本發(fā)明屬于植物保護(hù)領(lǐng)域，尤其涉及一株蠟狀芽孢桿菌jk-xz3及其在防治櫻花根癌病中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：櫻花(cerasusmill.)是我國(guó)重要的觀賞花木，被廣泛用于美化公園、小區(qū)、道路等綠地，多年來櫻花苗木需求量大，產(chǎn)業(yè)市場(chǎng)前景廣闊。根癌病(crowngall)是由根癌土壤桿菌(agrobacteriumtumefaciens)引起的一種世界范圍的細(xì)菌性病害。該病寄主范圍廣，可危害93個(gè)科，331個(gè)屬，643個(gè)不同種的植物?；几┎〉闹仓瓯憩F(xiàn)葉黃，勢(shì)弱，果實(shí)產(chǎn)量或觀賞性下降，嚴(yán)重時(shí)能導(dǎo)致植株死亡。該病在歐洲、北美、非洲和亞洲的一些國(guó)家與地區(qū)普遍發(fā)生，我國(guó)主要分布在河北、遼寧、吉林、河南、山東、浙江和福建等省區(qū)。重茬苗圃發(fā)病率在20％—100％之間不等，有的甚至造成毀園。根癌病菌可長(zhǎng)時(shí)間存活在土壤中，從植株的傷口侵入，隨苗木的調(diào)運(yùn)進(jìn)行遠(yuǎn)距離傳播，是土傳加苗傳的細(xì)菌性病害。目前對(duì)櫻花根癌病的防治主要靠加強(qiáng)檢疫檢查和栽培管理，這些措施只能起到局部的控制作用，而生物防治不失為一種經(jīng)濟(jì)、安全、有效的防治措施之一，其中拮抗細(xì)菌在植物病害生物防治中起到非常重要的作用。kerr(1972)從土壤桿菌中分離得到放射土壤桿菌(agrobacteriumradiobacter)k84菌株，這是應(yīng)用較早且有效的生物制劑。k84本身無致瘤性，它的質(zhì)?？梢院铣梢环N細(xì)菌素agrocin84，抑制很多種有致病性的菌株，而對(duì)非致病性的菌株則無影響。另外，它還可以通過與病原菌競(jìng)爭(zhēng)附著位點(diǎn)而控制病原菌的侵入。陳曉英(1986)等從山東啤酒花(humuluslupulus)冠癭瘤中分離出無致病性的hlb-2菌株，能產(chǎn)生細(xì)菌素抑制根瘤。同年，南非webster報(bào)道從南非李樹冠癭中分離到j(luò)73菌株，產(chǎn)細(xì)菌素，本身是致病菌，但對(duì)葡萄不致病，且可通過產(chǎn)細(xì)菌素來抑制葡萄根癌病的發(fā)生。王關(guān)林(2004)等以發(fā)根土壤桿菌k84為供試菌株，對(duì)其進(jìn)行紫外誘變，篩選出高產(chǎn)細(xì)菌素的wjk84-1菌株，通過櫻桃接瘤試驗(yàn)表明，wjk84-1菌株和其產(chǎn)生的細(xì)菌素均可抑制根瘤發(fā)生，抑瘤率達(dá)到83.4％左右。陳凡(2007)等利用水生拉恩氏菌(rahnellaaquatilis)hx2菌株對(duì)葡萄根癌病進(jìn)行了防治，防效達(dá)到80.2％。王樹芳(2013)等通過平板對(duì)峙方法篩選出耐氰放線菌(actinomycetessp.)g-19，對(duì)桃樹根癌病有較好防治效果。高之蕾(2015)等從桃樹根際土壤分離出兩株糞產(chǎn)堿菌(alcaligenesfaecalis)，對(duì)根癌病抑制率達(dá)90％以上。目前報(bào)道的根癌病生防菌株很多，但是以芽孢桿菌為材料來防治根癌病未見報(bào)道。芽孢桿菌(bacillusspp.)是一類好氧或兼性厭氧桿狀菌，能產(chǎn)生抗逆性的芽孢，是典型的革蘭氏陽(yáng)性菌。盡管發(fā)現(xiàn)芽孢桿菌已長(zhǎng)達(dá)一個(gè)多世紀(jì)的時(shí)間，但是對(duì)它的研究仍有待進(jìn)一步深入。