本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域，具體涉及cnusmxy1蛋白及其在培育抗蟲植物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：植物抗性是指植物適應(yīng)逆境(如凍害、高溫、病蟲、淹水、干旱等)的能力。挖掘和開發(fā)抗性相關(guān)的基因?qū)τ谵r(nóng)業(yè)生產(chǎn)具有重大的科學(xué)意義。甜菜夜蛾(beetarmyworm)學(xué)名spodopteraexiguahiibner俗稱白菜褐夜蛾，隸屬于鱗翅目、夜蛾科，是一種世界性分布、間歇性大發(fā)生的以危害蔬菜為主的雜食性害蟲。對大蔥、甘藍(lán)、大白菜、芹菜、菜花、胡蘿卜、蘆筍、蕹菜、莧菜、辣椒、豇豆、花椰菜、茄子、芥蘭、番茄、菜心、小白菜、青花菜、菠菜、蘿卜等蔬菜都有危害。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的是提供cnusmxy1蛋白及其在培育抗蟲植物中的應(yīng)用。本發(fā)明提供的蛋白質(zhì)，獲自哥倫比亞生態(tài)型擬南芥蛋白質(zhì)，命名為cnusmxy1蛋白，是如下(a)或(b)或(c)：(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；(b)將序列1的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與植物抗蟲性相關(guān)的由序列1衍生的蛋白質(zhì)。(c)將序列1的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與植物抗菌性相關(guān)的由序列1衍生的蛋白質(zhì)。為了使(b)或(c)中的蛋白質(zhì)便于純化和檢測，可在由序列表中序列1所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)的氨基末端或羧基末端連接上如表1所示的標(biāo)簽。表1標(biāo)簽的序列標(biāo)簽殘基序列poly-arg5-6(通常為5個)rrrrrpoly-his2-10(通常為6個)hhhhhhflag8dykddddkstrep-tagii8wshpqfekc-myc10eqkliseedl上述(b)或(c)中的蛋白質(zhì)可人工合成，也可先合成其編碼基因，再進(jìn)行生物表達(dá)得到。上述(b)或(c)中的蛋白質(zhì)的編碼基因可通過將序列表中序列2所示的dna序列中缺失一個或幾個氨基酸殘基的密碼子，和/或進(jìn)行一個或幾個堿基對的錯義突變，和/或在其5′端和/或3′端連上表1所示的標(biāo)簽的編碼序列得到。編碼cnusmxy1蛋白的基因(命名為cnusmxy1基因)也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。所述基因具體可為如下1)或2)或3)或4)或5)的dna分子：1)編碼區(qū)如序列表中序列2所示的dna分子；2)在嚴(yán)格條件下與1)限定的dna序列雜交且編碼植物抗蟲性相關(guān)蛋白的dna分子；3)與1)或2)限定的dna序列具有90％以上同源性且編碼植物抗蟲性相關(guān)蛋白的dna分子；4)在嚴(yán)格條件下與1)限定的dna序列雜交且編碼植物抗菌性相關(guān)蛋白的dna分子；5)與1)或2)限定的dna序列具有90％以上同源性且編碼植物抗菌性相關(guān)蛋白的dna分子。上述嚴(yán)格條件可為用0.1×sspe(或0.1×ssc)，0.1％sds的溶液，在dna或者rna雜交實驗中65℃下雜交并洗膜。含有cnusmxy1基因的重組表達(dá)載體、表達(dá)盒、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系、轉(zhuǎn)基因植物組織或重組菌均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍?？捎矛F(xiàn)有的表達(dá)載體構(gòu)建含有cnusmxy1基因的重組表達(dá)載體。所述表達(dá)載體包括雙元農(nóng)桿菌載體和可用于微彈轟擊的載體等。