本發(fā)明涉及鮮豬血提取技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種鮮豬血中免疫球蛋白的提取方法。
背景技術(shù)：
免疫球蛋白(immunoglobulin,ig)是對(duì)抗原刺激應(yīng)答中，b淋巴細(xì)胞產(chǎn)生的能與相應(yīng)抗原特異性的結(jié)合，產(chǎn)生各種免疫球效應(yīng)(生理效應(yīng))的一類球蛋白。大量研究報(bào)道了口服免疫球蛋白可以有效的預(yù)防和治療嬰幼兒由大腸桿菌和輪狀病毒引發(fā)的腸道疾病。豬血中免疫球蛋白含量很高，其中以g型免疫球蛋白(簡(jiǎn)稱igg)為主。
我國(guó)豬血資源十分豐富，在當(dāng)今動(dòng)物蛋白資源短缺的情況下，開(kāi)發(fā)利用豬血蛋白收到了中外學(xué)者的高度重視。從血液中提取免疫球蛋白常用的方法有鹽析法(如硫酸銨鹽析法、多聚磷酸鹽鹽析法等)、有機(jī)聚合物沉淀法、變性沉淀法等。其中多聚磷酸鹽鹽析法成本低，安全環(huán)保，高效可控，操作簡(jiǎn)單，是解決豬血清大規(guī)模igg分離制備的有效途徑之一。但目前還未有深入研究，使得所制備出的igg回收率、純度及活性保留率分別為64.5％、71.2％、85.2％左右。因此有必要對(duì)多聚磷酸鹽鹽析法提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，提高igg的提取率、純度及活性保留率。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明目的在于解決上述現(xiàn)有技術(shù)中igg的回收率、純度及活性保留率低等不足，提供一種成本低、安全環(huán)保、制備回收率高、純度好及活性保留率高的利用鮮豬血提取免疫球蛋白的方法。
為解決上述問(wèn)題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下：
一種鮮豬血中免疫球蛋白的提取方法，包括以下步驟：
步驟一：豬血清前處理：將新鮮豬血經(jīng)離心機(jī)兩次離心分離，第一次離心轉(zhuǎn)數(shù)5000rpm,時(shí)間10min，第二次離心轉(zhuǎn)數(shù)8000rpm，離心時(shí)間20min，收集上清液，即得豬血清。
步驟二：取豬血清，加入等量生理鹽水稀釋，邊攪拌邊緩慢加入多聚磷酸鹽溶液至多聚磷酸鹽終濃度質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.05-0.1％，然后調(diào)節(jié)溫度至20-50℃，檸檬酸溶液調(diào)節(jié)至ph3.0-6.0，在一定溫度水浴中保持相應(yīng)反應(yīng)溫度0.5-2h的時(shí)間；然后離心分離，棄沉淀，收集上清液，即得igg粗品；此步驟使用多聚磷酸鹽鹽析法，選擇質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.05％-1％多聚磷酸鹽使部分雜質(zhì)呈鹽析狀態(tài)，免疫球蛋白成鹽溶狀態(tài)；并且選擇適當(dāng)?shù)臏囟?0-50℃，ph3.0-6.0，時(shí)間0.5-2h，保證免疫球蛋白高的活性保留率及回收率。
步驟三：igg粗品過(guò)deae52-纖維素層析柱，以硼酸鹽緩沖液洗脫，收集洗脫液、濃縮即得igg產(chǎn)品；此步驟中層析柱采用deae52-纖維素層析柱，免疫球蛋白以靜電鍵結(jié)合到層析柱上，然后用硼酸鹽緩沖液洗脫，保證igg產(chǎn)品的高純度。
進(jìn)一步的技術(shù)方案是：步驟一所述的離心機(jī)為蝶片式離心機(jī)。
進(jìn)一步的技術(shù)方案是：步驟二所述的檸檬酸溶液的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2％。
進(jìn)一步的技術(shù)方案是：步驟二所述離心分離采用臺(tái)式過(guò)濾離心機(jī)，轉(zhuǎn)數(shù)大于10000rpm,離心時(shí)間30min。
進(jìn)一步的技術(shù)方案是：步驟三所述的硼酸鹽緩沖液濃度為濃度為0.02mol/l，ph為8.5。
綜上所述，由于采用了上述技術(shù)方案，本發(fā)明的有益效果是：
1、本發(fā)明采用多聚磷酸鹽鹽析法，在適當(dāng)?shù)臐舛?，溫度，ph，時(shí)間條件下提取免疫球蛋白，在經(jīng)deae52-纖維素層析柱提純。該方法反應(yīng)條件安全環(huán)保，操作簡(jiǎn)單、成本低。
