本發(fā)明屬于植物保護(hù)
技術(shù)領(lǐng)域：
，涉及一種防治水稻根結(jié)線蟲的生防菌株aw2017及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：水稻根結(jié)線蟲(meloidogynegraminicola)是水稻生產(chǎn)上的重要病原線蟲，也是我國重要進(jìn)境植物檢疫對象之一，嚴(yán)重威脅水稻生產(chǎn)安全。根結(jié)線蟲在旱稻、灌溉地水稻、低洼地水稻及苗床上均可為害，一般可造成產(chǎn)量損失10-20％，發(fā)生嚴(yán)重地區(qū)產(chǎn)量損失高達(dá)80％。我國最早在海南省發(fā)現(xiàn)水稻根結(jié)線蟲，目前已擴(kuò)散到廣東、廣西、福建、云南、湖南、四川、江西等地。水稻根結(jié)線蟲可寄生水稻、蔥等多種作物和稗草、游草等雜草，寄主范圍非常廣泛，并且很容易隨水流進(jìn)行傳播，從而給防治帶來了很大困難。目前防治水稻根結(jié)線蟲主要通過化學(xué)殺線蟲劑，但化學(xué)殺線蟲劑成本較高，且對生態(tài)環(huán)境及人體健康的負(fù)面影響較大。利用抗病品種防治水稻根結(jié)線蟲是最經(jīng)濟(jì)有效的措施之一，但長期使用單一抗性的品種，容易導(dǎo)致水稻對根結(jié)線蟲喪失抗性。因此，開發(fā)利用環(huán)境友好型的綠色防控技術(shù)，發(fā)展成本低、效果好、對環(huán)境和人畜無害的生物防治制劑，對于有效控制水稻根結(jié)線蟲的危害，保障水稻等糧食作物生產(chǎn)安全，具有重要意義。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的是針對水稻根結(jié)線蟲綠色防控中、沒有防效較好的生防制劑的現(xiàn)狀，提供一種防治水稻根結(jié)線蟲的生防菌株及生防菌劑。本發(fā)明另一目的是提供該生防菌株及其菌劑在水稻根結(jié)線蟲防治中的應(yīng)用。一種防治水稻根結(jié)線蟲的菌株aw2017，為曲霉屬真菌百歲蘭曲霉(aspergilluswelwitschiae)，菌種保藏號為cgmccno.14132。一種生防菌劑，為含有菌株aw2017的孢子的水溶液。所述孢子濃度為1×107-1×108個/ml。一種生防菌株的制備方法：將分離到生防菌株aw2017涂布在馬鈴薯固體培養(yǎng)基pda上，26℃黑暗培養(yǎng)5天進(jìn)行純化，再挑取菌絲制備生防菌株。一種生防菌劑的制備方法：將生防菌株aw2017在馬鈴薯固體培養(yǎng)基pda培養(yǎng)純化后，挑取菌絲在馬鈴薯液體培養(yǎng)基pdb中26℃150rpm振蕩培養(yǎng)120h,用細(xì)菌過濾器過濾除菌，過濾后的代謝產(chǎn)物用蒸餾水稀釋成孢子濃度為1×107-1×108個/ml的菌劑。上述生防菌劑在水稻根結(jié)線蟲防治中的應(yīng)用。所述應(yīng)用為將生防菌劑噴施于水稻田中。所述生防菌劑的孢子濃度為1×107-×108個/ml，施用量為每畝用量8－10l。本發(fā)明的生防菌劑對根結(jié)線蟲的防治效果：該生防菌劑可減輕根結(jié)線蟲對水稻的危害程度，溫室實驗表明，使用生防菌劑30天后，線蟲減退率達(dá)56.9％-62.2％，溫室根結(jié)數(shù)量防效達(dá)61.5％-65.7％；田間實驗表明，根結(jié)指數(shù)防效達(dá)43.2％-52.3％。所述的生防菌劑對水稻生長的影響：aw2017生防菌劑對水稻生長具有一定的促進(jìn)作用。溫室實驗表明，該生防菌劑對水稻苗期的株高及鮮重等沒有顯著不利影響。所述的生防菌劑對水稻產(chǎn)量的影響：田間實驗表明，該生防菌劑對水稻產(chǎn)量具有促進(jìn)作用，收獲期調(diào)查，水稻增產(chǎn)率達(dá)19.2％-28.6％。