在目前看來，大多數(shù)的研究集中于尋找特定基因功能并在需要的物種中克隆或者通過誘變、基因工程等生物手段改造它；還有研究熱點(diǎn)就是研究芽孢桿菌的抗菌物質(zhì)。能產(chǎn)生抗菌物質(zhì)的芽孢桿菌種類有：枯草芽孢桿菌(bacillussubtilis)、蠟狀芽孢桿菌(b.cereus)、解淀粉芽孢桿菌(b.amyloquefaciens)、地衣芽孢桿菌(b.lichenifomis)、短小芽孢桿菌(b.pumilus)、蘇云金芽孢桿菌(b.thuringiensis)、環(huán)狀芽孢桿菌(b.cirulans)和短芽孢桿菌(b.brevis)等。蠟狀芽孢桿菌(bacilluscereus)是芽孢桿菌屬中具有生防應(yīng)用價(jià)值的拮抗細(xì)菌之一。除了被用作微生物菌劑和微生物肥料外，蠟狀芽孢桿菌也能產(chǎn)生活性較強(qiáng)的酶類，加上有促進(jìn)植物生長(zhǎng)和增產(chǎn)的作用，因此在醫(yī)藥、食品和飼料工業(yè)，尤其在農(nóng)林業(yè)上具有廣泛的應(yīng)用價(jià)值。最常見的是蠟狀芽孢桿菌在農(nóng)林業(yè)上用作生防制劑，但在防治櫻花根癌病方面未見報(bào)道。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：發(fā)明目的：針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中存在的不足，本發(fā)明的目的是提供一株高效防治櫻花根癌病的蠟狀芽孢桿菌jk-xz3。本發(fā)明另一目的是提供上述蠟狀芽孢桿菌jk-xz3的應(yīng)用。技術(shù)方案：為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下：一株蠟狀芽孢桿菌，其分類命名為蠟樣芽孢桿菌(bacilluscereus)jk-xz3，已保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心cctcc，其保藏編號(hào)是：cctccno：m2017215，保藏日期：2017年4月27日，保藏地址為中國(guó)武漢武漢大學(xué)。所述的蠟狀芽孢桿菌在拮抗櫻花根癌病菌根癌土壤桿菌中的應(yīng)用。所述的蠟狀芽孢桿菌在防治櫻花根癌病中的應(yīng)用。所述的蠟狀芽孢桿菌在促進(jìn)櫻花生長(zhǎng)中的應(yīng)用。所述的蠟狀芽孢桿菌的發(fā)酵液在拮抗櫻花根癌病菌根癌土壤桿菌中的應(yīng)用。所述的蠟狀芽孢桿菌的發(fā)酵液在防治櫻花根癌病中的應(yīng)用。所述的蠟狀芽孢桿菌的發(fā)酵液在促進(jìn)櫻花生長(zhǎng)中的應(yīng)用。本發(fā)明提供的蠟狀芽孢桿菌，從櫻花根際土壤篩選獲得，其在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基平板上菌落不規(guī)則毛玻璃狀，蠟白色，邊緣起伏，表面濕潤(rùn)；菌體直桿狀，大小為3-4μm，常成短鏈；具橢圓形芽孢，且芽孢中生；革蘭氏染色表現(xiàn)為陽(yáng)性；v.p試驗(yàn)和伴孢晶體陰性；甲基紅試驗(yàn)、淀粉水解、酪氨酸水解、過氧化氫、卵黃、檸檬酸鹽試驗(yàn)均呈陽(yáng)性。測(cè)得16srdna大部分序列1428bp，具體如seqidno.1所示。將所測(cè)16srdna序列通過blast比對(duì)，能在genbank中找到同源性非常高的相近菌株序列。與jk-xz3菌株相似性最高的是bacilluscereus和bacillusthuringiensis，同源性都達(dá)到99％。構(gòu)建進(jìn)化樹發(fā)現(xiàn)，jk-xz3與bacilluscereus同屬一個(gè)遺傳分枝，親緣關(guān)系十分接近。