使用cnusmxy1基因構(gòu)建重組表達(dá)載體時，可在其轉(zhuǎn)錄起始核苷酸前加上任何一種增強(qiáng)型、組成型、組織特異型或誘導(dǎo)型啟動子，它們可單獨使用或與其它的植物啟動子結(jié)合使用；此外，使用cnusmxy1基因構(gòu)建重組表達(dá)載體時，還可使用增強(qiáng)子，包括翻譯增強(qiáng)子或轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子，這些增強(qiáng)子區(qū)域可以是atg起始密碼子或鄰接區(qū)域起始密碼子等，但必需與編碼序列的閱讀框相同，以保證整個序列的正確翻譯。所述翻譯控制信號和起始密碼子的來源是廣泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻譯起始區(qū)域可以來自轉(zhuǎn)錄起始區(qū)域或結(jié)構(gòu)基因。為了便于對轉(zhuǎn)基因植物或轉(zhuǎn)基因微生物進(jìn)行鑒定及篩選，可對所用表達(dá)載體進(jìn)行加工，如加入在植物或微生物中表達(dá)可產(chǎn)生顏色變化的酶或發(fā)光化合物的基因、具有抗性的抗生素標(biāo)記物或是抗化學(xué)試劑標(biāo)記基因等。從轉(zhuǎn)基因安全性考慮，可不加任何選擇性標(biāo)記基因，直接以表型篩選轉(zhuǎn)化植物或微生物。所述重組表達(dá)載體具體可為重組質(zhì)粒pcambia1300-cnusmxy1。重組質(zhì)粒pcambia1300-cnusmxy1為將序列表的序列2所示的雙鏈dna分子插入載體pcambia1300-35s-3ha的多克隆位點(例如sali和spei酶切位點之間)得到的重組質(zhì)粒。本發(fā)明還保護(hù)cnusmxy1蛋白的應(yīng)用，為如下(d1)或(d2)或(d3)或(d4)中的至少一種：(d1)調(diào)控植物的抗蟲性；(d2)提高植物的抗蟲性；(d3)調(diào)控植物的抗菌性；(d4)降低植物的抗菌性。以上任一所述抗蟲性具體可為對夜蛾的抗性，更具體可為對甜菜夜蛾的抗性。以上任一所述抗菌性可為對細(xì)菌的抗性，更具體可為對丁香假單胞菌的抗性，更具體可為對丁香假單胞菌pstdc3000的抗性。以上任一所述植物可為單子葉植物或雙子葉植物。所述雙子葉植物具體可為十字花科植物，更具體可為擬南芥，更具體可為哥倫比亞生態(tài)型擬南芥。本發(fā)明還保護(hù)一種培育轉(zhuǎn)基因植物的方法，是將cnusmxy1基因?qū)肽康闹参镏?，得到抗蟲性高于目的植物的轉(zhuǎn)基因植物。所述抗蟲性具體可為對夜蛾的抗性，更具體可為對甜菜夜蛾的抗性。所述目的植物可為單子葉植物或雙子葉植物。所述雙子葉植物具體可為十字花科植物，更具體可為擬南芥，更具體可為哥倫比亞生態(tài)型擬南芥。所述cnusmxy1基因具體可通過以上任一所述重組表達(dá)載體導(dǎo)入所述目的植物。攜帶有cnusmxy1基因的重組表達(dá)載體可通過ti質(zhì)粒、ri質(zhì)粒、植物病毒載體、直接dna轉(zhuǎn)化、顯微注射、電導(dǎo)、農(nóng)桿菌介導(dǎo)等常規(guī)生物學(xué)方法轉(zhuǎn)化到目的植物中。本發(fā)明還保護(hù)一種植物育種方法，是提高目的植物中cnusmxy1蛋白的含量和/或活性，從而提高目的植物的抗蟲性。所述抗蟲性具體可為對夜蛾的抗性，更具體可為對甜菜夜蛾的抗性。所述植物可為單子葉植物或雙子葉植物。所述雙子葉植物具體可為十字花科植物，更具體可為擬南芥，更具體可為哥倫比亞生態(tài)型擬南芥。本發(fā)明還保護(hù)一種培育轉(zhuǎn)基因植物的方法，是將cnusmxy1基因?qū)肽康闹参镏?，得到抗菌性低于目的植物的轉(zhuǎn)基因植物。所述抗菌性可為對細(xì)菌的抗性，更具體可為對丁香假單胞菌的抗性，更具體可為對丁香假單胞菌pstdc3000的抗性。所述目的植物可為單子葉植物或雙子葉植物。所述雙子葉植物具體可為十字花科植物，更具體可為擬南芥，更具體可為哥倫比亞生態(tài)型擬南芥。所述cnusmxy1基因具體可通過以上任一所述重組表達(dá)載體導(dǎo)入所述目的植物。攜帶有cnusmxy1基因的重組表達(dá)載體可通過ti質(zhì)粒、ri質(zhì)粒、植物病毒載體、直接dna轉(zhuǎn)化、顯微注射、電導(dǎo)、農(nóng)桿菌介導(dǎo)等常規(guī)生物學(xué)方法轉(zhuǎn)化到目的植物中。本發(fā)明還保護(hù)一種植物育種方法，是提高目的植物中cnusmxy1蛋白的含量和/或活性，從而降低目的植物的抗菌性。