菌株保藏信息：菌種分類命名：曲霉屬真菌百歲蘭曲霉(aspergilluswelwitschiae)菌種保藏號：cgmccno.14132保藏地址：中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏日期：2017年6月21日具體實施方式：下面結(jié)合具體實施方式對本發(fā)明作進(jìn)一步的解釋。以下實施實例所用的培養(yǎng)基配方為：pda培養(yǎng)基配方：馬鈴薯200g,蔗糖20g,瓊脂20g,加熱溶解并過濾后蒸餾水定容至1l。pdb培養(yǎng)基配方：馬鈴薯200g,蔗糖20g,加熱溶解并過濾后蒸餾水定容至1l。實施例1：生防菌aw2017的制備將從土壤中分離到的帶有真菌的懸浮液涂布在馬鈴薯固體培養(yǎng)基(pda)上，26℃黑暗培養(yǎng)5天，再挑取菌絲進(jìn)行純化。將帶有菌絲的槍頭在pda培養(yǎng)基上劃線接種，26℃黑暗培養(yǎng)5天后，生防菌aw2017菌落直徑43-45mm，較厚,表面具少量輻射狀皺紋,邊緣于培養(yǎng)基內(nèi)；質(zhì)地絨狀；分生孢子結(jié)構(gòu)大量產(chǎn)生，褐黑色；菌絲體白色夾雜淡黃色；無滲出液和可溶性色素；反面呈淡黃白色。顯微鏡底下觀察，分生孢子頭初期為球形，后分叉，直徑200-400微米；分生孢子梗發(fā)生于培養(yǎng)基內(nèi)部，1000-3000×10-18微米，壁光滑；頂囊球形直徑40-60微米，全部表面可育；產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)雙層，?；?0-20×5-7微米；瓶梗8-10×2-3微米；分生孢子球形，壁刺狀粗糙。經(jīng)形態(tài)學(xué)和克隆bena和cam基因等分子生物學(xué)方法鑒定，該菌株aw2017為曲霉屬真菌百歲蘭曲霉(aspergilluswelwitschiae)，于2017年6月21日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，菌種保藏號為cgmccno.14132。實施例2：生防菌劑的制備挑取在pda固體培養(yǎng)基純化后的生防菌株aw2017的菌絲，在馬鈴薯液體培養(yǎng)基(pdb)中26℃150rpm振蕩培養(yǎng)120h，用細(xì)菌過濾器過濾除菌，過濾后的代謝產(chǎn)物用蒸餾水稀釋，菌劑成品中的孢子濃度為1×107-×108個/ml。實施例3：溫室盆栽實驗檢測aw2017生防菌劑對水稻根結(jié)線蟲的防效水稻催芽3天后，移栽在pvc管中，每管一株，用實施例2制備的生防菌劑，每管使用生防菌劑0.2ml，用清水稀釋至20ml后澆灌，用等量的pdb培養(yǎng)基作對照，每處理20株，重復(fù)4次，14天后接種水稻根結(jié)線蟲150條/株。接種后14天調(diào)查生防菌劑對水稻生長的影響，發(fā)現(xiàn)水稻的株高、鮮重沒有顯著變化，說明aw2017生防菌劑對水稻生長沒有不利影響(表1)。表1溫室實驗中aw2017對水稻生長的影響品種名稱地上部株高(cm)根長(cm)地上部鮮重(mg)地下部鮮重(mg)aw2017重復(fù)i30.9±3.8a13.7±2.6a298±34.2a197±26.4aaw2017重復(fù)ii29.1±4.1a12.6±3.3a297±27.6a206±33.2aaw2017重復(fù)iii26.8±3.6a13.8±3.5a289±33.8a207±31.7a對照27.5±4.3a15.1±3.6a278±25.9a195±28.5a接種后14天隨機(jī)選取水稻的根，調(diào)查每株水稻上根結(jié)的數(shù)量，計算根結(jié)數(shù)量防效；用酸性品紅對根進(jìn)行染色，調(diào)查水稻根中侵入的線蟲數(shù)量，計算線蟲減退率。