本發(fā)明屬于農(nóng)產(chǎn)品深加工及其副產(chǎn)品綜合利用的技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種具有免疫活性和抗紅細胞溶血活性的新型多肽及其制備方法。

背景技術(shù)：

麥胚球蛋白在脫脂小麥胚芽中占的比例約為15.6%。球蛋白的氨基酸含量均衡，必需氨基酸占總氨基酸的比例（e/t）在麥胚各蛋白中最高，其中蘇氨酸、纈氨酸、組氨酸、苯丙氨酸等必需氨基酸含量較高。除蛋氨酸外，其它必需氨基酸與fao/who推薦模式相符。球蛋白的蛋白消化率在麥胚各蛋白中最高，是非常有價值的天然蛋白質(zhì)。目前已發(fā)現(xiàn)堿性蛋白酶水解球蛋白可以獲得高免疫活性肽，但是對它的氨基酸序列以及其它生物活性尚屬未知領(lǐng)域。因此以小麥胚芽球蛋白為原料，發(fā)現(xiàn)新型多肽，并研究它的多種生理功能，對小麥胚芽蛋白尤其是球蛋白的開發(fā)利用具有深遠意義。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種具有免疫活性和抗紅細胞溶血活性的新型多肽及其制備方法。本發(fā)明所得多肽同時兼具免疫和抗紅細胞溶血兩種活性。

本發(fā)明以小麥胚芽球蛋白為原料制備的新型活性肽，其分子量是656da，氨基酸序列為glu-cys-phe-ser-thr-ala。該多肽具有免疫活性和抗紅細胞溶血活性，在80μg/ml時促進raw264.7細胞分泌no、il-6和tnf-α的能力與空白對照比分別提高了6.65、118.06和17.66倍；在1.5mg/ml時紅細胞溶血率僅有21.26%，同時可以使受損的紅細胞基本恢復(fù)到正常的細胞形態(tài)。

本發(fā)明的目的至少通過如下技術(shù)方案之一實現(xiàn)。

一種具有免疫活性和抗紅細胞溶血活性的新型多肽的制備方法，取麥胚球蛋白為原料，用堿性蛋白酶水解，冷凍干燥后，用deae-sepharose陰離子交換層析和sephadexg15凝膠滲透層析篩選出免疫活性較高的多肽，再經(jīng)過半制備rp-hplc和maldi-tof-ms質(zhì)譜分析得出該肽的分子量為656da，氨基酸序列為glu-cys-phe-ser-thr-ala，該肽是首次被發(fā)現(xiàn)的新型多肽；所述多肽同時還具有抗紅細胞溶血功效。

本發(fā)明具體包括如下步驟：

（1）麥胚球蛋白提?。簩⑦^100-300目的脫脂小麥胚芽粉以1：10-1:30（w/v）的比例加入水，在20-40℃下攪拌1-3h，6000-9000r/min低溫離心10-20min后，將沉淀繼續(xù)以1：10-1:30w/v的比例添加50-100mmtris-hcl，所述tris-hcl中含0.3-0.5mnacl的溶液，所述tris-hcl的ph為7.5-8.5，同樣在20-40℃下攪拌1-3h，6000-9000r/min低溫離心10-20min；獲得的上清液用0.1-1m的hcl調(diào)ph至4.0，6000-9000r/min低溫離心10-15min后，復(fù)溶并調(diào)ph至6.5-7.5，然后透析并冷凍干燥，得到麥胚球蛋白；

（2）酶解：將上述所得麥胚球蛋白配成質(zhì)量百分比為4%-5%的蛋白溶液，在90-95℃保溫5-10min，再冷卻至50℃，用0.1-1mnaoh調(diào)節(jié)ph,使ph值至7.5-8.0，加入堿性蛋白酶，在45-55℃水浴下水解3h，反應(yīng)過程中不斷加入0.1-1m的naoh，使ph保持不變，水解完成后，調(diào)節(jié)ph至6.5-7.5，95-100℃滅酶5-10min，冷卻后，6000-9000r/min離心5-10min，保留上清液并冷凍干燥，得到粗肽；

