yáng)性細(xì)胞孔，第二步選用hb標(biāo)準(zhǔn)品，用間接競(jìng)爭(zhēng)elisa對(duì)陽(yáng)性細(xì)胞進(jìn)行抑制效果測(cè)定。選出對(duì)hb標(biāo)準(zhǔn)品均具有較好抑制的孔，采用有限稀釋法進(jìn)行亞克隆，用同樣的方法進(jìn)行檢測(cè)。重復(fù)三次，即可得到能穩(wěn)定分泌hb單克隆抗體的細(xì)胞株。
5、單克隆抗體的制備與鑒定：取8～10周齡balb/c小鼠，每只小鼠腹腔注射石蠟油1ml；7天后每只小鼠腹腔注射1×106雜交瘤細(xì)胞，從第七天開始收集腹水，將腹水通過(guò)辛酸-硫酸銨法純化，獲得的單抗置于-20℃保存。
使用間接競(jìng)爭(zhēng)elisa和間接elisa，測(cè)定單克隆抗體對(duì)hb的半數(shù)抑制率ic50為9.26ng/ml；為動(dòng)物源食品中hb的快速免疫檢測(cè)提供了可能。
綜上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，并非用來(lái)限定本發(fā)明的實(shí)施范圍。即凡依本發(fā)明申請(qǐng)專利范圍的內(nèi)容所作的等效變化與修飾，都應(yīng)為本發(fā)明的技術(shù)范疇。