所述抗菌性可為對細(xì)菌的抗性，更具體可為對丁香假單胞菌的抗性，更具體可為對丁香假單胞菌pstdc3000的抗性。所述植物可為單子葉植物或雙子葉植物。所述雙子葉植物具體可為十字花科植物，更具體可為擬南芥，更具體可為哥倫比亞生態(tài)型擬南芥。本發(fā)明還保護(hù)cnusmxy1蛋白、cnusmxy1基因、以上任一所述重組表達(dá)載體或以上任一所述方法在植物育種中的應(yīng)用。所述植物育種的目的為培育抗蟲植物。所述抗蟲具體可抗夜蛾，更具體可為抗甜菜夜蛾。所述植物育種的目的為培育抗菌植物。所述抗菌可為抗細(xì)菌，更具體可為抗丁香假單胞菌，更具體可為抗丁香假單胞菌pstdc3000。所述植物為單子葉植物或雙子葉植物。所述植物具體可為擬南芥，例如哥倫比亞生態(tài)型擬南芥。本發(fā)明提供了cnusmxy1蛋白以及cnusmxy1基因。過表達(dá)cnusmxy1基因使得植物對的抗蟲性增強(qiáng)。本發(fā)明有助于促進(jìn)人們對植物抗性的研究，有助于培育抗蟲植物。本發(fā)明在農(nóng)業(yè)領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用空間和市場前景。附圖說明圖1為重組質(zhì)粒pcambia1300-cnusmxy1部分元件的示意圖。圖2為相對表達(dá)水平、抗蟲性鑒定和抗菌性鑒定的結(jié)果。具體實施方式以下的實施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的試驗材料，如無特殊說明，均為自常規(guī)生化試劑商店購買得到的。以下實施例中的定量試驗，均設(shè)置三次重復(fù)實驗，結(jié)果取平均值。哥倫比亞生態(tài)型擬南芥用col-0表示。cnusmxy1蛋白是本發(fā)明的發(fā)明人從哥倫比亞生態(tài)型擬南芥中發(fā)現(xiàn)的新蛋白，如序列表的序列1所示。編碼cnusmxy1蛋白的基因命名為cnusmxy1基因，其cdna中的開放閱讀框如序列表的序列2所示。提及載體pcambia1300-35s-3ha的文獻(xiàn)：tworedundantreceptor-likecytoplasmickinasesfunctiondownstreamofpatternrecognitionreceptorstoregulateactivationofsabiosynthesis1；qingkong,tongjunsun,naqu,junlingma,mengli,yu-ticheng,qianzhang,diwu,zhibinzhang,yuelinzhang；plantphysiol.vol.171,2016,1344-1354。提及甜菜夜蛾的文獻(xiàn)：thebhlhsubgroupiiidfactorsnegativelyregulatejasmonate-mediatedplantdefenseanddevelopment.songs,qit,fanm,zhangx,gaoh,huangh,wud,guoh,xied.plosgenet.2013；9(7):e1003653.doi:10.1371/journal.pgen.1003653.epub2013jul25。提及丁香假單胞菌pstdc3000(pseudomonassyringaepv.tomatodc3000)的文獻(xiàn)：pseudomonassyringaepv.tomatodc3000:amodelpathogenforprobingdiseasesusceptibilityandhormonesignalinginplants.xinxf,hesy.annurevphytopathol.2013；51:473-98.doi:10.1146/annurev-phyto-082712-102321.epub2013may31.review。實施例1、轉(zhuǎn)基因植物的獲得和鑒定一、重組表達(dá)載體的構(gòu)建1、合成序列表的序列2所示的雙鏈dna分子。2、以步驟1合成的dna分子為模板，采用f1和r1組成的引物對進(jìn)行pcr擴(kuò)增，得到pcr擴(kuò)增產(chǎn)物。f1：5’-acgcgtcgacatgattaataccgacgataacttattg-3’；r1：5’-cggactagttcagctaattttcgacatcaacaaatc-3’。3、取步驟2得到的pcr擴(kuò)增產(chǎn)物，采用限制新內(nèi)切酶sali和spei進(jìn)行雙酶切，回收酶切產(chǎn)物。