本發(fā)明涉及一種抗黃曲霉毒素m1單克隆抗體及免疫吸附劑及其制備方法，還涉及一種制備該免疫吸附劑的免疫親和柱的制備方法，屬于食品科學(xué)
技術(shù)領(lǐng)域：
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背景技術(shù)：
：黃曲霉毒素m1（aflatoxinm1,afm1）主要存在于乳中，因此最初被稱為“牛奶毒素”，由deiongh等發(fā)現(xiàn)后發(fā)表在1964年的nature雜志上。隨著研究的深入發(fā)現(xiàn)，afm1是黃曲霉毒素b1（aflatoxinb1,afb1）是在體內(nèi)經(jīng)細(xì)胞色素p450系列酶的作用下經(jīng)羥基化所形成的，一般認(rèn)為afb1的羥基代謝物是毒素的解毒形式。然而afm1不能被看作是afb1的解毒產(chǎn)物，有許多實(shí)驗(yàn)研究表明afm1都具有細(xì)胞毒性和致癌性，是目前影響乳制品安全性的重要有害物之一。由于黃曲霉毒素m1（簡(jiǎn)稱afm1）耐高溫而且穩(wěn)定性強(qiáng)，在乳制品的加工過程中通常無法通過高溫殺菌工藝直接去除，因此，目前還沒有通過直接技術(shù)手段去除乳中afm1的污染的方法，控制乳中afm1的措施只有采用嚴(yán)格的法定殘留限量標(biāo)準(zhǔn)和精密檢測(cè)技術(shù)來進(jìn)行，一旦超標(biāo)就需要將污染afm1的乳液進(jìn)行銷毀，常造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。典型案例就是2011年國(guó)家質(zhì)檢總局公布了蒙牛乳業(yè)（眉山）有限公司和福建長(zhǎng)富乳品有限公司生產(chǎn)的液體奶中含超標(biāo)afm1后引起了社會(huì)極大的恐慌，同時(shí)也對(duì)乳業(yè)公司造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明要解決的技術(shù)問題在于提供一種抗黃曲霉毒素m1單克隆抗體，該抗體具有很高的分泌特異性和親和力，能夠特異性結(jié)合乳中afm1。本發(fā)明要解決的第二個(gè)技術(shù)問題在于提供一種由上述抗黃曲霉毒素m1單克隆抗體制備的免疫吸附劑及其制備方法。本發(fā)明要解決的第三個(gè)技術(shù)問題在于提供一種由上述抗黃曲霉毒素m1單克隆抗體制備的免疫親和柱及其制備方法。本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是由如下方案實(shí)現(xiàn)的：1、一種抗黃曲霉毒素m1單克隆抗體，所述抗黃曲霉毒素m1單克隆抗體的重鏈為igg2b型，輕鏈為λ型，所述輕鏈氨基端前15個(gè)氨基酸序列為gvtqesalttspggt，所述重鏈氨基端前15個(gè)氨基酸序列為evilvesggglvkpg，分子量為150kd；所述抗黃曲霉毒素m1單克隆抗體與黃曲霉毒素m1、黃曲霉毒素m2、黃曲霉毒素b1、黃曲霉毒素b2、黃曲霉毒素g1、黃曲霉毒素g2、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇和bsa的交叉反應(yīng)率分別為100%、4.5%、21.5%、1.0%、16.6%、1.0%、0%、0%，親和常數(shù)為5.5×10-10mol/l。