本發(fā)明涉及環(huán)境污染微生物修復(fù)，具體涉及一株農(nóng)藥殘留廣譜降解菌株ds3及其生產(chǎn)的菌劑和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

化學(xué)農(nóng)藥作為保障農(nóng)業(yè)豐收的重要手段，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中發(fā)揮著非常重要的作用。然而由于人們長期對化學(xué)農(nóng)藥的不科學(xué)使用，以及化學(xué)農(nóng)藥在施用過程中利用率很低，使得化學(xué)農(nóng)藥在應(yīng)用過程中，僅有小部分藥劑可以附著于植物上發(fā)揮作用，其余大部分散落在大氣、土壤和水體等生態(tài)環(huán)境中。農(nóng)藥使用沒有被分解而殘留于生物體、收獲物、土壤、水體、大氣中的農(nóng)藥原體，降解物，有毒代謝物和雜質(zhì)等稱為農(nóng)藥殘留。殘留在環(huán)境中，污染了土壤、水體等生態(tài)系統(tǒng)中的農(nóng)藥不僅會造成環(huán)境污染，而且會通過食物鏈富集，最終進入人體，嚴(yán)重危害了人類的健康，近年來越來越多的農(nóng)藥殘留使人中毒事件發(fā)生，造成了極其嚴(yán)重的不良后果。因此，需要進一步研究有關(guān)農(nóng)藥殘留的降解，來解決農(nóng)藥殘留問題。

在當(dāng)今農(nóng)藥生產(chǎn)中，有機磷農(nóng)藥是其主要類別之一，國內(nèi)外都在大量生產(chǎn)和廣泛使用。目前全球與有機磷農(nóng)藥相關(guān)的商品已達(dá)到150多種，在我國被廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的除草劑、殺蟲劑和殺菌劑等有機磷農(nóng)藥約有30種。雖然有機磷農(nóng)藥有效地提高了農(nóng)作物的產(chǎn)量，但同時由于其大量不合理的使用，使得在蔬菜、瓜果、糧食等農(nóng)產(chǎn)品和土壤中都發(fā)現(xiàn)了有機磷農(nóng)藥殘留甚至嚴(yán)重超標(biāo)的現(xiàn)象。

二苯醚類除草劑是由美國ppg工業(yè)公司開發(fā)的一類高效除草劑，廣泛用于禾谷類作物、玉米、棉花、水稻、大豆和花生田防除闊葉雜草。該類除草劑的作用靶標(biāo)是雜草的原卟啉原氧化酶，通過抑制其催化的氧化反應(yīng)導(dǎo)致光依賴的膜脂過氧化，最終造成靶標(biāo)雜草的死亡。隨著二苯醚類除草劑的大量使用，在土壤、地下水及河流中都有殘留，對環(huán)境生物造成潛在威脅。此外，高劑量的二苯醚類除草劑對人體具有致癌性。

芳氧苯氧丙酸酯類除草劑(aopp)是防除禾本科雜草的一類雜環(huán)、含氟、光學(xué)活性除草劑。它是由赫司特公司首先開發(fā)的，在2，4-滴的基礎(chǔ)上進一步優(yōu)化發(fā)展而成。此類除草劑主要作為莖葉處理劑，在中國廣泛地用于闊葉作物防除一年生和多年生的禾本科雜草。芳氧苯氧丙酸酯類除草劑被用來控制稻田中禾本科雜草，其大規(guī)模使用導(dǎo)致環(huán)境中土壤、地下水大量殘留。

生物修復(fù)是利用生物特別是微生物的生命代謝活動將有機農(nóng)藥降解為無公害的無機物(二氧化碳和水)或其他無害的代謝產(chǎn)物，使受農(nóng)藥污染土壤部分或者完全地恢復(fù)到健康狀態(tài)。它被公認(rèn)為具有安全、有效、低耗和環(huán)保等顯著優(yōu)點，已經(jīng)成為研究農(nóng)藥修復(fù)的熱點。生物修復(fù)過程中的微生物主要有3種類型：土著微生物、基因工程菌和外來微生物。已報道的能有效降解農(nóng)藥的微生物包括細(xì)菌、放線菌、真菌、藻類等。細(xì)菌由于容易誘變和適應(yīng)性強等特性而在生物修復(fù)中占據(jù)主導(dǎo)地位。