4、取載體pcambia1300-35s-3ha，采用限制新內(nèi)切酶sali和spei進(jìn)行雙酶切，回收載體骨架。5、將步驟3的酶切產(chǎn)物和步驟4的載體骨架連接，得到重組質(zhì)粒pcambia1300-cnusmxy1(部分元件的示意圖見圖1)。根據(jù)測序結(jié)果，對重組質(zhì)粒pcambia1300-cnusmxy1進(jìn)行結(jié)構(gòu)描述如下：在載體pcambia1300-35s-3ha的sali和spei酶切位點之間插入了序列表的序列2所示的雙鏈dna分子。二、轉(zhuǎn)基因植物的獲得1、將重組質(zhì)粒pcambia1300-cnusmxy1導(dǎo)入農(nóng)桿菌gv3101，得到重組農(nóng)桿菌。2、采用蘸花法，用步驟1得到的重組農(nóng)桿菌侵染哥倫比亞生態(tài)型擬南芥，然后正常管理并收獲種子，即為t1代種子。3、將t1代種子播種于含20mg/l潮霉素的固體ms培養(yǎng)基上，然后正常管理，得到t1代植株。4、分別將各個t1代植株進(jìn)行pcr鑒定。具體方法：提取基因組dna作為模板，采用f2和r2組成的引物對進(jìn)行pcr擴(kuò)增，如果得到約1685bp的擴(kuò)增產(chǎn)物，鑒定結(jié)果為陽性，該t1代植株為轉(zhuǎn)基因植株。f2：5’-agaagacgttccaaccacgtc-3’；r2：5’-tcagctaattttcgacatcaacaaatc-3’。f2對應(yīng)載體骨架上的35s啟動子。5、取步驟4得到的轉(zhuǎn)基因植株，進(jìn)行實時定量pcr。具體方法：提取總rna并反轉(zhuǎn)錄為cdna,將cdna作為模板，采用f3和r3組成的引物對進(jìn)行實時定量pcr。f3：5’-aacgtgaagatggggttgag-3’；r3：5’-tcgacatcaacaaatccctaag-3’。獲得轉(zhuǎn)基因植物葉片中cnusmxy1基因的相對表達(dá)量和同期哥倫比亞生態(tài)型擬南芥葉片中cnusmxy1基因的相對表達(dá)量。相對表達(dá)水平＝轉(zhuǎn)基因植株葉片中的cnusmxy1基因的相對表達(dá)量÷哥倫比亞生態(tài)型擬南芥葉片中的cnusmxy1基因的相對表達(dá)量。36株轉(zhuǎn)基因植株的相對表達(dá)水平為40以上。采用該36株轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行步驟四。哥倫比亞生態(tài)型擬南芥和一株轉(zhuǎn)基因植株的結(jié)果見圖2a。三、轉(zhuǎn)空載體植物的獲得用載體pcambia1300-35s-3ha代替重組質(zhì)粒pcambia1300-cnusmxy1，其他同步驟二，獲得30株轉(zhuǎn)空載體植株。四、抗蟲性鑒定將步驟二獲得的18株轉(zhuǎn)基因植株、步驟三獲得的15株轉(zhuǎn)空載體植株和15株哥倫比亞生態(tài)型擬南芥分別作為待測植株。將萌發(fā)5周的待測植株轉(zhuǎn)移至裝有栽培基質(zhì)的花盆中，每個花盆一株，然后將剛孵化出的甜菜夜蛾幼蟲放在植株的葉片上(每個植株放置10個甜菜夜蛾幼蟲)，正常管理，6天后取植株上的甜菜夜蛾幼蟲并稱重。結(jié)果見圖2b，縱坐標(biāo)為單個幼蟲重量(平均值)。與哥倫比亞生態(tài)型擬南芥上的甜菜夜蛾幼蟲相比，轉(zhuǎn)空載體植株上的甜菜夜蛾幼蟲重量沒有顯著差異。與哥倫比亞生態(tài)型擬南芥上的甜菜夜蛾幼蟲相比，轉(zhuǎn)基因植株上的甜菜夜蛾幼蟲重量更低。結(jié)果表明，與哥倫比亞生態(tài)型擬南芥上的甜菜夜蛾幼蟲相比，轉(zhuǎn)基因植株上的甜菜夜蛾幼蟲生長更為緩慢，即過表達(dá)cnusmxy1基因可以增加植物對甜菜夜蛾的抗性。五、抗菌性鑒定將步驟二獲得的18株轉(zhuǎn)基因植株、步驟三獲得的15株轉(zhuǎn)空載體植株和15株哥倫比亞生態(tài)型擬南芥分別作為待測植株。將萌發(fā)5周的待測植株轉(zhuǎn)移至裝有栽培基質(zhì)的花盆中，每個花盆一株，然后注射丁香假單胞菌pstdc3000(每個植株對2-3個葉片進(jìn)行注射，每個葉片注射50-100微升菌液，菌液中丁香假單胞菌pstdc3000的濃度為105cfu/ml)，正常管理，4天后取注射丁香假單胞菌pstdc3000的葉片區(qū)域，測量表面積，然后通過平板稀釋法檢測本葉片中丁香假單胞菌pstdc3000的含量。