本發(fā)明屬于分子生物學(xué)及遺傳育種
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及一種甘藍(lán)型油菜株高性狀主效基因位點(diǎn)及與其緊密連鎖的兩個分子標(biāo)記，同時還涉及基因位點(diǎn)和分子標(biāo)記在油菜株型育種中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：油菜是我國最重要的油料作物，也是我國唯一的冬季油料作物(hu,2016)，其種植面積和總產(chǎn)都占到全世界的三分之一左右(james,2003)。菜籽油是世界上植物油第二大來源，同時也是我國食用植物油的第一大來源，占到我國國產(chǎn)油料作物產(chǎn)油量的55％以上，在國家食用油供給安全戰(zhàn)略中地位十分重要(王漢中,2014)。近年來，我國國產(chǎn)植物油年產(chǎn)量僅維持在900-1000萬噸左右，自給率不足40％且有進(jìn)一步下降的趨勢，這對我國食用植物油供給安全造成了重大威脅。在城鎮(zhèn)化規(guī)模持續(xù)擴(kuò)大、耕地面積進(jìn)一步縮小的嚴(yán)峻形勢下，持續(xù)提高單位面積產(chǎn)油量(＝單產(chǎn)×含油量)是主要出路。近年來，我國油菜品種含油量提高較快而單產(chǎn)增加卻十分緩慢，這嚴(yán)重影響了農(nóng)民種植油菜的經(jīng)濟(jì)效益和積極性。因此，提高油菜單產(chǎn)已經(jīng)成為目前我國油菜生產(chǎn)最為迫切的任務(wù)之一，是事關(guān)我國油菜產(chǎn)業(yè)持續(xù)與發(fā)展的根本問題。油菜單產(chǎn)取決于密度和單株產(chǎn)量。其中，單株產(chǎn)量直接決定于其構(gòu)成因子，而密度則主要和株型相關(guān)。從作物品種的演變歷程可以看出，品種改良和產(chǎn)量提高的背后往往伴隨著株型的選擇和優(yōu)化，其中株高是一個很重要的方面(沈金雄,2013)。而株高的改良在推動綠色革命中起到了至關(guān)重要的作用，其中包括小麥，玉米和水稻等品種中各種矮桿基因的克隆以及功能的研究，而這些基因運(yùn)用于育種中使得作物產(chǎn)量得到了大幅度的提升(worland,1995；monna,2002；sasaki,2002；sicinski,1995)。大量的實(shí)例表明一個或者少數(shù)的幾個株高基因的克隆很有可能會誘導(dǎo)該品種產(chǎn)量育種的重大突破，但是在油菜中目前還沒有株高基因克隆的報道，同時油菜株高的改良可能會引起其產(chǎn)量的革命性增長，因此對油菜株高的研究有著重要的意義。近年來，油菜品種產(chǎn)量徘徊不前(wang,2016)，很多學(xué)者提出了理想株型育種的概念(thuling,1991)，成為目前油菜產(chǎn)量取得突破的一個很有希望的方向。因?yàn)橹旮邔ψ魑镞z傳改良的重要性，幾十年來研究者們以模式植物擬南芥和重要農(nóng)作物為研究對象，利用突變體分析和圖位克隆等技術(shù)手段鑒定了一大批調(diào)控植物株高的基因(liu,2007；spray,1996；peng,2014)，雖然在油菜中卻沒有相關(guān)的報道，但是這些克隆出來的與株高有關(guān)的基因?qū)τ谟筒酥晷透牧季哂兄匾闹笇?dǎo)意義。油菜株高是一個典型的數(shù)量性狀，表型連續(xù)分布且很容易受到環(huán)境條件的影響(王漢中,2014)。近十年來，雖然利用連鎖(li,2016；cai,2014)或關(guān)聯(lián)分析(mei,2009；max,2016)的方法，在油菜中已經(jīng)定位到兩百多個株高qtl。這些株高qtl在油菜所有19個連鎖群上都有分布，單個qtl能解釋的表型變異的范圍0-28.6％，其中絕大部分貢獻(xiàn)率都比較低，而只在a2、a3、c2和c6連鎖群上發(fā)現(xiàn)了少數(shù)幾個效應(yīng)較大的qtl，c3連鎖群上ph13b貢獻(xiàn)率為28.6％(mei,2009)，c2連鎖群上的貢獻(xiàn)率ph12.3為26.5％(udall,2006)，a2連鎖群上的ph2.3貢獻(xiàn)率為20.8％。但是在油菜中關(guān)于株高的基因的克隆目前還沒有報道。本發(fā)明通過對株高性狀qtl的掃描檢測以及定位，旨在找到對株高性狀具有改良效應(yīng)的基因位點(diǎn)，用于油菜理想株型育種改良的標(biāo)記輔助選擇。