本發(fā)明涉及一種活性多肽在離子通道工具試劑中的用途，尤其是用化學(xué)法制備的廣西纓毛蛛毒素提取物-蜘蛛抑鈉肽-i（簡(jiǎn)寫為spnp-i）在制備電壓門控鉀通道工具試劑-kv2.1型鉀通道抑制劑中的用途。

背景技術(shù)：

電壓門控鉀通道廣泛分布于神經(jīng)元、心肌、血管平滑肌、胰腺、骨骼肌等可興奮性組織中，是一種重要的跨膜結(jié)構(gòu)蛋白，其參與調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)的分泌、血管收縮、胰腺分泌和骨骼肌興奮性等多種生理過程,同時(shí)也是治療藥物作用的重要靶標(biāo)之一。鉀通道在動(dòng)作電位的產(chǎn)生和傳播過程中的關(guān)鍵性作用，電壓門控鉀通道成為很多動(dòng)植物毒素的作用靶標(biāo)。鉀離子通道的結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系研究已經(jīng)成為國際上的研究熱點(diǎn)。電壓門控鉀通道很可能成為神經(jīng)性和心血管等疾病的重要治療靶點(diǎn)。自然界的動(dòng)物毒素是一類具有很高實(shí)用價(jià)值和應(yīng)用前景的工具試劑或藥物導(dǎo)向物質(zhì)，不僅是有毒動(dòng)物抵御天敵的有力武器，也是從事神經(jīng)生物學(xué)和生理學(xué)研究、天然創(chuàng)新藥物開發(fā)以及蛋白質(zhì)基礎(chǔ)研究的寶貴材料,同時(shí)也是研究離子通道的獨(dú)特“分子探針和解密器”。迄今為止，從多種動(dòng)物（如蝎、蜘蛛、蛇以及海洋動(dòng)物等）的毒液中鑒定到了很多作用于鉀通道的活性成分。它們通過與鉀通道的不同位置相結(jié)合從而引起通道的動(dòng)力學(xué)特征發(fā)生相應(yīng)的變化，如通道去失活、阻塞通道口、易化激活、失活延緩等。通過闡述這些特異性調(diào)制劑作用于鉀通道的分子機(jī)制，除了在理論上可深入推測(cè)鉀通道亞型之間的功能活動(dòng)區(qū)別和門控活動(dòng)機(jī)制外，還可以為將它們開發(fā)成治療人類相關(guān)疾病的新藥提供充分的理論基礎(chǔ)和廣闊的應(yīng)用前景。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明旨在于提供一種廣西纓毛蛛毒素提取物-蜘蛛抑鈉肽-i在制備電壓門控鉀通道工具試劑-kv2.1型鉀通道抑制劑中的應(yīng)用，所述的廣西纓毛蛛毒素提取物-蜘蛛抑鈉肽-i（簡(jiǎn)寫為spnp-i），其氨基酸序列為：

nh2-alacysglyglnphetrptrplyscysglygluglylysproprocyscysalaasnphealacyslysileglyleutyrleucysiletrpserpro-oh

其特征在于廣西纓毛蛛毒素提取物-蜘蛛抑鈉肽-i作為單一有效活性組份用于制備kv2.1型鉀通道抑制劑。

蜘蛛抑鈉肽-i作為單一有效活性組分用于制備kv2.1型鉀通道抑制劑。

蜘蛛抑鈉肽-i制備成細(xì)胞外給藥的kv2.1型鉀通道工具試劑。

蜘蛛抑鈉肽-i在制備kv2.1型鉀通道工具試劑或抑制劑時(shí)，配制細(xì)胞外給藥的劑量為10μmol/l。

蜘蛛抑鈉肽-i對(duì)kv2.1型鉀通道的作用具有濃度依賴性，半數(shù)有效作用劑量ic50為8.05μmol/l。

蜘蛛抑鈉肽-i對(duì)kv2.1型鉀通道的作用是時(shí)間依從的。

附圖說明

圖1是10μmol/lspnp-i對(duì)kv2.1型鉀通道的影響。

圖2是spnp-i作用于kv2.1鉀通道的濃度-效應(yīng)關(guān)系曲線。

具體實(shí)施方式

為了更好的理解和更充分公開本發(fā)明，下面將通過細(xì)胞外給藥途徑，采用爪蟾卵母細(xì)胞模型來說明蜘蛛抑鈉肽-i的kv2.1型鉀通道抑制作用。

1、實(shí)驗(yàn)材料和方法

1.1質(zhì)粒的線性化及回收

cdna的回收操作如下：取kv2.1質(zhì)粒20μl,10×buffer5μl,h2o22μl，限制性內(nèi)切酶noti3μl,震蕩混合后，37℃下放置5hr。酶切后的產(chǎn)物用0.8%的agarose膠電泳，切膠后用離心柱型瓊脂糖凝膠dna回收試劑盒回收。割下含dna的agarose膠放入1.5ml離心管中，每100mg膠加入300μl溶膠液，置65℃水浴10min,使膠完全溶化,混合液轉(zhuǎn)入到已經(jīng)套入收集管的吸附柱內(nèi),13000rpm離心30s,倒掉廢液,加入700μl漂洗液,13000rpm離心30s,倒掉廢液,加入500μl漂洗液,13000rpm離心30s,倒掉廢液,13000rpm空柱離心2min,盡量除去漂洗液。將吸附柱放入一干凈離心管中,加入適量經(jīng)65-70℃水浴預(yù)熱的洗脫緩沖液,室溫放置2min，13000rpm離心1min收集dna溶液。