biolog細(xì)菌自動(dòng)鑒定系統(tǒng)以每種細(xì)菌形成各自特有的“代謝指紋”圖譜為鑒定依據(jù)，選用四唑紫作為細(xì)菌能否利用供試碳源的指示劑，通過細(xì)菌對(duì)95種不同碳源的代謝情況鑒定菌種。與傳統(tǒng)方法相比，該系統(tǒng)采用標(biāo)準(zhǔn)化程序，操作簡(jiǎn)便，自動(dòng)化程度高,鑒定快速，且菌種數(shù)據(jù)庫(kù)大，鑒定范圍廣，包括約2000種微生物，適合于環(huán)境、食品、工業(yè)、臨床和動(dòng)植物病原菌各類微生物的鑒定分析。通過biolog系統(tǒng)對(duì)jk-xz3進(jìn)行鑒定，該菌株在鑒定板培養(yǎng)16～24h時(shí)的讀數(shù)相似值(sim值)為0.503，大于0.50，符合biolog系統(tǒng)關(guān)于理想結(jié)果的要求，而且鑒定結(jié)果的相似性(prob)都為99％，因此該菌株利用biolog系統(tǒng)，準(zhǔn)確鑒定到了種，為蠟狀芽孢桿菌(bacilluscereus)，分類命名為：蠟狀芽孢桿菌(bacilluscereus)jk-xz3。有益效果：本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有如下優(yōu)勢(shì)：1)蠟狀芽孢桿菌jk-xz3為植物根際土壤細(xì)菌，對(duì)櫻花根癌病菌抑制作用強(qiáng)，在植物病害生物防治中可起到重要的作用；該菌株繁殖速度快；并具有促進(jìn)植物生長(zhǎng)等優(yōu)點(diǎn)，尤其是對(duì)櫻花根癌病的防治具有重要意義。2)蠟狀芽孢桿菌jk-xz3培養(yǎng)條件簡(jiǎn)單、容易保存，易于工業(yè)化生產(chǎn)，便于生產(chǎn)應(yīng)用，具有良好的開發(fā)應(yīng)用前景。附圖說明圖1是蠟狀芽孢桿菌jk-xz3對(duì)根癌土壤桿菌平板生長(zhǎng)抑制情況圖；圖中，a是單接種櫻花根癌病病原根癌土壤桿菌(agrobacteriumtumefaciens)的帶菌平板；b是在帶病原菌平板上打孔接種的蠟狀芽孢桿菌jk-xz3；圖2是蠟狀芽孢桿菌jk-xz3在溫室櫻花苗上的防治效果圖；圖中，a是單接種根癌土壤桿菌(agrobacteriumtumefaciens)；b是根癌土壤桿菌和蠟狀芽孢桿菌jk-xz3混接；圖3是蠟狀芽孢桿菌jk-xz3對(duì)田間櫻花根系生長(zhǎng)的影響圖；圖中，(a，a)是agrobacteriumradiobacterk84菌劑處理；(b，b)是蠟狀芽孢桿菌jk-xz3處理；(c，c)是ck。具體實(shí)施方式下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的說明。根據(jù)下述實(shí)施例，可以更好地理解本發(fā)明。然而，本領(lǐng)域的技術(shù)人員容易理解，實(shí)施例所描述的具體的物料配比、工藝條件及其結(jié)果僅用于說明本發(fā)明，而不應(yīng)當(dāng)也不會(huì)限制權(quán)利要求書中所詳細(xì)描述的本發(fā)明。以下實(shí)施例中，蠟狀芽孢桿菌jk-xz3的斜面保存方法為：牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基(na)：3g牛肉膏，5gnacl，10g蛋白胨，15g瓊脂；4℃冷庫(kù)長(zhǎng)期保存。蠟狀芽孢桿菌jk-xz3的活化方法為：牛肉膏蛋白胨(nb)：3g牛肉膏，5gnacl，10g蛋白胨；28℃恒溫?fù)u床180r/min搖培24h。