本發(fā)明屬于天然產(chǎn)物化學(xué)的技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種從橄欖葉中分離提取高純度橄欖苦甙和東莨菪素的方法。
背景技術(shù)：
油橄欖又稱洋橄欖、齊墩果，為木犀科木犀欖屬植物，昌世界名貴常綠木本油料和果用樹種。油橄欖以葉和果實入藥用于治療多種疾病，橄欖葉的煎劑或浸劑在地中海國家常作為糖尿病的民間用藥，有一定的療效。油橄欖葉提取可用做膳食補充劑以增強免疫功能?，F(xiàn)有資料表明油橄欖具有抗心率不齊，抗真菌，抗高膽固醇，降血糖，降血壓，抗炎，抗氧化，抗病毒，利尿等多種藥理活性。從油橄欖葉中分離得到的化學(xué)成分可分為：黃酮類、糖類、萜類、有機酸類及其它化合物。橄欖苦昔的藥理作用主要有降血壓、抗氧化、抗微生物和抗癌等作用。
橄欖葉中還含有東莨菪素，依賴性地清除二苯代苦味酰肼(dpph)自由基，并能顯著減輕溶血性磷脂酰膽堿(lpc)所致的ecv304細(xì)胞損傷。東莨菪素可通過抑制轉(zhuǎn)錄因子nf～κb的活化，抑制一氧化氮合酶的誘導(dǎo)生成，從而發(fā)揮抗炎活性，另外還具有體外降糖的效果。
目前國內(nèi)有報道用橄欖葉提取加工橄欖葉提取物，但大多采用簡單水提或醇提后直接噴霧干燥成分，產(chǎn)品中橄欖苦甙、總酚及黃酮含量低。在2007年《青橄欖葉的化學(xué)成分研究》文獻中報道了從橄欖葉分離到了東莨菪素。王成章也報道了橄欖苦甙在橄欖葉中比果實和樹皮中含量要高得多。
公開號為cn101955503a的中國專利介紹了一種橄欖苦甙的制備方法，取多花素馨花作為原料，采用超臨界co2萃取技術(shù)進行提取，有機溶劑萃取，大孔樹脂吸附分離，濃縮過濾，結(jié)晶重結(jié)晶得到橄欖苦甙。此方法因為原材料是花部分，對大規(guī)模制備橄欖苦甙有一定難度，另外，在目前生產(chǎn)過程中超臨界co2萃取技術(shù)很少應(yīng)用，主要是一次投料生產(chǎn)量小，生產(chǎn)設(shè)備成本過高，所以這一技術(shù)很難應(yīng)用于生產(chǎn)。
公開號為cn102060893a的中國專利介紹了一種從油橄欖葉中同步制備橄欖苦苷和橄欖總黃酮的工藝方法，雖然采用了大孔吸附樹脂串聯(lián)吸附、梯度解吸附，分離開了大部分的物質(zhì)，但將解吸液回收有機溶劑后直接噴霧干燥，分別得到較高含量的橄欖苦苷和橄欖總黃酮提取物產(chǎn)品。此方法分離過程太長，造成其有效成分得率過低，另外將解吸液直接噴霧干燥，解吸液中金屬離子以鹽的形式存在于產(chǎn)品中，其它雜質(zhì)也會降低其有效成分含量。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
本發(fā)明采用的技術(shù)方案包括：干燥過后的油橄欖葉先發(fā)酵，再經(jīng)乙醇提取、過濾、減壓濃縮，萃取，然后用樹脂吸附、乙醇洗脫、將洗脫液濃縮，結(jié)晶與重結(jié)晶制得橄欖苦甙和東莨菪素純品。
本發(fā)明采用的微生物菌種為枯草芽孢桿菌(bacillussubtilis)來源于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，編號分別為cgmccno.1.943；木霉(trichodermasp.)來源于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，編號分別為cgmccno.3.3006。