所述黃曲霉毒素m1單克隆抗體的制備方法，包括以下步驟：（1）抗黃曲霉毒素m1單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株系的獲得該雜交瘤細(xì)胞株系是用完全抗原afm1-bsa免疫小鼠后所得的脾臟細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞sp2/0融合得到，傳代30代分泌抗體活性無差別，雜交瘤細(xì)胞在無血清培養(yǎng)基中能穩(wěn)定分泌抗黃曲霉毒素m1單克隆抗體，在co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至細(xì)胞全部死亡后培養(yǎng)基中抗afm1的抗體濃度可達(dá)0.15mg/ml；（2）抗黃曲霉毒素m1單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株系的篩選所述抗黃曲霉毒素m1單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株的篩選采用高通量對(duì)比elisa方法，篩選過程包括以下步驟：選擇免疫效價(jià)超過10-5以上的小鼠脾臟細(xì)胞進(jìn)行追加免疫，3天后取脾細(xì)胞與sp2/0細(xì)胞按1：1的比例在分子量為1450的50%peg作用下進(jìn)行細(xì)胞融合，融合細(xì)胞利用hat培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞密度后均勻分配到45塊96孔板中，在5%的co2和37℃的培養(yǎng)箱培養(yǎng)10天；10天后在吸取上清液進(jìn)行陽性孔的篩選，篩選采用在預(yù)先準(zhǔn)備好的bsa和afm1-bsa包被板各45塊96孔板利用全自動(dòng)加樣器、transtar-96等設(shè)備移液、洗板、加2抗、加顯色液、加終止液后用酶標(biāo)儀測(cè)定od值，依據(jù)拖孔數(shù)和在afm1-bsa包被板中的顯陽性而在bsa包被板中顯隱性的細(xì)胞孔為第一次篩選對(duì)象，利用顯微操作技術(shù)分別吸取陽性孔的各個(gè)融合細(xì)胞集落轉(zhuǎn)入新的96孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)，培養(yǎng)基變色后進(jìn)行亞克隆，獲得穩(wěn)定分泌抗afm1單克隆抗體的細(xì)胞株系；（3）抗黃曲霉毒素m1單克隆抗體的制備采用蛋白a/g純化，包括以下具體步驟：首先以105/ml的初始密度將篩選的雜交瘤細(xì)胞在1升旋轉(zhuǎn)瓶中進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)細(xì)胞全部死亡后利用大容量離心機(jī)離心收集上清液，經(jīng)緩沖液1：1稀釋后利用蛋白a/g純化柱純化，收集洗脫液并利用amicon攪拌式超濾裝置經(jīng)3萬分子量的透析膜濃縮純化抗體，濃縮抗體經(jīng)過nd1000型超微量紫外分光光度計(jì)定量后獲得抗黃曲霉毒素m1單克隆抗體；抗黃曲霉毒素m1單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株系在申請(qǐng)日之前的文獻(xiàn)中公眾可以獲得：該文獻(xiàn)為：《應(yīng)用hts-elisa篩選方法制備抗黃曲霉毒素m1單抗》.微生物學(xué)報(bào).isticpku-2010年10期.裴世春、何娜、張立軍、陸梅生。公眾可以按照上述文獻(xiàn)的方法制得；也可以按照本發(fā)明方法制得。