（3）分離純化及結(jié)構(gòu)鑒定：將得到的粗肽按2.5：1-5:1（w/v）的比例加入水，取5-10ml加入裝填了deae-sepharose陰離子填料的柱子中；所述填料體積為柱子體積的1/3或1/2，依次用水、0.05、0.1、0.3和0.5mnacl溶液進行梯度洗脫，每個梯度3-4h，流速30-35轉(zhuǎn)/min，在220nm有吸收峰的洗脫液透析和冷凍干燥后，取0.3mnacl洗脫組分；將免疫活性最高的組分按5：1-10:1（w/v）的比例加入水，取1-1.5ml加入裝填了sephadexg15填料的層析柱；所述填料體積占柱子體積的90%-95%，以10-15轉(zhuǎn)/min的流速收集樣品，在220nm共有兩個吸收峰，凍干后，得到兩種組分，取免疫活性最高的組分，按10:1-20:1的比例加入超純水，每次取0.2-1ml上半制備rp-hplc柱，流動相為乙腈/超純水/三氟乙酸（15%/85%/0.1%），只有單一的一個峰被洗脫出來，收集并凍干后，按1：1-2:1比例加入超純水，取1μl點在maldi靶板上自然晾干放入maldi-tof-ms質(zhì)譜儀的樣品室進行測定，累加10次單次掃描信號為最終一級質(zhì)譜圖；完成一級質(zhì)譜后，將信號較強的肽段進行提取，獲得二級質(zhì)譜；標注出主要的a、b、y和z系列由母離子碎裂后得到的子離子，人工推測氨基酸序列，得到具有免疫活性和抗紅細胞溶血活性的新型多肽。

上述方法中，所述麥胚球蛋白的蛋白含量在85%以上。

上述方法中，用堿性蛋白酶水解后，水解度在19%-20%。

上述方法中，所述具有免疫活性和抗紅細胞溶血活性的新型多肽的分子量為656da，氨基酸序列為glu-cys-phe-ser-thr-ala。

上述方法中，該多肽在80μg/ml時促進raw264.7細胞分泌no、il-6和tnf-α的能力與空白對照比分別提高了6.65、118.06和17.66倍；在1.5mg/ml時紅細胞溶血率僅有21.26%，同時使受損的紅細胞基本恢復(fù)到正常的細胞形態(tài)。

上述方法中，該多肽在80μg/ml時促進raw264.7細胞分泌no、il-6和tnf-α的能力與空白對照比分別提高了6.65、118.06和17.66倍；在1.5mg/ml時紅細胞溶血率僅有21.26%，同時使受損的紅細胞基本恢復(fù)到正常的細胞形態(tài)。

一種具有免疫活性和抗紅細胞溶血活性的新型多肽，所述多肽分子量為656da，氨基酸序列為glu-cys-phe-ser-thr-ala。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)勢在于：

（1）本發(fā)明得到的多肽是一種新型多肽，同時兼具免疫和抗紅細胞溶血兩種活性。

（2）所獲得的多肽為一種六肽，分子量低，較易被機體吸收。

附圖說明

圖1是本發(fā)明提供的新型活性肽的工藝流程圖；

圖2a為新型活性肽的一級質(zhì)譜圖；

圖2b為新型活性肽的二級質(zhì)譜圖;

圖3a是新型活性肽對刺激raw264.7細胞分泌no的影響圖；

圖3b是新型活性肽對刺激raw264.7細胞分泌il-6的影響；

圖3c是新型活性肽對刺激raw264.7細胞分泌tnf-α的影響圖；

圖4a是新型活性肽的人血紅細胞的溶血率；圖4b是人血紅細胞的正常組電鏡掃描；圖4c是人血紅細胞的創(chuàng)傷組電鏡掃描；圖4d是人血紅細胞的飽和組電鏡掃描。