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的是在于提供了一種與油菜株高主效qtl位點(diǎn)qphc2(本發(fā)明或稱為qph.c2)緊密連鎖的分子標(biāo)記引物，所述的qph.c2位點(diǎn)的效應(yīng)值和對表型變異的解釋都超過了以往了報道，對油菜株高的調(diào)控起到至關(guān)重要的作用，針對該位點(diǎn)找到了兩個緊密連鎖的ssr標(biāo)記，ssr標(biāo)記的引物為：bogms0665-f：tcagagatgaacaagaagca，bogms0665-r：gcgaacctttcccaacct；cnu461-f:ccgaaaccgacctcaacta,cnu461-r:cagtttgagtttcggaatgcac。本發(fā)明的另一個目的是在于提供了一種與油菜株高主效qtl位點(diǎn)qph.c2緊密連鎖的分子標(biāo)記引物在油菜育種中的應(yīng)用。申請人通過利用f2群體衍生的f2:3和f2:4群體進(jìn)行基因型和表型的鑒定，結(jié)果該基因位點(diǎn)被重復(fù)檢測到，且在該位點(diǎn)附近的標(biāo)記攜帶中雙11基因型的單株株高性狀大多數(shù)都低于群體株高均值，這表明該位點(diǎn)來源于中雙11并且用于輔助育種選擇是切實(shí)有效的。為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)措施。主效qtl位點(diǎn)qph.c2的獲得：(1)利用中雙11和no.73290雜交f1種植后代中挑選基因型雜合的184個單株的f2群體，命名為bnaznf2群體。(2)對bnaznf2群體進(jìn)行基因型分析，運(yùn)用在19條染色體中均勻分布的9531個引物，包括6504個ssr引物，2592個snp標(biāo)記，179個sts標(biāo)記，76個indel標(biāo)記，其中1038個引物在連個親本之間存在了特異多態(tài)性，利用這1038個標(biāo)記導(dǎo)入用joinmap4.0軟件中，結(jié)果表明其中的803個標(biāo)記(710個ssr、48個snp、14個sts)緊密連鎖。從而構(gòu)建了一張含803個分子標(biāo)記的高密度遺傳圖譜。這803個標(biāo)記均勻的分布19個連鎖群上，19個連鎖群的長度從32.1(c7)到148.7(c3)cm，19條連鎖群總長1763.2cm，平均每條染色體的長度為92.8cm。(3)對f2群體衍生的f2:3(命名為bnaznf2:3)和f2:4(命名為bnaznf2:4)家系在西寧進(jìn)行田間試驗(yàn)和油菜株高性狀表型鑒定，同時對f2:3和f2:4家系群體進(jìn)行基因型鑒定，這個過程包括：1)dna的提?。?)利用篩選的803個標(biāo)記的特異性引物對各個單株進(jìn)行基因型分析。(4)利用bnaznf2群體的基因型數(shù)據(jù)和f2:3以及f2:4家系的株高表型數(shù)據(jù)，采用winqtlcart2.5軟件的復(fù)合區(qū)間作圖法進(jìn)行qtl檢測掃描。(5)利用元分析的方法采用biomercator軟件對不同環(huán)境中檢測到的株高qtl進(jìn)行整合。利用上述方法，申請人最終獲得了油菜株高性狀相關(guān)的主效qtl位點(diǎn)qph.c2，該主效基因位點(diǎn)位于油菜c2染色體上，利用軟件winqtlcart2.5軟件測得其對油菜株高的貢獻(xiàn)率為55.6％，加性效應(yīng)為-15.98，顯性效應(yīng)為-0.310，該基因位點(diǎn)屬于加性遺傳。所述的位點(diǎn)與分子標(biāo)記bogms0665和cnu461緊密連鎖，針對這兩個分子標(biāo)記設(shè)計引物，如下：bogms0665-f：tcagagatgaacaagaagca，其中bogms0665-r：gcgaacctttcccaacct。cnu461-f:ccgaaaccgacctcaacta,cnu461-r:cagtttgagtttcggaatgcac。一種與油菜株高主效qtl位點(diǎn)qph.c2緊密連鎖的分子標(biāo)記引物在油菜育種中的應(yīng)用，包括利用本發(fā)明提供的引物對待測油菜dna進(jìn)行檢測，可有效地對目的株高油菜進(jìn)行選擇。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)：[1]該位點(diǎn)的貢獻(xiàn)率為55.6％，超過了以往所有報道過的甘藍(lán)型油菜株高qtl的貢獻(xiàn)率，是目前所報道的qtl中貢獻(xiàn)率最大的，前人報道中關(guān)于油菜株高qtl的貢獻(xiàn)率都比較小，且大多數(shù)都不能被重復(fù)檢測到。