目前關(guān)于鞘脂菌(sphingobiumsp.)農(nóng)藥降解菌株已有一些報道到，但是這些農(nóng)藥降解菌株都是效果單一，一般能降解一種類型的農(nóng)藥，缺乏廣譜性，主要集中在單一的有機磷類、酰胺類或者菊酯類農(nóng)藥。例如專利(cn102757915b)一種氯代乙酰胺類除草劑降解菌及其生產(chǎn)的菌劑和應(yīng)用，公開了鞘脂菌(sphingobiumsp.)dc-3可以降解乙草胺、丁草胺等酰胺類農(nóng)藥殘留；cloningofanovelpyrethroid-hydrolyzingcarboxylesterasegenefromsphingobiumsp.strainjz-1andcharacterizationofthegeneproduct.(appliedenvironmentalmicrobiology,2009,75(17):5496-500)，公開了在sphingobiumsp.jz-1克隆到對菊酯類農(nóng)藥降解的基因。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

發(fā)明目的：針對現(xiàn)有技術(shù)存在的問題，本發(fā)明提供一株農(nóng)藥殘留廣譜降解菌株ds3，該菌株對于有機磷類、二苯醚類和芳氧苯氧羧酸酯類農(nóng)藥殘留都可以進行有效地降解，具有農(nóng)藥殘留廣譜降解性。

本發(fā)明的另一目的是提供該農(nóng)藥殘留廣譜降解菌株生產(chǎn)的降解菌劑及其應(yīng)用；該菌株制備的降解菌劑可在短時間內(nèi)使土壤或水體環(huán)境中殘留的有機磷類、二苯醚類和芳氧苯氧羧酸酯類農(nóng)藥。

技術(shù)方案：為了實現(xiàn)上述目的，如本發(fā)明所述的一株農(nóng)藥殘留廣譜降解菌株ds3，經(jīng)鑒定為鞘脂菌(sphingobiumsp.)，已保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏時間為2017年6月5日，保藏編號為cctccno:m2017305。

本發(fā)明所述的菌株ds3在降解有機磷類、二苯醚類和芳氧苯氧羧酸酯類農(nóng)藥殘留中的應(yīng)用。

進一步地，所述菌株ds3可以降解土壤或水體環(huán)境中有機磷類、二苯醚類和芳氧苯氧羧酸酯類農(nóng)藥殘留。

所述有機磷類農(nóng)藥包括久效磷、毒死蜱、三唑磷、甲基對硫磷、敵敵畏等。

所述二苯醚類農(nóng)藥包括乙羧氟草醚、氟磺胺草醚、乙氧氟草醚、乳氟禾草靈等。

所述芳氧苯氧羧酸酯類農(nóng)藥包括氰氟草酯、精惡唑禾草靈、精吡氟禾草靈、精喹禾靈、炔草酯等。

本發(fā)明所述的菌株ds3生產(chǎn)的降解菌劑。

本發(fā)明所述的降解菌劑的制備方法，包括如下步驟：

(1)將降解菌株ds3培養(yǎng)到對數(shù)期的試管液按發(fā)酵培養(yǎng)基體積的0.5-1％接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至對數(shù)期，制得發(fā)酵菌種；

(2)將上述制得發(fā)酵菌種按種子罐的培養(yǎng)基體積的5-10％接種于種子罐的培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至對數(shù)生長期，制得種子液；

(3)將種子液按生產(chǎn)罐的培養(yǎng)基體積的5-10％接種于生產(chǎn)罐的培養(yǎng)基中培養(yǎng)發(fā)酵，發(fā)酵完成后的培養(yǎng)液即為即為降解菌劑。

其中，步驟(2)和步驟(3)所述培養(yǎng)過程中每分鐘無菌空氣的通氣量為1:(1-0.8)，攪拌速度為150-180rpm，培養(yǎng)溫度為27-30℃。

其中，步驟(3)所述培養(yǎng)發(fā)酵時間為30-48小時。

進一步地，步驟(3)所述發(fā)酵完成后的培養(yǎng)液中菌體數(shù)量達(dá)到10億個/ml以上。

其中，發(fā)酵培養(yǎng)基、種子罐的培養(yǎng)基、生產(chǎn)罐的培養(yǎng)基配方相同，均為葡萄糖0.1wt％、nacl1.0wt％、蛋白胨0.5wt％、酵母膏0.25wt％，溶劑為蒸餾水，ph7.2-7.5。