具體實施方式

下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明作進一步地具體詳細描述，但本發(fā)明的實施方式不限于此，對于未特別注明的工藝參數(shù)，可參照常規(guī)技術(shù)進行。

本發(fā)明工藝方法流程圖見圖1，本發(fā)明中的免疫學(xué)評價分析包括測定raw264.7細胞分泌no、il-6和tnf-α的濃度。

實施例1

將過200目的脫脂小麥胚芽粉以1：10（kg/l）的比例加入水，在20℃下攪拌1h，7000r/min低溫離心10min后，將沉淀繼續(xù)以1：10的比例添加50mmtris-hcl（ph8.0），含0.5mnacl的溶液，同樣在25℃下攪拌1h，7000r/min低溫離心10min。獲得的上清液用0.1m的hcl調(diào)ph至4.0，7000r/min低溫離心10min后，復(fù)溶并調(diào)ph至6.5，然后用蒸餾水透析72h并冷凍干燥，得到麥胚球蛋白。其蛋白含量為85.3%。將上述所得麥胚球蛋白配成質(zhì)量百分比濃度為4%的蛋白溶液，在90℃保溫10min，再冷卻至45℃，用0.1mnaoh調(diào)節(jié)ph,使ph值至7.5，加入堿性蛋白酶，在45℃水浴下水解3h，反應(yīng)過程中不斷加入0.1m的naoh，使ph保持不變，水解完成后，調(diào)節(jié)ph至6.5，95℃滅酶10min，冷卻后7000r/min離心5min，保留上清液并冷凍干燥，得到粗肽。將得到的粗肽按2.5:1（w/v）的比例加入水，取10ml加入裝填了deae-sepharose陰離子填料的柱子中（填料一般裝柱子的1/3或1/2），依次用超純水、0.05、0.1、0.3和0.5mnacl溶液進行梯度洗脫，每個梯度3h，流速35轉(zhuǎn)/min，將在220nm有吸收峰的洗脫液透析和冷凍干燥后，通過免疫學(xué)評價得出0.3mnacl洗脫組分p3免疫活性最高，因此用該組分繼續(xù)分離純化。將p3組分按5：1（w/v）的比例加入水，取1.5ml加入裝填了sephadexg15填料的層析柱（填料占柱子的90%-95%）,以15轉(zhuǎn)/min的流速收集樣品，在220nm共有兩個吸收峰，凍干后通過免疫學(xué)評價得出p3-1的免疫活性最高。將p3-1按10:1的比例加入水，每次取1ml上半制備rp-hplc柱，流動相為乙腈/超純水/三氟乙酸（15%/85%/0.1%），其中三氟乙酸可以換成其它強酸，其中只有單一的一個峰被洗脫出來，收集并凍干后，按2:1比例加入超純水，取1μl點在maldi靶板上自然晾干放入maldi-tof-ms質(zhì)譜儀的樣品室進行測定，累加10次單次掃描信號為最終一級質(zhì)譜圖（見圖2a）。完成一級質(zhì)譜后，將信號較強的肽段進行提取，獲得二級質(zhì)譜（見圖2b）。標注出主要的a、b、y和z系列由母離子碎裂后得到的子離子，人工推測氨基酸序列。得到的新型多肽分子量是655.97da，氨基酸序列為glu-cys-phe-ser-thr-ala。該多肽具有免疫活性和抗紅細胞溶血活性，在80μg/ml時促進raw264.7細胞分泌no、il-6和tnf-α的能力與空白對照比分別提高了6.65、118.06和17.66倍（如圖3a~圖3c，新型活性肽的免疫活性，a是對刺激raw264.7細胞分泌no的影響，b是對刺激raw264.7細胞分泌il-6的影響，c是對刺激raw264.7細胞分泌tnf-α的影響）；在1.5mg/ml時紅細胞溶血率僅有21.26%，同時可以使受損的紅細胞基本恢復(fù)到正常的細胞形態(tài)（如圖4a~圖4d新型活性肽的抗紅細胞溶血，a是人血紅細胞的溶血率，b是人血紅細胞的電鏡掃描）。