蠟狀芽孢桿菌jk-xz3的發(fā)酵液制備方法為：nb培養(yǎng)基(25l)：75g牛肉膏，125gnacl，250g蛋白胨)，以50l自動(dòng)發(fā)酵罐(上海國(guó)強(qiáng)公司生產(chǎn))，按5％接種量，28℃發(fā)酵24h。蠟狀芽孢桿菌jk-xz3的菌懸液制備方法為：將發(fā)酵罐制備的發(fā)酵液和水1:5v/v稀釋，制得菌懸液。實(shí)施例1蠟狀芽孢桿菌jk-xz3對(duì)櫻花根癌病原根癌土壤桿菌(agrobacteriumtumefaciens)平板抑菌作用。將na瓊脂培養(yǎng)基放入滅菌鍋滅菌(121℃/20min)，待na培養(yǎng)基冷卻到50℃時(shí)，將活化的櫻花根癌病原菌株與na瓊脂培養(yǎng)基按5％v/v均勻混合，制成帶菌平板，每個(gè)平板用8mm打孔器打三個(gè)孔，每個(gè)孔中用移液槍注入50ul活化的蠟狀芽孢桿菌jk-xz3，放入28℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)48h。觀察jk-xz3對(duì)病原菌生長(zhǎng)的抑制情況(圖1)，測(cè)量菌落直徑，計(jì)算抑菌率(表1)。試驗(yàn)結(jié)果表明，蠟狀芽孢桿菌jk-xz3對(duì)根癌土壤桿菌有較強(qiáng)的抑制作用，與對(duì)照相比，抑菌率達(dá)到91.3％。表1jk-xz3對(duì)櫻花根癌病病原菌的抑制注：ck(a.tumefaciens)：病原菌單獨(dú)培養(yǎng)；jk-xz3+a.tumefaciens：蠟狀芽孢桿菌jk-xz3和病原菌共同生長(zhǎng)。實(shí)施例2蠟狀芽孢桿菌jk-xz3對(duì)溫室櫻花苗根癌病的防治效果。將一年生櫻花種植于滅菌土中，置于25℃溫室培養(yǎng)15d，選取長(zhǎng)勢(shì)相近的櫻花進(jìn)行接種(每個(gè)處理18個(gè)重復(fù))。每株櫻花接櫻花根癌病原菌(na液體培養(yǎng)基，培養(yǎng)24h)2ml，接種斜面保存的蠟狀芽孢桿菌jk-xz3于50ml錐形瓶中28℃/200rpm培養(yǎng)48h，測(cè)od600nm值，用無菌水將蠟狀芽孢桿菌稀釋到濃度1×108cfu，制成菌懸濁液備用，用無菌手術(shù)刀于櫻花主根劃1cm創(chuàng)口，以無菌棉球吸取根癌土壤桿菌包裹于創(chuàng)口處；7d后用無菌移液管吸取10ml蠟狀芽孢桿菌懸濁液緊貼櫻花苗根系將其注入土壤，然后覆土填平至塑料盆。以單接根癌土壤桿菌的櫻花苗作為發(fā)病對(duì)照，6個(gè)月后觀察并統(tǒng)計(jì)櫻花的發(fā)病率和病瘤直徑。試驗(yàn)結(jié)果表明蠟狀芽孢桿菌jk-xz3在溫室櫻花苗根癌病防治上有顯著的效果(表2、圖2)。表2蠟狀芽孢桿菌jk-xz3對(duì)溫室櫻花苗根癌病的防治效果注：a.tumefaciens：?jiǎn)谓臃N病原菌；a.tumefaciens+jk-xz3：病原菌和拮抗菌混接。實(shí)施例3蠟狀芽孢桿菌jk-xz3對(duì)田間櫻花根癌病的防治效果。將蠟狀芽孢桿菌jk-xz3活化后，制備發(fā)酵培養(yǎng)基(25l：75g牛肉膏，125g氯化鈉，250g蛋白胨)，以50l自動(dòng)發(fā)酵罐(上海國(guó)強(qiáng)公司生產(chǎn))按5％接種量發(fā)酵24h，制成的蠟狀芽孢桿菌jk-xz3發(fā)酵液濃度約為1×108cfu/ml。以10l無菌桶封裝放4℃恒溫冷藏室備用，并且購(gòu)買市售對(duì)根癌病防效好的放射土壤桿菌(agrobacteriumradiobacter)k84菌劑(購(gòu)自中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué))作為防效對(duì)照。