2、一種抗黃曲霉毒素m1單克隆抗體免疫吸附劑及其制備方法：一種抗黃曲霉毒素m1單克隆抗體免疫吸附劑，所述免疫吸附劑包括固相載體和與該固相載體偶聯(lián)的抗黃曲霉毒素m1單克隆抗體，所述固相載體為含有環(huán)氧基團(tuán)的活化樹脂。上述抗黃曲霉毒素m1單克隆抗體免疫吸附劑的制備方法為：具體包括以下步驟：1）聚合物微球的制備：將聚乙烯吡咯烷酮溶于無水乙醇與去離子水混合液加入到三口瓶中，攪拌成均相體系后，通入氮?dú)馀趴?，并升至所需反?yīng)溫度70℃；一次性加入溶有引發(fā)劑偶氮二異丁腈的苯乙烯與甲基丙烯酸縮水甘油酯單體，在攪拌和氮?dú)獗Ｗo(hù)下反應(yīng)24h后終止反應(yīng)；將聚合產(chǎn)物進(jìn)行離心沉降，棄去清液，加入無水乙醇重新分散，再沉降，反復(fù)多次，再加入去離子水重新分散，沉降，反復(fù)多次，而后真空干燥，獲得高分子樹脂；1）活化樹脂：將高分子樹脂用蒸餾水充分溶脹后，抽干，按照1g/2l加入濃度為2mol/l的naoh溶液，邊攪拌邊加環(huán)氧氯丙烷，在40~50℃反應(yīng)24h，抽干后，用丙酮和蒸餾水洗滌樹脂，即得到活化樹脂；2）偶聯(lián)：將活化樹脂用大于5倍凝膠體積的偶聯(lián)緩沖液（0.1mol/l，nahco3，ph8.4）抽洗5次，迅速轉(zhuǎn)移至含有黃曲霉毒素m1單克隆抗體的偶聯(lián)緩沖液（0.1mol/l，nahco3，ph8.4）中，室溫1h或4℃過夜溫和攪拌，使黃曲霉毒素m1單克隆抗體與活化樹脂充分偶聯(lián)，靜置，收集偶聯(lián)樹脂；3）封閉：將偶聯(lián)樹脂加入平衡緩沖液（0.1mol/l，ph8.0，tris-hcl），中室溫封閉2h；4）洗滌：然后用200ml的醋酸溶液（0.1mol/l，ph4.0）和平衡緩沖液（0.1mol/l，tris-hcl，ph8.0）先后交替洗滌4～6次，洗滌后用平衡緩沖液（0.1mol/lph8.0，tris-hcl）平衡，即制得抗黃曲霉毒素m1單克隆抗體免疫吸附劑。3.一種裝載抗黃曲霉毒素m1單克隆抗體免疫吸附劑的免疫親和柱的制備方法，具體包括以下具體步驟：取柱管，墊好篩板，將權(quán)利要求3制備的偶聯(lián)抗黃曲霉毒素m1單克隆抗體的免疫吸附劑裝入柱管中，滴入平衡緩沖液（0.1mol/l，ph8.0，tris-hcl）使膠面穩(wěn)定，封住口底。本發(fā)明的有益效果是：本發(fā)明所述抗黃曲霉毒素m1單克隆抗體是一種具有分泌高特異性和高親和力的抗黃曲霉毒素m1單克隆抗體，所述抗黃曲霉毒素m1單克隆抗體與黃曲霉毒素m1、黃曲霉毒素m2、黃曲霉毒素b1、黃曲霉毒素b2、黃曲霉毒素g1、黃曲霉毒素g2、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇和bsa的交叉反應(yīng)率分別為100%、4.5%、21.5%、1.0%、16.6%、1.0%、0%、0%，親和常數(shù)為5.5×10-10mol/l。利用該特異性抗黃曲霉毒素m1單克隆抗體和特殊載體材料制備的本發(fā)明免疫吸附劑是高效專一的體外免疫吸附劑，抗afmi單克隆抗體與活化樹脂的偶聯(lián)率為93.4%，黃曲霉毒素m1的吸附容量為100ug/mg抗體，該免疫吸附劑可應(yīng)用于鮮乳加工中在無損鮮乳營(yíng)養(yǎng)基礎(chǔ)上去除黃曲霉毒素m1，進(jìn)而保障乳制品的安全性。附圖說明以下結(jié)合附圖和具體實(shí)施方式對(duì)本發(fā)明加以詳細(xì)說明。圖1為實(shí)施例3中的單抗sds-page圖片。圖2為實(shí)施例4中抗afm1單抗亞類的鑒定圖片。圖3為實(shí)施例5中不同毒素對(duì)afm1單抗的抑制率曲線。