實施例2

將過200目的脫脂小麥胚芽粉以1：20（kg/l）的比例加入水，在30℃下攪拌2h，8000r/min低溫離心15min后，將沉淀繼續(xù)以1：20的比例添加80mmtris-hcl（ph8.0），含0.5mnacl的溶液，同樣在30℃下攪拌2h，8000r/min低溫離心15min。獲得的上清液用0.5m的hcl調(diào)ph至4.0，8000r/min低溫離心15min后，復(fù)溶并調(diào)ph至7.0，然后用蒸餾水透析72h并冷凍干燥，得到麥胚球蛋白。其蛋白含量為85.3%。將上述所得麥胚球蛋白配成質(zhì)量百分比濃度為4.5%的蛋白溶液，在95℃保溫5min，再冷卻至50℃，用0.5mnaoh調(diào)節(jié)ph,使ph值至7.5，加入堿性蛋白酶，在50℃水浴下水解3h，反應(yīng)過程中不斷加入0.5m的naoh，使ph保持不變，水解完成后，調(diào)節(jié)ph至7.0，95℃滅酶10min，冷卻后8000r/min離心10min，保留上清液并冷凍干燥，得到粗肽。將得到的粗肽按5:1（w/v）的比例加入水，取5ml加入裝填了deae-sepharose陰離子填料的柱子中（填料一般裝柱子的1/3或1/2），依次用超純水、0.05、0.1、0.3和0.5mnacl溶液進行梯度洗脫，每個梯度4h，流速30轉(zhuǎn)/min，將在220nm有吸收峰的洗脫液透析和冷凍干燥后，通過免疫學(xué)評價得出0.3mnacl洗脫組分p3免疫活性最高，因此用該組分繼續(xù)分離純化。將p3組分按10：1（w/v）的比例加入水，取1ml加入裝填了sephadexg15填料的層析柱（填料占柱子的90%-95%）,以10轉(zhuǎn)/min的流速收集樣品，在220nm共有兩個吸收峰，凍干后通過免疫學(xué)評價得出p3-1的免疫活性最高。將p3-1按15:1的比例加入水，每次取0.5ml上半制備rp-hplc柱，流動相為乙腈/超純水/三氟乙酸（15%/85%/0.1%），其中三氟乙酸可以換成其它強酸，其中只有單一的一個峰被洗脫出來，收集并凍干后，按1:1比例加入超純水，取1μl點在maldi靶板上自然晾干放入maldi-tof-ms質(zhì)譜儀的樣品室進行測定，累加10次單次掃描信號為最終一級質(zhì)譜圖（見圖2a）。完成一級質(zhì)譜后，將信號較強的肽段進行提取，獲得二級質(zhì)譜（見圖2b）。標注出主要的a、b、y和z系列由母離子碎裂后得到的子離子，人工推測氨基酸序列。得到的新型多肽分子量是655.97da，氨基酸序列為glu-cys-phe-ser-thr-ala。該多肽具有免疫活性和抗紅細胞溶血活性，在80μg/ml時促進raw264.7細胞分泌no、il-6和tnf-α的能力與空白對照比分別提高了6.65、118.06和17.66倍（如圖3a~圖3c，新型活性肽的免疫活性，a是對刺激raw264.7細胞分泌no的影響，b是對刺激raw264.7細胞分泌il-6的影響，c是對刺激raw264.7細胞分泌tnf-α的影響）；在1.5mg/ml時紅細胞溶血率僅有21.26%，同時可以使受損的紅細胞基本恢復(fù)到正常的細胞形態(tài)（如圖4a~圖4d新型活性肽的抗紅細胞溶血，a是人血紅細胞的溶血率，b是人血紅細胞的電鏡掃描）。