[2]該qph.c2位點(diǎn)的加性效應(yīng)為-15.98，理論上能夠改變油菜株高31.96cm的表型。為油菜的作物遺傳改良和油菜產(chǎn)量的提升提供了理論基礎(chǔ)，同時也是為第二次綠色革命的進(jìn)行技術(shù)儲備。[3]本發(fā)明中qph.c2位點(diǎn)定位區(qū)間為393kb，是目前已報道油菜株高qtl的初步定位物理區(qū)間較小的，已經(jīng)接近精細(xì)定位的水平，為后期該位點(diǎn)株高qtl克隆提供了便利。[4]qph.c2位點(diǎn)位于c2染色體上，目前株高qtl在c2染色體上被報道的很少，li(2015)報道的4個關(guān)于株高的qtl，且效應(yīng)值都偏小，其效應(yīng)值最大的10.51％不能被重復(fù)檢測到。udall(2006)檢測到的株高qtl-ph12.3，其貢獻(xiàn)率為26.5％。本發(fā)明豐富了關(guān)于株高主效qtl的位點(diǎn)分布，為后續(xù)對株高基因在油菜染色體上的分布研究提供了的理論支撐。[5]本發(fā)明中的qph.c2位點(diǎn)與前人所報道的株高qtl在油菜染色體中的位置均不重疊，是新的株高qtl。[6]目前油菜c2染色體上關(guān)于株高的qtl的專利申請還沒有一例，本發(fā)明可以填補(bǔ)這一空缺，同時為后期油菜理想株型的育種提供技術(shù)儲備。附圖說明圖1為bnaznf2:3和bnaznf2:4群體的株高的頻率分布；中雙11和no.73290所標(biāo)的位置為該群體中株高均值所處的位置。具體實(shí)施方式本發(fā)明所述技術(shù)方案，如未特別說明，均為本領(lǐng)域的常規(guī)技術(shù)；所述試劑或材料，如未特別說明，均來源于商業(yè)渠道。實(shí)施例1：油菜株高性狀的主效qtl位點(diǎn)qph.c2的獲得：1)本發(fā)明采取的分離群體是由親本中雙11號和no.73290衍生的f2以及f2:3和f2:4家系群體。兩親本和f2:3和f2:4兩家系群體的株高表型在成熟期收獲后經(jīng)考種鑒定。株高性狀考察數(shù)據(jù)表明：株高性狀存在超親分離現(xiàn)象(圖1)。2)利用中雙11和no.73290雜交后代中挑選基因型雜合的184個單株的f2(bnaznf2)群體作為分析群體，對bnaznf2群體進(jìn)行基因型分析，運(yùn)用在19條染色體中均勻分布的9531個引物，包括6504個ssr引物，2592個snp標(biāo)記，179個sts標(biāo)記，76個indel標(biāo)記，其中1038個引物在連個親本之間存在了特異多態(tài)性，利用這1038個標(biāo)記導(dǎo)入用joinmap4.0軟件中，結(jié)果表明其中的803個標(biāo)記(710個ssr、48個snp、14個sts)緊密連鎖。從而構(gòu)建了一張含803個分子標(biāo)記的高密度遺傳圖譜。這803個標(biāo)記均勻的分布19個連鎖群上，19個連鎖群的長度從32.1(c7)到148.7(c3)cm，19條連鎖群總長1763.2cm，平均每條染色體的長度為92.8cm。3)對f2群體衍生的f2:3(bnaznf2:3)和f2:4(bnaznf2:4)家系在西寧進(jìn)行田間試驗(yàn)和油菜株高性狀表型鑒定，同時對f2:3和f2:4家系群體進(jìn)行基因型鑒定，這個過程包括：1)dna的提取工作，本研究中采用的是ctab提取葉片總dna，此過程中所用到的試劑包括提取液(1.4mnacl，100mmtris,ph8.0，20mmedta,ph8.0，2％ctab)、氯仿、異戊醇、無水乙醇。2)利用篩選的803個標(biāo)記的特異性引物對各個單株進(jìn)行基因型分析。與中雙11基因型一致的記作“a”，與no.73290基因型相同的記作“b”，如果含有一個單株同時含有中雙11和no.73290的基因型則為雜合基因型記作“h”。4)利用bnaznf2群體構(gòu)建的連鎖圖譜和f2:3以及f2:4家系的株高表型數(shù)據(jù)，用winqtlcart2.5軟件的復(fù)合區(qū)間作圖法進(jìn)行qtl檢測掃描，lod閾值采用1000次重復(fù)排列測驗(yàn)來確定，基本參數(shù)設(shè)置，其中步長為1cm；窗口大小為10cm；控制標(biāo)記數(shù)為5；用p＝0.05水平下的lod閾值來確定顯著的qtl，為了避免漏掉微效qtl，那些可重復(fù)的p＝0.1水平下的qtl也被承認(rèn)。