結(jié)果見圖2c，縱坐標(biāo)為每平方厘米本葉片中丁香假單胞菌pstdc3000的cfu數(shù)量以10為底的對數(shù)值(平均值)。與哥倫比亞生態(tài)型擬南芥相比，轉(zhuǎn)空載體植株的發(fā)病表型無差異，單位面積的葉片中丁香假單胞菌pstdc3000的含量無顯著差異。與哥倫比亞生態(tài)型擬南芥相比，轉(zhuǎn)基因植株的發(fā)病表型更嚴(yán)重，單位面積的葉片中丁香假單胞菌pstdc3000的含量顯著增高結(jié)果表明，過表達(dá)cnusmxy1基因降低了植物對丁香假單胞菌的抗性。sequencelisting<110>首都師范大學(xué)<120>cnusmxy1蛋白及其在培育抗蟲植物中的應(yīng)用<130>gncyx171406<160>2<170>patentinversion3.5<210>1<211>511<212>prt<213>擬南芥（arabidopsisthaliana）<400>1metileasnthraspaspasnleuleumetileglualaleuleuthr151015seraspproserproproleuleuproalaasnleuserleugluthr202530thrleuprolysargleuhisalavalleuasnglythrhisglupro354045trpsertyralailephetrplysprosertyraspaspphesergly505560glualavalleulystrpglyaspglyvaltyrthrglyglyasnglu65707580glulysthrargglyargleuargarglyslysthrileleuserser859095progluglulysgluargargserasnvalilearggluleuasnleu100105110metileserglyglualapheprovalvalgluaspaspvalserasp115120125aspaspaspvalgluvalthraspmetglutrpphepheleuvalser130135140metthrtrpserpheglyasnglyserglyleualaglylysalaphe145150155160alasertyrasnprovalleuvalthrglyseraspleuiletyrgly165170175serglycysaspargalalysglnglyglyaspvalglyleuglnthr180185190ileleucysileproserhisasnglyvalleugluleualaserthr195200205glugluileargproasnseraspleupheasnargileargpheleu210215220pheglyglyserlystyrpheserglyalaproasnserasnserglu225230235240leuphepropheglnleuglusersercysserserthrvalthrgly245250255asnproasnproserprovaltyrleuglnasnargtyrasnleuasn260265270pheserthrserserserthrleualaargalaprocysglyaspval275280285leuserpheglygluasnvallysglnserphegluasnargasnpro290295300asnthrtyrseraspglnileglnasnvalvalprohisalathrval305310315320metleuglulyslyslysglylyslysargglyarglysproalahis325330335glyargasplysproleuasnhisvalglualagluargmetargarg340345350glulysleuasnhisargphetyralaleuargalavalvalproasn355360365valserlysmetasplysthrserleuleugluaspalavalcystyr370375380ileasngluleulysserlysalagluasnvalgluleuglulyshis385390395400alailegluileglnpheasngluleulysgluilealaglyglnarg405410415asnalaileproservalcyslystyrgluglulysalaserglumet420