田間防治試驗(yàn)首先選取三年生長(zhǎng)勢(shì)相似且感病的櫻花(每個(gè)處理50株)，起根并去除根部土壤，用滅菌手工刀對(duì)櫻花根部病瘤進(jìn)行人工切除，傷口處用75％酒精消毒。將供試拮抗細(xì)菌發(fā)酵液與水1:5稀釋(使土壤中細(xì)菌密度約為107cfu/ml)后加少許土拌成泥漿對(duì)傷口進(jìn)行涂抹，種植一個(gè)月后，將菌株jk-xz3發(fā)酵液與水1:5稀釋成菌懸濁液進(jìn)行復(fù)施處理。復(fù)施：在每株櫻花根部離主徑20cm處挖15cm深土坑，將菌懸濁液以500ml/株灌根，之后覆土，以切瘤但不施用菌劑處理的櫻花作為發(fā)病對(duì)照。6個(gè)月后起根調(diào)查不同處理櫻花發(fā)病率(表3)。試驗(yàn)結(jié)果表明，相對(duì)于k84菌劑處理的櫻花，jk-xz3處理的發(fā)病率更低，說明蠟狀芽孢桿菌jk-xz3在田間櫻花根癌病防治上有顯著的效果。表3不同處理櫻花根癌病發(fā)病狀況實(shí)施例4蠟狀芽孢桿菌jk-xz3對(duì)促進(jìn)田間櫻花生長(zhǎng)的作用。具體方法步驟同實(shí)施例3，處理6個(gè)月后測(cè)量櫻花的樹高(cm)和胸徑(mm)，試驗(yàn)結(jié)果表明：相較于未施菌處理的櫻花和k84菌劑處理的櫻花，蠟狀芽孢桿菌jk-xz3對(duì)櫻花生長(zhǎng)有促進(jìn)作用，尤其在樹高生長(zhǎng)方面有顯著促進(jìn)作用(圖3、表4)。表4蠟狀芽孢桿菌jk-xz3對(duì)櫻花生長(zhǎng)的影響處理樹高/cm高增長(zhǎng)量/％胸徑/mm徑增長(zhǎng)量/％k84330.75±3.10b1.7249.38±0.61a5.13jk-xz3352.00±2.32a8.2647.26±0.41b0.62ck325.15±2.75b046.97±0.39b0實(shí)施例5：蠟狀芽孢桿菌jk-xz3對(duì)模式植物苜蓿的接種試驗(yàn)。將jk-xz2接種到nb培養(yǎng)基中，28℃下震蕩(180mrp)培養(yǎng)24h，用無菌水調(diào)節(jié)菌懸液濃度到109cfu/ml左右用于接種。用laura的方法準(zhǔn)備要接種的苜蓿種子(lauraetal.，2002)。將紫花苜蓿種子用98％濃硫酸浸泡20分鐘(約10ml浸300顆種子)，用500ml滅菌水清洗4次，然后泡在60ml滅菌水中，32℃下震蕩(150prm)浸種6～8小時(shí)，再清洗2次，換水后同樣條件培養(yǎng)過夜。次日再用滅菌水清洗2次后(每次60ml水)，用無菌鑷子擺放到1％的水瓊脂平板上等待接種，每皿擺放20顆種子。7d后將水瓊脂平板上的苜蓿幼苗用接種針在子葉上刺一個(gè)小孔，取20ml準(zhǔn)備好的菌懸液點(diǎn)在傷口處，每菌株接種3個(gè)重復(fù)，每重復(fù)20株幼苗，設(shè)2種ck處理，其中1個(gè)不作任何處理，另l個(gè)針刺接種無菌水。接種后的種子在37℃、70％相對(duì)濕度、定時(shí)光照(12h光照，12h黑暗)條件的人工氣候箱中培養(yǎng)，7天后檢查發(fā)病率。苜蓿接種結(jié)果顯示，無論是ck還是接種處理，均無發(fā)病癥狀(接種點(diǎn)附近壞死、黃化和根畸)出現(xiàn)。苜蓿是代替小白鼠作為測(cè)定bcc對(duì)動(dòng)物毒性的模式植物(steveetal.，2003)，用苜蓿模型可簡(jiǎn)單快捷的檢測(cè)出bcc菌株對(duì)哺乳動(dòng)物是否具有致病性。上述試驗(yàn)結(jié)果說明蠟狀芽孢桿菌jk-xz3對(duì)哺乳動(dòng)物沒有毒害性。