因此，本發(fā)明提供一種從橄欖葉提取橄欖苦甙和東莨菪素的方法，步驟包括：
(1)粉碎橄欖葉，加入10～25％枯草芽孢桿菌液和20～35％木霉發(fā)酵液，25～35℃保溫2～6h，再向其中加入50％乙醇后攪拌混合，加熱至50～70℃進行回流提取，其中橄欖葉重量kg與50％乙醇體積l比為1:3～8；
(2)過濾除渣后，在50℃減壓濃縮至無乙醇味；
(3)將濃縮液用兩倍至四倍體積的氯仿進行萃取，得水層和氯仿層溶液，再將氯仿層溶液進行減壓濃縮，直至獲得干燥物ⅰ，水層用兩倍至四倍體積的乙酸乙酯分三次進行萃取，分離得到三次乙酸乙酯層萃取液，合并其萃取液，并在50℃將其萃取液進行減壓濃縮，直至獲得干燥物ⅱ；
(4)干燥物ⅰ加入水進行溶解，上硅膠柱進行層析分離，用石油醚-乙酸乙酯混合溶劑進行洗脫，收集洗脫液ⅰ，其中石油醚與乙酸乙酯體積l比為1∶1，加入水體積l與干燥物ⅰ重量kg比為2～5∶1；
(5)將干燥物ⅱ用乙醇進行溶解，上h-103大孔樹脂進行吸附，用40％～65％乙醇進行洗脫，收集洗脫液ⅱ，其中干燥物ⅱ重量kg與乙醇體積l比為1∶0.5～3；
(6)將洗脫液ⅰ進行減壓濃縮至原有體積的1/5～1/6，加入兩倍至四倍體積的石油醚進行結(jié)晶和重結(jié)晶，得東莨菪素；
(7)將洗脫液ⅱ進行減壓濃縮至原有體積的1/4～1/5，加入兩倍至四倍體積的乙酸乙酯進行結(jié)晶和重結(jié)晶，得橄欖苦甙。
上述枯草芽孢桿菌液可以通過常規(guī)枯草芽孢桿菌培養(yǎng)方法發(fā)酵獲得，10％枯草芽孢桿菌液是指10l枯草芽孢桿菌液加入到100kg橄欖葉中；木霉發(fā)酵液可以通過常規(guī)木霉菌培養(yǎng)方法發(fā)酵獲得，30％木霉發(fā)酵液是指30l木霉發(fā)酵液加入到100kg橄欖葉中。
在一個實施方案中，步驟(1)的回流提取時間為5h～36h。
在一個實施方案中，步驟(2)的過濾過程是紗布過濾、陶瓷膜過濾。其中，優(yōu)選是三層紗布過濾2次、陶瓷膜過濾1次。
在一個實施方案中，步驟(6)、(7)中進行結(jié)晶和重結(jié)晶時結(jié)晶溫度在低溫下進行，優(yōu)選是在4℃左右。
技術(shù)效果：
1、本發(fā)明采用混合菌種發(fā)酵，使活性物質(zhì)快速釋放，極大提高了產(chǎn)率，大大地降低了生產(chǎn)成本；
2、本發(fā)明確定了采用高濃度乙酸乙酯在低溫條件下進行結(jié)晶，橄欖苦甙的純度是最高，可達(dá)到97.37～98.23％。
3、由于能同時提取出橄欖苦甙和東莨菪素，極大地降低了其生產(chǎn)成本，又節(jié)約了橄欖葉資源。
具體實施方式
下面，本發(fā)明將用實施例進行進一步的說明，但是它并不限于這些實施例的任一個或類似實例。
實施例1
稱取100kg橄欖葉，普通粉碎機進行粉碎，加入15l枯草芽孢桿菌液和35l木霉發(fā)酵液，30℃保溫3h，加入400l的50％乙醇進行混合，加熱至50℃左右進行回流提取10小時后，采用三層紗布過濾2次、陶瓷膜過濾1次；進行過濾除渣后，在50℃減壓濃縮至無乙醇味，得濃縮液80l；將濃縮液用200l氯仿進行萃取，得水層和氯仿層溶液，再將氯仿層溶液進行減壓濃縮，直至獲得2.15kg干燥物ⅰ，水層用200l乙酸乙酯分三次進行萃取，分離得到三次乙酸乙酯層萃取液，合并其萃取液，并在50℃將其萃取液進行減壓濃縮，直至獲得3.26kg干燥物ⅱ；將干燥物ⅰ加入6l水進行溶解，上硅膠柱進行層析分離，用石油醚-乙酸乙酯混合溶劑(體積l比1∶1)進行洗脫，收集30l洗脫液ⅰ。