2、本發(fā)明采用多聚磷酸鹽鹽析法，將鮮豬血分兩次分離離心得豬血清，使得纖維素蛋白剔除得更干凈，并且大大提高了免疫球蛋白溶出率；同時(shí)，本發(fā)明采用2％檸檬酸調(diào)節(jié)ph，使得免疫球蛋白回收率及活性保留率大大提高，回收率從原來(lái)的64.5％提高到82.6％，活性保留率從原來(lái)的85.2％提高到92.6％；另外本發(fā)明還結(jié)合了離子層析柱純化，使用0.02mol/lph8.5p硼酸鹽緩沖液洗脫，使得免疫球蛋白純度從原來(lái)的71.2％提高到89.7％。本發(fā)明在提高免疫球蛋白加工增值能力的同時(shí)，也充分利用了豬血資源，實(shí)現(xiàn)了資源的可持續(xù)利用，產(chǎn)生了巨大的經(jīng)濟(jì)效益。
具體實(shí)施方式
為了更好的對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行理解，下面通過(guò)具體的實(shí)施例進(jìn)行闡述和說(shuō)明。
實(shí)施例1
步驟一：豬血清前處理：將新鮮豬血經(jīng)碟片式離心機(jī)兩次離心分離，第一次離心轉(zhuǎn)數(shù)5000rpm,時(shí)間10min，第二次分離轉(zhuǎn)數(shù)8000rpm，離心時(shí)間20min，收集上清液得豬血清。
步驟二：取豬血清，加入等量生理鹽水稀釋，邊攪拌邊緩慢加入多聚磷酸鹽溶液至多聚磷酸鹽終濃度0.05％，然后調(diào)節(jié)溫度至20℃，2％檸檬酸溶液調(diào)節(jié)至ph3.0，在水浴中保持相應(yīng)溫度0.5h的時(shí)間；臺(tái)式過(guò)濾離心機(jī)離心分離，轉(zhuǎn)數(shù)大于10000rpm，時(shí)間30min，棄沉淀，收集上清液，即得igg粗品。
步驟三：igg粗品過(guò)deae52-纖維素層析柱，以0.02mol/lph8.5硼酸鹽緩沖液洗脫，收集洗脫液，濃縮即得igg產(chǎn)品，經(jīng)檢測(cè)純度為88％，回收率為79.6％，活性保留率為90％。
實(shí)施例2
步驟一：豬血清前處理：將新鮮豬血經(jīng)碟片式離心機(jī)兩次離心分離，第一次離心轉(zhuǎn)數(shù)5000rpm,時(shí)間10min，第二次分離轉(zhuǎn)數(shù)8000rpm，離心時(shí)間20min，收集上清液得豬血清。
步驟二：取豬血清，加入等量生理鹽水稀釋，邊攪拌邊緩慢加入多聚磷酸鹽溶液至多聚磷酸鹽終濃度0.1％，然后調(diào)節(jié)溫度至50℃，2％檸檬酸溶液調(diào)節(jié)至ph6.0，在水浴中保持相應(yīng)溫度1h的時(shí)間；臺(tái)式過(guò)濾離心機(jī)離心分離，轉(zhuǎn)數(shù)大于10000rpm，時(shí)間30min,棄沉淀，收集上清液，即得igg粗品。
步驟三：igg粗品過(guò)deae52-纖維素層析柱，以0.02mol/lph8.5硼酸鹽緩沖液洗脫，收集洗脫液，即得igg產(chǎn)品，經(jīng)檢測(cè)純度為89.2％，回收率為79.1％，活性保留率為91.2％。
實(shí)施例3
步驟一：豬血清前處理：將新鮮豬血經(jīng)碟片式離心機(jī)兩次離心分離，第一次離心轉(zhuǎn)數(shù)5000rpm,時(shí)間10min，第二次分離轉(zhuǎn)數(shù)8000rpm，離心時(shí)間20min，收集上清液得豬血清。
步驟二：取豬血清，加入等量生理鹽水稀釋，邊攪拌邊緩慢加入多聚磷酸鹽溶液至多聚磷酸鹽終濃度0.06％，然后調(diào)節(jié)溫度至40℃，2％檸檬酸溶液調(diào)節(jié)至ph4.5，在水浴中保持相應(yīng)溫度1h的時(shí)間；臺(tái)式過(guò)濾離心機(jī)離心分離，轉(zhuǎn)數(shù)大于10000rpm，時(shí)間30min，棄沉淀，收集上清液，即得igg粗品。
步驟三：igg粗品過(guò)deae52-纖維素層析柱，以0.02mol/lph8.5硼酸鹽緩沖液洗脫，收集洗脫液，即得igg產(chǎn)品，經(jīng)檢測(cè)純度為89.0％，回收率為80.2％，活性保留率為92.1％。
盡管這里參照本發(fā)明的解釋性實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了描述，上述實(shí)施例僅為本發(fā)明較佳的實(shí)施方式，本發(fā)明的實(shí)施并不受上述實(shí)施例的限制，應(yīng)該理解，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以設(shè)計(jì)出很多其他的修改和實(shí)施方式，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)所作的任何修改、等同替換和改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。