圖4為實(shí)施例6中抗afm1單抗親和力鑒定結(jié)果曲線。具體實(shí)施方式（1）材料與儀器本發(fā)明實(shí)驗(yàn)所需主要試劑、耗材以及實(shí)驗(yàn)儀器如表1所示。（2）免疫動(dòng)物與細(xì)胞sp2/0細(xì)胞購(gòu)至英國(guó)劍橋大學(xué)mrc，babl/c小鼠購(gòu)于哈爾濱獸醫(yī)研究所。表1實(shí)驗(yàn)所需試劑耗材以及儀器設(shè)備試劑與儀器來源黃曲霉毒素m1，m2，b1，b2，g1，g2sigma公司aflatoxinm1-bsa全抗原sigma公司牛血清白蛋白bsa、卵清蛋白o(hù)vasigma公司弗氏完全佐劑和弗氏不完全佐劑sigma公司超濾膜(30,000nmwl，直徑44.5mm)millipore,ultracelym-30hat和ht培養(yǎng)基sigma公司pegsigma公司鼠單抗分型檢測(cè)試劑sigma公司md6無血清培養(yǎng)基大慶麥伯康生物技術(shù)有限公司新生牛血清、胎牛血清hyclone公司96孔酶標(biāo)板和細(xì)胞培養(yǎng)板costar公司超微量紫外可見分光光度計(jì)ge公司，nanovue微孔板分液器ufill型美國(guó)biotek公司酶標(biāo)儀elx808型美國(guó)biotek公司全自動(dòng)加樣機(jī)英國(guó)genetix公司qfill3?96孔移液器corning公司細(xì)胞培養(yǎng)生物反應(yīng)器荷蘭applikon洗板機(jī)美國(guó)sim公司co2培養(yǎng)箱美國(guó)sim公司生物安全柜美國(guó)sim公司實(shí)施例1一種抗黃曲霉毒素m1單克隆抗體，所述抗黃曲霉毒素m1單克隆抗體的重鏈為igg2b型，輕鏈為λ型，所述輕鏈氨基端前15個(gè)氨基酸序列為gvtqesalttspggt，所述重鏈氨基端前15個(gè)氨基酸序列為evilvesggglvkpg，分子量為150kd；所述抗黃曲霉毒素m1單克隆抗體與黃曲霉毒素m1、黃曲霉毒素m2、黃曲霉毒素b1、黃曲霉毒素b2、黃曲霉毒素g1、黃曲霉毒素g2、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇和bsa的交叉反應(yīng)率分別為100%、4.5%、21.5%、1.0%、16.6%、1.0%、0%、0%，親和常數(shù)為5.5×10-10mol/l。上述抗黃曲霉毒素m1單克隆抗體的制備過程及鑒定如下所示：1、動(dòng)物免疫方案選用8只6周齡babl/c小鼠進(jìn)行免疫，免疫原為完全抗原afm1-bsa，每次免疫劑量為20μg/只，皮下及腹腔注射，每?jī)芍苊庖咭淮?。初次免疫采用弗氏完全佐劑乳化完全抗原?-3次免疫采用弗氏不完全佐劑乳化完全抗原。第3次免疫10天后斷尾采血，用間接elisa法檢測(cè)血清效價(jià)。用包被液（碳酸鹽緩沖液）將afm1-bsa稀釋到0.1μg/ml濃度后，按每孔100μl/孔包被酶標(biāo)板，常溫過夜后用洗滌液（含0.05%吐溫-20的pbs）洗板3次。加封閉液（1%牛血清蛋白液）100μl/孔，37℃溫育1h，洗滌3次。待檢血清樣品倍比稀釋后，100μl/孔，37℃溫育1h，洗滌3次。酶標(biāo)二抗以1：5000倍稀釋后加入100μl/孔，37℃溫育1h，洗滌3次。加入tmb底物溶液100μl/孔，避光靜置10min，加終止液（2m的h2so4）50μl/孔,采用酶標(biāo)儀測(cè)定450nm處od值。當(dāng)od值大于或等于陰性對(duì)照od值2倍時(shí)的最高血清稀釋倍數(shù)為血清效價(jià)。