本發(fā)明所述的降解菌劑在降解有機磷類、二苯醚類和芳氧苯氧羧酸酯類農(nóng)藥殘留中的應(yīng)用。

進一步地，所述降解菌劑可以降解土壤或水體環(huán)境中有機磷類、二苯醚類和芳氧苯氧羧酸酯類農(nóng)藥殘留。

有益效果：與現(xiàn)有技術(shù)相比較，本發(fā)明經(jīng)分離篩選獲得農(nóng)藥殘留廣譜降解菌株ds3可以有效地降解有機磷類、二苯醚類和芳氧苯氧羧酸酯類農(nóng)藥殘留；能將無機鹽培養(yǎng)基中的有機磷類如久效磷、二苯醚類如乙羧氟草醚、芳氧苯氧羧酸酯類如氰氟草酯的殘留都降解90％以上，同時該菌株制備的降解菌劑能在短時間內(nèi)降解土壤或水體中高濃度的有機磷類、二苯醚類和芳氧苯氧羧酸酯類殘留達(dá)87％以上，解決殘留有機磷類、二苯醚類和芳氧苯氧羧酸酯類對土壤水體環(huán)境、農(nóng)作物和人體健康的危害問題。

本發(fā)明的降解菌劑可以用發(fā)酵工業(yè)通用發(fā)酵設(shè)備進行生產(chǎn)，具有生產(chǎn)成本低，使用方便，去除效果好的優(yōu)點，適用于有機磷類、二苯醚類和芳氧苯氧羧酸酯類農(nóng)藥殘留污染的土壤與水體修復(fù)；本發(fā)明對于保護生態(tài)環(huán)境，降低農(nóng)藥殘留對農(nóng)作物藥害，保護人體的身體健康具有重要的意義。

附圖說明

圖1為本發(fā)明菌株ds3的菌落照片；

圖2為本發(fā)明菌株ds3的電鏡圖；

圖3為本發(fā)明菌株ds3降解久效磷的hplc分析圖譜(a：ck；b：24h處理)；

圖4為本發(fā)明菌株ds3降解乙羧氟草醚的hplc分析圖譜(a：ck；b：24h處理)；

圖5為本發(fā)明菌株ds3降解氰氟草酯的hplc分析圖譜(a：ck；b：24h處理)。

具體實施方式

以下結(jié)合附圖和實施例對本發(fā)明作進一步說明。

實施例1

菌株ds3的分離和鑒定：

用來富集降解菌株的富集基質(zhì)取自上海亞農(nóng)農(nóng)藥化工有限公司的廢水生化處理池的活性污泥，取15g污泥樣品置于100ml添加含有100mg/l乙羧氟草醚、100mg/l久效磷和100mg/l氰氟草酯的無機鹽液體培養(yǎng)基(nh4no31.0g，k2hpo41.5g，kh2po40.5g，mgso40.2g，nacl1.0g，水1000ml，ph7.0-7.2)中，30℃、150r/min培養(yǎng)7天，以5％的接種量轉(zhuǎn)接到相同的添加50mg/l乙羧氟草醚的無機鹽液體培養(yǎng)基，連續(xù)轉(zhuǎn)接4次。通過紫外分光光度計和液相色譜法測定富集液乙羧氟草醚降解效果，獲得有降解效果的富集液。取0.5ml有效果的富集液，10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6梯度稀釋，每個梯度的稀釋富集液取100μl涂布在含有100mg/l乙羧氟草醚、100mg/l久效磷和100mg/l氰氟草酯的無機鹽固體培養(yǎng)基平板上，30℃培養(yǎng)7d。挑取平板上長出的單菌落接種于液體lb培養(yǎng)基(蛋白胨10g，酵母膏5g，nacl5g，水1000ml，ph7.0-7.2)試管中，30℃、165r/min培養(yǎng)2天，取1mllb培養(yǎng)液，5000rpm離心5min，無菌水洗去lb培養(yǎng)基后，取1ml無菌水重懸菌體，分別接種至加有含有100mg/l乙羧氟草醚、100mg/l久效磷和100mg/l氰氟草酯的無機鹽液體培養(yǎng)基中，30℃、165r/min培養(yǎng)3d，通過紫外分光光度計和高效液相色譜分別檢測三種農(nóng)藥降解效果。對三種農(nóng)藥均有降解效果的菌株即為降解菌株。