5)利用元分析的方法采用biomercator軟件對不同環(huán)境中檢測到的株高qtl進(jìn)行整合。最終在在c2染色體ssr標(biāo)記bogms0665和cnu461之間檢測到了一個重復(fù)性很好的株高主效qtl位點(diǎn)，其lod值和貢獻(xiàn)率都較大(表1)，針對該分子標(biāo)記設(shè)計引物，引物如表2所示。表1c2連鎖群株高主效qtl位點(diǎn)qph.c2的基本信息表2c2連鎖群株高主效qtl連鎖群bogms0665和cnu461的引物序列bogms0665-ftcagagatgaacaagaagcacbogms0665-rgcgaacctttcccaacctcnu461-fgccgaaaccgacctcaactacnu461-rcagtttgagtttcggaatgcac本發(fā)明中的qph.c2位點(diǎn)得貢獻(xiàn)率達(dá)到了55.6％。同時對前人報道中關(guān)于株高qtl進(jìn)行整合，發(fā)現(xiàn)本發(fā)明中的qtl對應(yīng)在油菜染色體圖譜上的位置與前人報道均不重疊，即本發(fā)明中該主效qtl位點(diǎn)為首次報道，該位點(diǎn)為一個新的qtl。實(shí)施例2：ssr標(biāo)記bogms0665和cnu461有效性的驗(yàn)證根據(jù)bogms0665和cnu461標(biāo)記的基因型來源對f2群體進(jìn)行分組，挑選非重組單株用于后續(xù)的比較分析(表3)。然后，對這些單株對應(yīng)的f2:3和f2:4群體的株高表型進(jìn)行統(tǒng)計上的比較分析，確定不同類別之間的差異是否顯著。利用親本中雙11和no.73290雜交獲得的f1繼續(xù)種植得f2單株，選取基因型顯性雜合的進(jìn)行f2:3的種植；在f2:3單株定苗前進(jìn)行掛牌取樣，提取葉片總dna，利用ssr標(biāo)記bogms0665和cnu461對單株進(jìn)行株高性狀主效qtl基因型的分析，根據(jù)帶型判斷基因型，與中雙11基因型一致的記作“a”，與no.73290基因型相同的記作“b”，如果含有一個單株同時含有中雙11和no.73290的基因型則為雜合基因型記作“h”。統(tǒng)計和中雙11、no.73290以及雜合基因型；然后在成熟期收獲保留下來的f2:3群體，同時對株高性狀進(jìn)行考察。按上述方法對f2:4群體單株的基因型和表型進(jìn)行鑒定。表3利用與油菜株高主效qtl位點(diǎn)qph.c2緊密連鎖的分子標(biāo)記引物得到的f2:3和f2:4的株高考種數(shù)據(jù)分析結(jié)果標(biāo)明，f2:3和f2:4群體中，aa基因型和bb基因型以及hh基因型的單株株高數(shù)據(jù)的差異達(dá)到了顯著水平。其中，aa基因型的平均株高比bb基因型的平均株高少30厘米左右，和該位點(diǎn)的加性效值吻合。另外，hh雜合基因型的平均株高十分接近aa和bb基因型株高的均值，再次證明該位點(diǎn)位加性遺傳。上述結(jié)果充分驗(yàn)證了標(biāo)記bogms0665和cnu461對株高的有效性，因此其用于株高改良是是切實(shí)可行的。因此可以通過對定位區(qū)間的縮小來對該基因位點(diǎn)進(jìn)行克隆進(jìn)而培育出理想株型株高的油菜品種。sequencelisting<110>中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院油料作物研究所<120>一種與油菜株高主效qtl位點(diǎn)qphc2緊密連鎖的分子標(biāo)記及應(yīng)用<130>一種與油菜株高主效qtl位點(diǎn)qphc2緊密連鎖的分子標(biāo)記及應(yīng)用<160>4<170>patentinversion3.1<210>1<211>21<212>dna<213>人工序列<400>1tcagagatgaacaagaagcac21<210>2<211>18<212>dna<213>人工序列<400>2gcgaacctttcccaacct18<210>3<211>20<212>dna<213>人工序列<400>3gccgaaaccgacctcaacta20<210>4<211>22<212>dna<213>人工序列<400>4cagtttgagtttcggaatgcac22當(dāng)前第1頁12