第3次免疫后小鼠血清平均效價(jià)可達(dá)到1：0.5x105以上。2、細(xì)胞融合、篩選與克隆方案（1）sp2/o骨髓瘤細(xì)胞的準(zhǔn)備：融合前36-48h將培養(yǎng)好處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的骨髓瘤細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)，融合前用彎頭吸管將細(xì)胞從細(xì)胞培養(yǎng)瓶壁上吹下，收集于50ml離心管中，1200rpm離心4分鐘，棄上清。再加入20ml1640培養(yǎng)液，重新混勻，1200rpm離心4分鐘，棄上清，加10ml1640培養(yǎng)液，混勻。取細(xì)胞懸液0.1ml，再加入0.9ml1%臺(tái)盼蘭，混勻，滴于計(jì)數(shù)板上顯微鏡下計(jì)數(shù)，備用。（2）脾細(xì)胞的準(zhǔn)備：選擇抗血清效價(jià)1：0.5x105以上的babl/c小鼠于融合前3天腹腔加強(qiáng)免疫1次，免疫原為afm1-bsa，20ug/只，不加佐劑。融合前摘小鼠眼球放血，頸部脫臼處死，75%酒精浸泡消毒，然后將小鼠固定于生物安全柜的鼠板上。無菌打開腹腔，取出脾臟，于含10ml1640培養(yǎng)液的平皿中洗滌兩次，去掉周圍的脂肪組織與結(jié)締組織，置于含10ml1640培養(yǎng)液的平皿中。取200目網(wǎng)篩放于平皿中，加1640培養(yǎng)液至浸沒網(wǎng)篩，將脾臟置于網(wǎng)篩上培養(yǎng)液中，用l型棒輕輕擠壓脾臟，使脾細(xì)胞完全進(jìn)入培養(yǎng)液中。將脾細(xì)胞液吸入50ml離心管中，1400rpm離心4分鐘，棄上清液，再加10ml1640培養(yǎng)液，混勻。同上細(xì)胞計(jì)數(shù)，備用。（3）細(xì)胞融合：取小鼠脾臟細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果為8.47×107，與骨髓瘤細(xì)胞融合后，利用添加1%hat和10%fbs的1200mlmd6哺乳細(xì)胞無血清培養(yǎng)基稀釋融合細(xì)胞后280ul/孔均分到45塊96孔平底細(xì)胞培養(yǎng)板中，在5%co2和37℃的培養(yǎng)箱中封閉培養(yǎng)10-12天。10-12天后利用transtar-96移液器在物菌凈化操作臺(tái)內(nèi)分別取上清液50μl/孔分別轉(zhuǎn)移到預(yù)先準(zhǔn)備好的與細(xì)胞培養(yǎng)板相對(duì)應(yīng)的并包被有afm1-bsa和bsa的各45塊elisa板中，利用高通量檢測(cè)方法篩選陽性雜交瘤細(xì)胞孔。（4）陽性克隆的篩選和克隆：10天后在吸取上清液進(jìn)行陽性孔的篩選，篩選采用在預(yù)先準(zhǔn)備好的bsa和afm1-bsa包被板各45塊96孔板分別添加上清液后孵育，基于經(jīng)典的間接elisa的洗板、加2抗、加顯色液、加終止液后用酶標(biāo)儀測(cè)定od值，選擇在afm1-bsa包被板中的顯陽性而在bsa包被板中顯隱性的細(xì)胞孔為第一次篩選對(duì)象，利用顯微操作技術(shù)分別吸取陽性孔的各個(gè)融合細(xì)胞集落轉(zhuǎn)入新的96孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)，培養(yǎng)基變色后進(jìn)行confirm-elisa，收集確認(rèn)的陽性細(xì)胞株進(jìn)行培養(yǎng)，取單個(gè)克隆的孔細(xì)胞上清液進(jìn)行抗體檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果為陽性的克隆繼續(xù)擴(kuò)大培養(yǎng)后凍存以及用于制備抗體。