紫外分光光度計降解效果的驗證方法：采用uv-1700微量紫外分光光度計分別測定乙羧氟草醚、久效磷和氰氟草酯的質(zhì)量濃度。往待測降解菌液中加入等量體積的二氯甲烷，劇烈振蕩5-10min，然后靜置直到水相和有機相完全分層，吸取下層水相，保留有機相，下層水相再一次用等體積的二氯甲烷萃取，兩次得到的有機相經(jīng)無水硫酸鈉去除殘留的水分后，于紫外-可見分光光度計上在波長200-350nm范圍內(nèi)進行掃描。通過乙羧氟草醚、久效磷和氰氟草酯在200nm-350nm處的特征吸收峰峰值的高低來分別判斷降解液中三種農(nóng)藥濃度的高低。

高效液相色譜降解效果的驗證方法：在培養(yǎng)液中加入等體積的二氯甲烷進行全量提取，劇烈振蕩后靜置分層，然后取1ml下層二氯甲烷揮發(fā)完全后，加入1ml甲醇溶解(色譜純)，用濾膜(孔徑0.22μm)過濾。采用紫外和高效液相色譜分別測定提取液中乙羧氟草醚、久效磷和氰氟草酯的含量，液相色譜條件：流動相已腈：水(50：5，v/v)，zorbaxc218odsspherex反相柱(5μm，4.6mm×250mm，agilent，usa)，柱溫為40℃，pda檢測器，測定波長230或280nm，進樣量10μl，流速為1.0ml·min^-1。外標(biāo)法按峰面積定量。

從富集液中，通過驗證得到1株廣高效廣譜農(nóng)藥降解菌株，可以降解乙羧氟草醚、久效磷和氰氟草酯三種農(nóng)藥，命名為ds3。該菌株16h對100mg/l的乙羧氟草醚、久效磷和氰氟草酯降解率都能達(dá)到90％以上。如圖1所示，菌落ds3在lb固體平板上菌落形態(tài)為整體圓形，表面隆起、邊緣整齊，濕潤、光滑，呈淡黃色，革蘭氏染色陰性。菌株ds3電鏡圖如圖2所示，無鞭毛，短桿狀(0.3–0.5μm×0.9–1.0μm)。

以菌株ds3的基因組dna為模板，用細(xì)菌16srrna基因序列通用引物進行pcr擴增，得到長度為1409bp的16srdna基因序列，如seqidno：1所示。在eztaxon數(shù)據(jù)庫(www.ezbiocloud.net)中進行blast，結(jié)果表明菌株ds3與鞘脂菌(sphingobiumsp.)菌株的同源性最近，與菌株sphingobiumyanoikuyaeatcc51230^t和sphingobiumscionensewp01^t同源性都達(dá)到98％以上，結(jié)合形態(tài)和生理生化特征，將菌株ds3初步鑒定為鞘脂菌(sphingobiumsp.)，命名為鞘脂菌ds3(sphingobiumsp.ds3)。將該菌株ds3送交位于中國武漢，中國典型培養(yǎng)物保藏中心(簡稱cctcc)保藏，保藏時間為2017年6月5日，保藏編號為cctccno:m2017305。

實施例2

在無機鹽培養(yǎng)基中菌株ds3對有機磷類農(nóng)藥殘留的降解效果：

在無機鹽液體培養(yǎng)基中降解菌株ds3對久效磷降解特性測定：挑取ds3單菌落于50mllb液體培養(yǎng)基中，30℃、165r/min振蕩培養(yǎng)24h，獲得新鮮菌液。將3ml培養(yǎng)好的新鮮菌液經(jīng)6000r/min離心5min，棄去上清液，加入10ml無菌水重懸，為離心懸浮后的種子液，種子液的菌體量達(dá)為6×10⁷cfu/ml以上。

在無機鹽培養(yǎng)基中加入終濃度為100mg/l的久效磷，按3％體積比的接種量接入菌株ds3的種子液；同時在無機鹽培養(yǎng)基中加入終濃度為100mg/l的久效磷，按3％體積比的接種量接入滅活的菌株ds3種子液作為對照，30℃恒溫?fù)u床中培養(yǎng)24h，采用實施例1中降解效果的驗證方法通過高效液相色譜法檢測菌株ds3對久效磷的降解情況，并計算降解率，如圖3所示，其中a為對照，b為處理。菌株ds3在24h內(nèi)對久效磷降解率可以達(dá)到90％。