溫室實驗水稻根結(jié)數(shù)量防效計算公式如下：根結(jié)數(shù)量防效(％)＝(對照組根結(jié)數(shù)量-處理組根結(jié)數(shù)量)×100％/對照組根結(jié)數(shù)量。溫室實驗水稻根中的線蟲減退率計算公式如下：線蟲減退率(％)＝(對照組線蟲數(shù)量-處理組線蟲數(shù)量)×100％/對照組線蟲數(shù)量。接種后14天調(diào)查結(jié)果顯示，aw2017對溫室中水稻根結(jié)結(jié)蟲的根結(jié)數(shù)量防效大于60％(表2)。表2利用根結(jié)數(shù)量計算溫室實驗中aw2017對水稻根結(jié)線蟲的防效處理根結(jié)數(shù)量(個/株)根結(jié)數(shù)量防效(％)aw2017重復(fù)i10.1±3.1b64.3aaw2017重復(fù)ii9.7±5.2b65.7aaw2017重復(fù)iii10.9±4.1b61.5a對照28.3±3.6a-b接種后14天的染色結(jié)果顯示，aw2017處理后水稻對溫室中水稻根中的線蟲減退率達(dá)56.9％-62.2％(表3)。表3溫室實驗中aw2017水稻根結(jié)線蟲的減退率處理線蟲數(shù)量(條/株)線蟲減退率(％)aw2017重復(fù)i29.4±8.6b56.9aaw2017重復(fù)ii27.6±9.7b59.5aaw2017重復(fù)iii25.8±7.5b62.2a對照68.2±10.3ab實施例4：田間實驗檢測aw2017生防菌劑對水稻根結(jié)線蟲的防效選取往年水稻根結(jié)線蟲發(fā)病較重的田塊，用旋耕機(jī)將土壤整平并盡量使線蟲分布均勻。在水稻催芽3天后，將種子撒播在未被水浸沒的大田里，用實施例2制備的生防菌劑進(jìn)行噴霧，每畝用量約10l，以施用清水的處理作對照。30天后調(diào)查根結(jié)指數(shù)，計算根結(jié)指數(shù)防效。收獲期測量水稻的小區(qū)產(chǎn)量，計算aw2017生防菌劑對水稻產(chǎn)量的影響。根結(jié)線蟲病田間癥狀分級標(biāo)準(zhǔn)：0級：無根結(jié)，根系健康；1級：每株1-2個根結(jié)；2級：每株3-10個根結(jié)；3級：每株11-20個根結(jié)；4級：每株21-30個根結(jié)；5級：每株30個根結(jié)以上。田間實驗水稻根結(jié)指數(shù)計算公式如下：田間實驗水稻根結(jié)指數(shù)防效計算公式如下：根結(jié)指數(shù)防效(％)＝(對照組根結(jié)指數(shù)-處理組根結(jié)指數(shù))×100％/對照組根結(jié)指數(shù)。播種后30天調(diào)查結(jié)果顯示，aw2017對大田中水稻根結(jié)線蟲的根結(jié)指數(shù)防效為43.2％-52.3％(表4)。表4田間實驗aw2017對水稻根結(jié)線蟲的防效處理根結(jié)指數(shù)根結(jié)指數(shù)防效(％)aw2017重復(fù)i46.5±6.4a47.7aaw2017重復(fù)ii50.5±4.8a43.2aaw2017重復(fù)iii42.0±6.2a52.3a對照87.5±8.6bb收獲期調(diào)查結(jié)果顯示，aw2017對大田中水稻具有增產(chǎn)作用，增產(chǎn)19.2％-28.6％(表5)。表5田間實驗aw2017對水稻產(chǎn)量的影響處理小區(qū)產(chǎn)量(kg/80m2)增產(chǎn)率(％)aw2017重復(fù)i78.3±7.4a28.6aw2017重復(fù)ii76.4±6.7a25.5aw2017重復(fù)iii72.6±6.8ab19.2清水對照60.9±5.5b所述實驗結(jié)果均采用sas軟件的鄧肯氏新復(fù)極差法進(jìn)行差異顯著性分析，同列中相同字母表示差異不顯著,p≤0.05)。當(dāng)前第1頁12