其結(jié)果如表2所示。表2獲得的陽性克隆雜交瘤細(xì)胞3、抗黃曲霉毒素m1單克隆抗體的制備和純化方案（1）無血清培養(yǎng)基制備抗體：將確認(rèn)的陽性細(xì)胞株擴(kuò)大培養(yǎng)后轉(zhuǎn)入1升轉(zhuǎn)瓶中培養(yǎng)14天，收集培養(yǎng)液離心后1：1與pbs緩沖液混合過蛋白a柱，用ph3.7的洗脫液進(jìn)行洗脫，通過amicon攪拌式超濾裝置利用3萬分子量的超濾膜進(jìn)行濃縮，濃縮液利用ge公司的超微量紫外分光光度計(jì)定量后分裝后進(jìn)行冷凍干燥并保存。（2）小鼠腹水法制備腹水抗體：取10周齡產(chǎn)后的健康balb/c小鼠，腹腔注射500μl滅菌石蠟油，七天后小鼠腹腔注射106雜交瘤細(xì)胞/只，待7天后小鼠腹部腫脹，收集腹水并純化。（3）sds-page:將通過腹水法制備的抗afm1單抗、無血清培養(yǎng)法制備的抗afm1單抗，以及純化后的無血清培養(yǎng)的單抗分別進(jìn)行sds-page，結(jié)果如圖1所示，由該圖可見腹水法制備的單抗雜蛋白較多，而無血清培養(yǎng)的抗體則純度較高，純化效果良好。4、抗黃曲霉毒素m1單克隆抗體亞類的鑒定方案根據(jù)sbaclonotypingsystem/hrp抗體亞型測(cè)定試劑盒，利用分泌抗afm1單抗的雜交瘤細(xì)胞上清進(jìn)行亞類鑒定。方法為：將包被原afm1-bsa按1、0.5、0.25mg/l包被酶標(biāo)板，100μl/孔，4℃過夜；1.5%的bsa封閉后，將單抗從1mg/l開始梯度稀釋后進(jìn)行間接非競(jìng)爭(zhēng)elisa檢測(cè)。其結(jié)果如圖2所示，可見得到的抗afm1單抗重鏈為igg2b型、輕鏈為λ鏈，抗體輕鏈氨基端前15個(gè)氨基酸序列為gvtqesalttspggt，重鏈氨基端前15個(gè)氨基酸序列為evilvesggglvkpg，分子量為150kd。5、抗黃曲霉毒素m1單克隆抗體單克隆抗體與其他毒素之間交叉反應(yīng)率的測(cè)定方案以包被原afm1-bsa包被酶標(biāo)板，100ul/孔，4℃過夜，倒出孔內(nèi)液體，洗滌液（含0.05%吐溫20的pbs液）洗滌3次。加封閉液（1%牛血清蛋白液）100ul/孔，37℃溫育1h，倒出孔內(nèi)液體，洗滌3次。取不同稀釋濃度（1000ng/ml、100ng/ml、10ng/ml、1ng/ml、0.1ng/ml、0.01ng/ml、0.001ug/ml、0.0001ug/ml）的黃曲霉毒素m1、黃曲霉毒素m2、黃曲霉毒素b1、黃曲霉毒素b2、黃曲霉毒素g1、黃曲霉毒素g2、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇和bsa標(biāo)準(zhǔn)品與等體積適度濃度（0.1ug/ml）的單抗混合添加到包被板中，100ul/孔，37℃溫育1h，倒出孔內(nèi)液體，洗滌三次。再加酶標(biāo)二抗（1：2000倍稀釋），100ul/孔，37℃溫育1h，洗滌3次。加入tmb底物溶液150ul/孔，避光靜置10min，加終止液（2mh2so4）50ul/孔，采用酶標(biāo)板測(cè)定450nm處各孔的吸光率（a）。