1.2cdna的體外轉(zhuǎn)錄和mrna的純化

取cdna20μl，10×buffer2μl，2×ntp/cap10μl，t7rna聚合酶2μl，上述溶液震蕩混合后，37℃水浴2hr；加1μldnaase，37℃加熱5min。將產(chǎn)物轉(zhuǎn)入新的1.5ml離心管中，加入15μl醋酸銨和115μlh2o終止反應(yīng)。加入150μl酚/氯仿，混勻，靜置5min，12000rpm低溫離心5min，上清轉(zhuǎn)移至新的離心管，然后加入等體積氯仿，混勻，12000rpm低溫離心10min，吸上清至新離心管，加入350μl預(yù)冷的異丙醇，-20℃放置30min，12000rpm低溫離心10min，移去上清，加入預(yù)冷的70%乙醇，1000rpm低溫離心5min，去上清，風(fēng)干，加入適量無rna酶的ddh2o。取轉(zhuǎn)錄好的mrna1μl，用紫外分光光度計(jì)測(cè)量其濃度，檢測(cè)結(jié)果為1.7～1.9μg/μl。將mrna稀釋到1.0ng/nl,-70℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3卵母細(xì)胞標(biāo)本的制備和培養(yǎng)

nd96溶液（mm）：nacl96、kcl2、cacl2-2h2o1.8、mgcl2-6h2o1、hepes-naoh5。用naoh調(diào)ph至7.5。

or2溶液(mm):nacl82.5、kcl2.5、cacl2-2h2o1、mgcl2-6h2o1、na2hpo4-12h2o1、hepes5。用naoh調(diào)ph至7.5。使用前加入青霉素（10萬單位/l）。

卵母細(xì)胞的分離：雌性非洲爪蟾購自中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所。取成年雌性非洲爪蟾，放入碎冰內(nèi)冷凍麻醉約30min，腹部朝上置于冰上，用鑷子和手術(shù)刀在其腹部劃開一長約1.0～1.5cm的口子，再把鑷子伸入腹腔夾出卵巢，剪取2-3葉放入無鈣nd96溶液中。將取出的卵葉用系線鑷初步分散成10－20個(gè)細(xì)胞一團(tuán)。然后轉(zhuǎn)入50ml離心管中，加入溶有膠原酶的無鈣nd96溶液，酶的終濃度為1mg/ml。在25℃,60rpm下酶解50min。取細(xì)胞觀察，如果有80%以上的細(xì)胞已經(jīng)去除微血管及濾泡膜，則停止酶解。酶解完畢，用無鈣的nd96溶液多次洗滌細(xì)胞，洗去殘留的膠原酶。然后，挑選個(gè)體比較大、動(dòng)植物極分明的細(xì)胞轉(zhuǎn)入or2溶液中培養(yǎng)。

1.4電壓鉗實(shí)驗(yàn)

通過顯微注射系統(tǒng)（wpi，german）將mrna注入挑選好的卵母細(xì)胞，每次注射體積約為20-50nl，從黑色的動(dòng)物極一側(cè)注入。之后，放入16℃低溫振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2～4天，每天更換一次新鮮的or2培養(yǎng)液。雙電極桿電壓鉗記錄在室溫（18～22℃）下進(jìn)行。電流和電壓玻璃電極經(jīng)一步拉制而成，灌注3mkcl后電阻為0.5-1.5mω。將細(xì)胞放入細(xì)胞槽中，用or2溶液灌流。然后將兩個(gè)玻璃電極分別插入細(xì)胞的動(dòng)植物兩極。將細(xì)胞膜鉗制在-80mv，給予去極化脈沖刺激。所用放大器為turbotec-03x（npielectronic,germany）。數(shù)據(jù)采集濾波為2khz。參比電極用ag/agcl電極與浴槽相連。刺激脈沖控制和電流信號(hào)記錄采用cellworks數(shù)據(jù)采集系統(tǒng)（npi公司，germany）。線性漏電流和電容電流不予刪除。數(shù)據(jù)分析采用sigmaplot9.0軟件進(jìn)行。所有毒素直接用溶液溶解并配制成目的濃度。實(shí)驗(yàn)過程中，為防止毒素粘在細(xì)胞槽壁上，可在or2溶液中加入少量bsa（sigma，usa）。

2、實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

2.1spnp-i對(duì)kv2.1型電壓門控鉀通道的影響

我們檢測(cè)了spnp-i對(duì)表達(dá)在爪蟾卵母細(xì)胞上的延遲整流鉀通道kv2.1的作用。延遲整流鉀通道kv2.1電流以去極化方式誘導(dǎo)：將細(xì)胞膜電位鉗制在-90mv，以200ms的時(shí)程給予一測(cè)試電壓0mv，每隔5s重復(fù)一次。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，10μm的spnp-i能抑制69%的kv2.1通道電流（如圖1）。spnp-i對(duì)kv2.1電流的抑制效應(yīng)具有濃度依從性，spnp-i的半數(shù)有效作用劑量ic50為8.05μmol/l（圖2）。spnp-i對(duì)kv2.1電流的抑制具有時(shí)間依從性，當(dāng)濃度增加為10μm時(shí)，可在約3min的時(shí)間內(nèi)達(dá)到最大抑制程度。

2.2spnp-i對(duì)kv2.1型鉀通道門控特征的影響

門控調(diào)制毒素與通道作用一個(gè)非常重要的特征是通過使通道的激活電位向去極化方向漂移從而調(diào)制通道門控的動(dòng)力學(xué)。spnp-i對(duì)kv2.1通道i-v曲線的影響：當(dāng)細(xì)胞膜電位鉗制在-80mv時(shí)，kv2.1通道的起始激活電壓約為-40mv，spnp-i能使kv2.1通道的激活電位朝去極化方向漂移約20mv，說明它是作為通道的門控調(diào)制劑在發(fā)揮作用。

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