sequencelisting<110>南京林業(yè)大學(xué)<120>一株蠟狀芽孢桿菌jk-xz3及其在防治櫻花根癌病中的應(yīng)用<130>100<160>1<170>patentinversion3.3<210>1<211>1428<212>dna<213>bacilluscereus<400>1gcggctggctccaaaaaggttaccccaccgacttcgggtgttacaaactctcgtggtgtg60acgggcggtgtgtacaaggcccgggaacgtattcaccgcggcatgctgatccgcgattac120tagcgattccagcttcatgtaggcgagttgcagcctacaatccgaactgagaacggtttt180atgagattagctccacctcgcggtcttgcagctctttgtaccgtccattgtagcacgtgt240gtagcccaggtcataaggggcatgatgatttgacgtcatccccaccttcctccggtttgt300caccggcagtcaccttagagtgcccaacttaatgatggcaactaagatcaagggttgcgc360tcgttgcgggacttaacccaacatctcacgacacgagctgacgacaaccatgcaccacct420gtcactctgctcccgaaggagaagccctatctctagggttttcagaggatgtcaagacct480ggtaaggttcttcgcgttgcttcgaattaaaccacatgctccaccgcttgtgcgggcccc540cgtcaattcctttgagtttcagccttgcggccgtactccccaggcggagtgcttaatgcg600ttaacttcagcactaaagggcggaaaccctctaacacttagcactcatcgtttacggcgt660ggactaccagggtatctaatcctgtttgctccccacgctttcgcgcctcagtgtcagtta720cagaccagaaagtcgccttcgccactggtgttcctccatatctctacgcatttcaccgct780acacatggaattccactttcctcttctgcactcaagtctcccagtttccaatgaccctcc840acggttgagccgtgggctttcacatcagacttaagaaaccacctgcgcgcgctttacgcc900caataattccggataacgcttgccacctacgtattaccgcggctgctggcacgtagttag960ccgtggctttctggttaggtaccgtcaaggtgccagcttattcaactagcacttgttctt1020ccctaacaacagagttttacgacccgaaagccttcatcactcacgcggcgttgctccgtc1080agactttcgtccattgcggaagattccctactgctgcctcccgtaggagtctgggccgtg1140tctcagtcccagtgtggccgatcaccctctcaggtcggctacgcatcgttgccttggtga1200gccgttacctcaccaactagctaatgcgacgcgggtccatccataagtgacagccgaagc1260cgcctttcaatttcgaaccatgcagttcaaaatgttatccggtattagccccggtttccc1320ggagttatcccagtcttatgggcaggttacccacgtgttactcacccgtccgccgctaac1380ttcataagagcaagctcttaatccattcgctcgacttgcagtataggc1428當(dāng)前第1頁(yè)12