實施例3

將過200目的脫脂小麥胚芽粉以1：30（kg/l）的比例加入水，在35℃下攪拌3h，9000r/min低溫離心10min后，將沉淀繼續(xù)以1：30的比例添加100mmtris-hcl（ph8.0），含0.5mnacl的溶液，同樣在35℃下攪拌3h，9000r/min低溫離心10min。獲得的上清液用1.0m的hcl調(diào)ph至4.0，9000r/min低溫離心10min后，復(fù)溶并調(diào)ph至7.5，然后用蒸餾水透析72h并冷凍干燥，得到麥胚球蛋白。其蛋白含量為85.3%。將上述所得麥胚球蛋白配成質(zhì)量百分比濃度為5%的蛋白溶液，在95℃保溫5min，再冷卻至55℃，用1mnaoh調(diào)節(jié)ph,使ph值至8.0，加入堿性蛋白酶，在55℃水浴下水解3h，反應(yīng)過程中不斷加入1m的naoh，使ph保持不變，水解完成后，調(diào)節(jié)ph至7.5，95℃滅酶10min，冷卻后9000r/min離心5min，保留上清液并冷凍干燥，得到粗肽。將得到的粗肽按5:1（w/v）的比例加入水，取5ml加入裝填了deae-sepharose陰離子填料的柱子中（填料一般裝柱子的1/3或1/2），依次用超純水、0.05、0.1、0.3和0.5mnacl溶液進行梯度洗脫，每個梯度4h，流速30轉(zhuǎn)/min，將在220nm有吸收峰的洗脫液透析和冷凍干燥后，通過免疫學(xué)評價得出0.3mnacl洗脫組分p3免疫活性最高，因此用該組分繼續(xù)分離純化。將p3組分按10：1（w/v）的比例加入水，取1ml加入裝填了sephadexg15填料的層析柱（填料占柱子的90%-95%）,以10轉(zhuǎn)/min的流速收集樣品，在220nm共有兩個吸收峰，凍干后通過免疫學(xué)評價得出p3-1的免疫活性最高。將p3-1按20:1的比例加入水，每次取0.2ml上半制備rp-hplc柱，流動相為乙腈/超純水/三氟乙酸（15%/85%/0.1%），其中三氟乙酸可以換成其它強酸，其中只有單一的一個峰被洗脫出來，收集并凍干后，按1:1比例加入超純水，取1μl點在maldi靶板上自然晾干放入maldi-tof-ms質(zhì)譜儀的樣品室進行測定，累加10次單次掃描信號為最終一級質(zhì)譜圖（見圖2a）。完成一級質(zhì)譜后，將信號較強的肽段進行提取，獲得二級質(zhì)譜（見圖2b）。標注出主要的a、b、y和z系列由母離子碎裂后得到的子離子，人工推測氨基酸序列。得到的新型多肽分子量是655.97da，氨基酸序列為glu-cys-phe-ser-thr-ala。該多肽具有免疫活性和抗紅細胞溶血活性，在80μg/ml時促進raw264.7細胞分泌no、il-6和tnf-α的能力與空白對照比分別提高了6.65、118.06和17.66倍（如圖3a~圖3c，新型活性肽的免疫活性，a是對刺激raw264.7細胞分泌no的影響，b是對刺激raw264.7細胞分泌il-6的影響，c是對刺激raw264.7細胞分泌tnf-α的影響）；在1.5mg/ml時紅細胞溶血率僅有21.26%，同時可以使受損的紅細胞基本恢復(fù)到正常的細胞形態(tài)（如圖4a~圖4d新型活性肽的抗紅細胞溶血，a是人血紅細胞的溶血率，b是人血紅細胞的電鏡掃描）。

sequencelisting

<110>華南理工大學(xué)

<120>一種具有免疫活性和抗紅細胞溶血活性的新型多肽及其制備方法

<130>

<160>1

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>6

<212>prt

<213>人工序列

<400>1

glncyspheserthrala

15