采用相同的方法測試毒死蜱、三唑磷、甲基對硫磷、敵敵畏等有機磷農(nóng)藥的降解情況，反應(yīng)48h后毒死蜱、三唑磷、甲基對硫磷、敵敵畏的降解率都能達(dá)到90％以上。

實施例3

在無機鹽培養(yǎng)基中菌株ds3對二苯醚類農(nóng)藥殘留的降解效果：

在無機鹽液體培養(yǎng)基中降解菌株ds3對乙羧氟草醚降解特性測定：挑取ds3單菌落于50mllb液體培養(yǎng)基中，30℃、165r/min振蕩培養(yǎng)24h，獲得新鮮菌液。將3ml培養(yǎng)好的新鮮菌液經(jīng)6000r/min離心5min，棄去上清液，加入10ml無菌水重懸，為離心懸浮后的種子液，種子液的菌體量達(dá)為6×10⁷cfu/ml以上。

在無機鹽培養(yǎng)基中加入終濃度為100mg/l的乙羧氟草醚，按3％體積比的接種量接入菌株ds3的種子液；同時在無機鹽培養(yǎng)基中加入終濃度為100mg/l的乙羧氟草醚，按3％體積比的接種量接入滅活的菌株ds3種子液作為對照，30℃恒溫?fù)u床中培養(yǎng)24h，采用實施例1中降解效果的驗證方法通過高效液相色譜法檢測菌株ds3對乙羧氟草醚的降解情況，并計算降解率，如圖4所示，其中a為對照，b為處理。菌株ds3在24h內(nèi)對乙羧氟草醚降解率可以達(dá)到92％。

采用相同的方法測試氟磺胺草醚、乙氧氟草醚、乳氟禾草靈等二苯醚類農(nóng)藥的降解情況，反應(yīng)48h后氟磺胺草醚、乙氧氟草醚、乳氟禾草靈的降解率都能達(dá)到90％以上。

實施例4

在無機鹽培養(yǎng)基中菌株ds3對芳氧苯氧羧酸酯類農(nóng)藥殘留的降解效果：

在無機鹽液體培養(yǎng)基中降解菌株ds3對氰氟草酯降解特性測定：挑取ds3單菌落于50mllb液體培養(yǎng)基中，30℃、165r/min振蕩培養(yǎng)24h，獲得新鮮菌液。將3ml培養(yǎng)好的新鮮菌液經(jīng)6000r/min離心5min，棄去上清液，加入10ml無菌水重懸，為離心懸浮后的種子液，種子液的菌體量達(dá)為6×10⁷cfu/ml以上。

在無機鹽培養(yǎng)基中加入終濃度為100mg/l的氰氟草酯，按3％體積比的接種量接入菌株ds3的種子液；同時在無機鹽培養(yǎng)基中加入終濃度為100mg/l的氰氟草酯，按3％體積比的接種量接入滅活的菌株ds3種子液作為對照，30℃恒溫?fù)u床中培養(yǎng)24h，采用實施例1中降解效果的驗證方法通過高效液相色譜法檢測菌株ds3對乙羧氟草醚的降解情況，并計算降解率，如圖5所示，其中a為對照，b為處理。菌株ds3在24h內(nèi)對氰氟草酯降解率可以達(dá)到94％。

采用相同的方法測試精惡唑禾草靈、精吡氟禾草靈、精喹禾靈、炔草酯等芳氧苯氧羧酸酯類農(nóng)藥的降解情況，反應(yīng)48h后精惡唑禾草靈、精吡氟禾草靈、精喹禾靈、炔草酯的降解率都能達(dá)到90％以上。

實施例5

采用實施例2的方法，在無機鹽培養(yǎng)基中加入終濃度均為100mg/l的乙羧氟草醚、久效磷和氰氟草酯，按5％體積比的接種量接入菌株ds3的種子液；同時在無機鹽培養(yǎng)基中加入終濃度為終濃度均為100mg/l的乙羧氟草醚、久效磷和氰氟草酯，按5％體積比的接種量接入滅活的菌株ds3種子液作為對照，30℃恒溫?fù)u床中培養(yǎng)48h，通過高效液相色譜法檢測菌株ds3對乙羧氟草醚、久效磷和氰氟草酯混合農(nóng)藥的降解情況，經(jīng)過48h培養(yǎng)后發(fā)明乙羧氟草醚、久效磷和氰氟草酯基本均被降解。