425430metlysilegluvallysilemetgluseraspaspalametvalarg435440445valgluserarglysasphishisproglyalaargleumetasnala450455460leumetaspleugluleugluvalasnhisalaserileservalmet465470475480asnaspleumetileglnglnalaasnvallysmetglyleuargile485490495tyrlysglnglugluleuargaspleuleumetserlysileser500505510<210>2<211>1536<212>dna<213>擬南芥（arabidopsisthaliana）<400>2atgattaataccgacgataacttattgatgatcgaagctctcttgacctccgatccgtcg60ccaccattacttccggcgaatctcagcctcgagactactctcccgaagcgtttacatgct120gtgttgaatggaacccacgagccctggagttacgccattttctggaaaccgtcgtacgat180gacttttccggtgaagcagttctcaaatggggcgacggagtttacactggtggcaacgag240gaaaagacacgagggaggttgaggaggaagaagacgattctgtcgtctccggaggagaaa300gagcgtcggagtaatgttattcgggagcttaacttgatgatctccggcgaagcgtttccg360gtggttgaagacgacgtcagtgatgacgatgacgtggaagtgacggatatggagtggttc420ttcttggtttccatgacgtggagttttggtaacggatccgggttagcgggtaaggcgttt480gctagctataacccggttttggttaccggttcggatctgatttacgggtcgggttgtgat540cgggctaaacaaggaggggatgtagggttacagaccatcttgtgtattccttcacataac600ggagtgttggagcttgcatccacggaggagatccgaccaaattcggatctttttaatagg660atccggtttctttttggaggatccaaatatttttctggagccccgaattcgaactcggag720cttttcccatttcagttagagagcagttgttcaagtactgtaaccggtaacccgaatcct780agtccggtttatctacagaaccggtataatttgaacttctcgacgtcatcttccacattg840gcgagagctccatgcggcgatgtactgagttttggcgagaatgttaaacagagttttgaa900aatcggaaccctaatacttattctgatcagattcaaaacgtcgtccctcacgcgacggtg960atgctggagaagaagaagggaaaaaagcgcgggagaaaaccggcgcatggtagagacaag1020cctttgaaccacgtggaagcagagaggatgagacgtgagaagctaaaccacagattctac1080gcattacgagcggttgtaccaaacgtatcgaaaatggacaaaacgtcgttgctcgaagac1140gcggtttgttacataaacgagctgaaatcaaaagctgaaaacgttgaattggagaaacat1200gcgattgagattcagttcaatgaactcaaggagattgcaggacaacgaaacgcaattcct1260agcgtttgtaaatacgaggaaaaggcatcagagatgatgaagatcgaagtgaagattatg1320gaaagtgatgatgcaatggttagagttgaatcaaggaaggatcatcatccaggagcgaga1380ttgatgaatgctttgatggatttggagttagaagtgaatcatgcgagcatttctgtgatg1440aacgatcttatgatacaacaagcgaacgtgaagatggggttgagaatctacaagcaggaa1500gagcttagggatttgttgatgtcgaaaattagctga1536當(dāng)前第1頁12