將干燥物ⅱ用5l乙醇進行溶解，上h-103大孔樹脂進行吸附，用55％乙醇進行洗脫，收集40l洗脫液ⅱ；將洗脫液ⅰ進行減壓濃縮至5l，加入10l的石油醚在4℃進行結(jié)晶和重結(jié)晶，得東莨菪素0.36kg；將洗脫液ⅱ進行減壓濃縮至8l，加入24l的乙酸乙酯在4℃進行結(jié)晶和重結(jié)晶，得橄欖苦甙1.17kg。所得重結(jié)晶樣品進行純度，其檢測儀器為agilent1100高效液相色譜儀(美國安捷倫公司)，色譜柱為shim～packodsc18柱(4.6×150mm，5μm)，流動相為甲醇，檢測波長：254nm；柱溫30℃；流速：1.0ml/min；上樣量為10μl，檢測所得到橄欖苦甙的純度為98.43％。流動相為乙酸乙酯-甲醇(40:60，v/v)，檢測波長：330nm；柱溫30℃；流速：1.0ml/min；上樣量為10μl，檢測所得到東莨菪素的純度為97.68％。
實施例2
稱取200kg橄欖葉，普通粉碎機進行粉碎，加入35l枯草芽孢桿菌液和60l木霉發(fā)酵液，35℃保溫3h，加入600l的50％乙醇進行混合，加熱至50℃左右進行回流提取9小時后，采用三層紗布過濾2次、陶瓷膜過濾1次；進行過濾除渣后，在50℃減壓濃縮至無乙醇味，得濃縮液150l；將濃縮液用350l氯仿進行萃取，得水層和氯仿層溶液，再將氯仿層溶液進行減壓濃縮，直至獲得4.63kg干燥物ⅰ，水層用350l乙酸乙酯分三次進行萃取，分離得到三次乙酸乙酯層萃取液，合并其萃取液，并在50℃將其萃取液進行減壓濃縮，直至獲得6.85kg干燥物ⅱ。
將干燥物ⅰ加入10l水進行溶解，上硅膠柱進行層析分離，用石油醚-乙酸乙酯混合溶劑(體積l比1∶1)進行洗脫，收集45l洗脫液ⅰ。將干燥物ⅱ用8l乙醇進行溶解，上h-103大孔樹脂進行吸附，用55％乙醇進行洗脫，收集60l洗脫液ⅱ。
將洗脫液ⅰ進行減壓濃縮至8l，加入16l的石油醚在4℃進行結(jié)晶和重結(jié)晶，得東莨菪素0.84kg；將洗脫液ⅱ進行減壓濃縮至12l，加入36l的乙酸乙酯在4℃進行結(jié)晶和重結(jié)晶，得橄欖苦甙2.35kg。按實施例1中檢測方法進行檢測所得到橄欖苦甙的純度為98.26％，東莨菪素的純度為98.25％。
實施例3
稱取500kg橄欖葉，普通粉碎機進行粉碎，加入120l％枯草芽孢桿菌液和150l木霉發(fā)酵液，25～35℃保溫2h，加入2000l的50％乙醇進行混合，加熱至50℃左右進行回流提取8小時后，采用三層紗布過濾2次、陶瓷膜過濾1次；進行過濾除渣后，在50℃減壓濃縮至無乙醇味，得濃縮液300l；將濃縮液用800l氯仿進行萃取，得水層和氯仿層溶液，再將氯仿層溶液進行減壓濃縮，直至獲得12.48kg干燥物ⅰ，水層用800l乙酸乙酯分三次進行萃取，分離得到三次乙酸乙酯層萃取液，合并其萃取液，并在50℃將其萃取液進行減壓濃縮，直至獲得16.77kg干燥物ⅱ；將干燥物ⅰ加入30l水進行溶解，上硅膠柱進行層析分離，用石油醚-乙酸乙酯混合溶劑(體積l比1∶1)進行洗脫，收集150l洗脫液ⅰ。
將干燥物ⅱ用20l乙醇進行溶解，上h-103大孔樹脂進行吸附，用55％乙醇進行洗脫，收集120l洗脫液ⅱ；
將洗脫液ⅰ進行減壓濃縮至20l，加入40l的石油醚在4℃進行結(jié)晶和重結(jié)晶，得東莨菪素1.95kg；將洗脫液ⅱ進行減壓濃縮至30l，加入90l的乙酸乙酯在4℃進行結(jié)晶和重結(jié)晶，得橄欖苦甙5.74kg。按實施例1中檢測方法進行檢測所得到橄欖苦甙的純度為98.78％，東莨菪素的純度為97.83％。