實施例6

菌株ds3的降解菌劑的制備

1)將實施例1分離篩選的降解菌株ds3接種到含3ml的lb(蛋白胨10g，酵母膏5g，nacl5g，水1000ml，ph7.0-7.2)試管中培養(yǎng)到對數(shù)期，將試管液按0.5％體積比的接種量接種于100ml發(fā)酵培養(yǎng)基中，30℃，150rpm振蕩培養(yǎng)至對數(shù)期，制得發(fā)酵菌種；

2)將上述制得發(fā)酵菌種按5％(v/v，以培養(yǎng)基體積為基準(zhǔn))的接種量接種于裝液量為70％(以發(fā)酵罐體積為基準(zhǔn)，下同)的500升種子罐的培養(yǎng)基中培養(yǎng)(培養(yǎng)基已經(jīng)121℃高壓濕熱滅菌，冷卻)，培養(yǎng)至對數(shù)生長期，培養(yǎng)過程中每分鐘無菌空氣的通氣量為1:0.8(培養(yǎng)基與無菌空氣體積比)，攪拌速度為180rpm，培養(yǎng)溫度為30℃；制得種子液；

3)將種子液按5％(v/v，以培養(yǎng)基體積為基準(zhǔn))的接種量接入裝液量為70％的5000升生產(chǎn)罐的培養(yǎng)基中培養(yǎng)發(fā)酵(生產(chǎn)罐培養(yǎng)基已經(jīng)在1.1kg/cm²的壓力下，121℃高壓濕熱滅菌，冷卻)，培養(yǎng)發(fā)酵過程中每分鐘無菌空氣的通氣量為1:1(培養(yǎng)基與無菌空氣體積比)，攪拌速度為180rpm，培養(yǎng)溫度為27℃，培養(yǎng)時間為48小時，發(fā)酵結(jié)束后菌體數(shù)量達(dá)到10億個/ml以上，發(fā)酵完成后培養(yǎng)液出罐直接用塑料包裝桶或包裝瓶分裝成液體劑型即為降解菌劑。

其中，發(fā)酵培養(yǎng)基、種子罐的培養(yǎng)基、生產(chǎn)罐的培養(yǎng)基配方相同，均為葡萄糖0.1wt％、nacl1.0wt％、蛋白胨0.5wt％、酵母膏0.25wt％，溶劑為蒸餾水，ph7.2-7.5。

實施例5

菌株ds3的降解菌劑的制備

1)將實施例1分離篩選的降解菌株ds3接種到含3ml的lb(蛋白胨10g，酵母膏5g，nacl5g，水1000ml，ph7.0-7.2)試管中培養(yǎng)到對數(shù)期，將試管液按0.5％體積比的接種量接種于100ml發(fā)酵培養(yǎng)基中，30℃，150rpm振蕩培養(yǎng)至對數(shù)期，制得發(fā)酵菌種；

2)將上述制得發(fā)酵菌種按10％(v/v，以培養(yǎng)基體積為基準(zhǔn))的接種量接種于裝液量為70％(以發(fā)酵罐體積為基準(zhǔn)，下同)的500升種子罐的培養(yǎng)基中培養(yǎng)(培養(yǎng)基已經(jīng)121℃高壓濕熱滅菌，冷卻)，培養(yǎng)至對數(shù)生長期，培養(yǎng)過程中每分鐘無菌空氣的通氣量為1:1(培養(yǎng)基與無菌空氣體積比)，攪拌速度為150rpm，培養(yǎng)溫度為30℃；制得種子液；

3)將種子液按10％(v/v，以培養(yǎng)基體積為基準(zhǔn))的接種量接入裝液量為70％的5000升生產(chǎn)罐的培養(yǎng)基中培養(yǎng)發(fā)酵(生產(chǎn)罐培養(yǎng)基已經(jīng)在1.1kg/cm²的壓力下，121℃高壓濕熱滅菌，冷卻)，培養(yǎng)發(fā)酵過程中每分鐘無菌空氣的通氣量為1:1(培養(yǎng)基與無菌空氣體積比)，攪拌速度為180rpm，培養(yǎng)溫度為30℃，培養(yǎng)時間為30小時，發(fā)酵結(jié)束后菌體數(shù)量達(dá)到10億個/ml以上，發(fā)酵完成后培養(yǎng)液出罐直接用塑料包裝桶或包裝瓶分裝成液體劑型即為降解菌劑。

其中，發(fā)酵培養(yǎng)基、種子罐的培養(yǎng)基、生產(chǎn)罐的培養(yǎng)基配方相同，均為葡萄糖0.1wt％、nacl1.0wt％、蛋白胨0.5wt％、酵母膏0.25wt％，溶劑為蒸餾水，ph7.2-7.5。

實施例6

菌株ds3降解菌劑對土壤中乙羧氟草醚、久效磷和氰氟草酯的降解效果測定：

稱取多份1000g菜園土作為供試土壤，風(fēng)干過篩，每份分別加入乙羧氟草醚、久效磷或氰氟草酯，使土壤中乙羧氟草醚、久效磷或氰氟草酯濃度為200mg/kg，按2％的接種量(ml/g)將實施例4制備的ds降解菌劑分別接入到上述土壤中混勻作為處理組1，設(shè)相應(yīng)不加ds3降解菌劑以及加入相同體積滅活lms-cy降解菌劑的含相同濃度農(nóng)藥土壤為對照1組和2組，置于30℃培養(yǎng)箱中黑暗條件下恒溫培養(yǎng)，期間土壤的持水量保持在60％，第3天取樣分別測定乙羧氟草醚、久效磷和氰氟草酯在土壤中的殘留量，每組做平行實驗3次，利用高效液相色譜測定殘留量，計算多次平均降解率，結(jié)果見表1。

表1菌株ds3降解菌劑對土壤中對農(nóng)藥殘留的降解效果

由表1可見，使用實施例4制備的菌株ds3降解菌劑，土壤中乙羧氟草醚、久效磷或氰氟草酯濃度為200mg/kg時降解菌ds3對其的降解率達(dá)到88.3％、90.5％和87.5％，并且對照中的乙羧氟草醚、久效磷和氰氟草酯均沒有被降解。結(jié)果表明，ds3降解菌劑可有效降解土壤中的乙羧氟草醚、久效磷和氰氟草酯農(nóng)藥殘留。同時采用相同方法檢測土壤中其他類型的有機磷類、二苯醚類和芳氧苯氧羧酸酯類農(nóng)藥殘留的降解情況，結(jié)果與本實施例類似。

實施例7

菌株ds降解菌劑對水體中乙羧氟草醚、久效磷和氰氟草酯的降解效果測定：

取多份500ml制藥廠廢水生化處理池中廢水，過濾后，每份分別加入氟草醚、久效磷或氰氟草酯，調(diào)整濃度后使水體中乙羧氟草醚、久效磷或氰氟草酯濃度分別達(dá)到為200mg/l，按2％的接種量(體積比)將實施例5制備的ds降解菌劑分別接入到上述水體中混勻作為處理組2，設(shè)相應(yīng)不加ds3降解菌劑以及加入相同體積滅活ds3降解菌劑的水體為對照3組和4組，置于30℃培養(yǎng)箱中黑暗條件下恒溫培養(yǎng)，第3天取樣測定乙羧氟草醚、久效磷或氰氟草酯在水體中的殘留量，每組做平行實驗3次，利用高效液相色譜測定殘留量，計算多次平均降解率，結(jié)果見表2。

表2菌株ds3降解菌劑對水體中對農(nóng)藥殘留的降解效果

由表2可見，使用實施例5制備的菌株ds3降解菌劑，水體中乙羧氟草醚、久效磷或氰氟草酯濃度為200mg/kg時降解菌ds3對其的降解率達(dá)到89.5％、91.3％和88.7％，并且對照中的乙羧氟草醚、久效磷和氰氟草酯均沒有被降解。結(jié)果表明，ds3降解菌劑可有效降解水體中的乙羧氟草醚、久效磷和氰氟草酯農(nóng)藥殘留。同時采用相同方法檢測水體中其他類型的有機磷類、二苯醚類和芳氧苯氧羧酸酯類農(nóng)藥殘留的降解情況，結(jié)果與本實施例類似。

針對實施例6和實施例7三種農(nóng)藥同時混合添加在土壤中或者水體中情況，通過調(diào)整降解菌劑的接種量和延長反應(yīng)時間，最終都可以達(dá)到全部降解。

sequencelisting

<110>上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院

<120>一株農(nóng)藥殘留廣譜降解菌株ds3及其生產(chǎn)的菌劑和應(yīng)用

<130>2017

<160>1

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