根據(jù)公式：競(jìng)爭(zhēng)抑制率=（陽性對(duì)照孔a值-阻斷孔的a值）/陽性對(duì)照孔a值*100%計(jì)算競(jìng)爭(zhēng)抑制率，再根據(jù)公式：交叉反應(yīng)率=抑制率為50%時(shí)afm1濃度/抑制率為50%時(shí)競(jìng)爭(zhēng)物濃度*100%計(jì)算交叉反應(yīng)率。結(jié)果如圖4所示，抗體與黃曲霉毒素m1、黃曲霉毒素m2、黃曲霉毒素b1、黃曲霉毒素b2、黃曲霉毒素g1、黃曲霉毒素g2、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇和bsa的交叉反應(yīng)率分別為100%、4.5%、21.5%、1.0%、16.6%、1.0%、0%、0%。6、抗黃曲霉毒素m1單克隆抗體親和力的測(cè)定方案將包被原afm1-bsa分別以1、0.5、和0.25ug/ml的濃度包被酶標(biāo)板，100ul/孔，37℃溫育1h，倒出孔內(nèi)液體，用洗滌液（含0.05%吐溫20的pbs液）洗滌3次.再加入倍比系列稀釋（1：400、1：1600、1：6400、1：25600、1：102400、1：409600、1：1638400）的單克隆抗體，100ul/孔，37℃溫育1h，倒出孔內(nèi)液體，洗滌3次。加酶標(biāo)二抗（1：1000倍稀釋）100ul/孔，37℃溫育1h，洗滌3次。加入tmb底物溶液100ul/孔，避光靜置10min，加終止液（2mh2so4）50ul/孔，采用酶標(biāo)板測(cè)定450nm處各孔的吸光率（a）。以抗體濃度（ab）為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)繪制三條不同包被濃度的曲線圖，如圖4所示。分別找出3條曲線的50％odmax所對(duì)應(yīng)的抗體濃度分別是1.12×10-11mol/l、1.26×10-11mol/l、1.35×10-11mol/l，根據(jù)公式kaff=(n-1)/2(n[ab’]t-[ab]t)共求出3個(gè)kaff值分別是4.0×1010m-1、3.0×1010m-1、9.0×1010m-1，取其平均值即為單抗的親和常數(shù)為5.5×1010m-1。實(shí)施例2一種抗黃曲霉毒素m1單克隆抗體免疫吸附劑，所述免疫吸附劑包括固相載體和與該固相載體偶聯(lián)的抗黃曲霉毒素m1單克隆抗體，所述固相載體為含有環(huán)氧基團(tuán)的活化樹脂。上述抗黃曲霉毒素m1單克隆抗體免疫吸附劑的制備方法為：具體包括以下步驟：1）聚合物微球的制備：將聚乙烯吡咯烷酮溶于無水乙醇與去離子水混合液加入到三口瓶中，攪拌成均相體系后，通入氮?dú)馀趴?，并升至所需反?yīng)溫度70℃；一次性加入溶有引發(fā)劑偶氮二異丁腈的苯乙烯與甲基丙烯酸縮水甘油酯單體，在攪拌和氮?dú)獗Ｗo(hù)下反應(yīng)24h后終止反應(yīng)；將聚合產(chǎn)物進(jìn)行離心沉降，棄去清液，加入無水乙醇重新分散，再沉降，反復(fù)多次，再加入去離子水重新分散，沉降，反復(fù)多次，而后真空干燥，獲得高分子樹脂；1）活化樹脂：將高分子樹脂用蒸餾水充分溶脹后，抽干，按照1g/2l加入濃度為2mol/l的naoh溶液，邊攪拌邊加環(huán)氧氯丙烷，在40~50℃反應(yīng)24h，抽干后，用丙酮和蒸餾水洗滌樹脂，即得到活化樹脂；2）偶聯(lián)：將活化樹脂用大于5倍凝膠體積的偶聯(lián)緩沖液（0.1mol/l，nahco3，ph8.4）抽洗5次，迅速轉(zhuǎn)移至含有黃曲霉毒素m1單克隆抗體的偶聯(lián)緩沖液（0.1mol/l，nahco3，ph8.4）中，室溫1h或4℃過夜溫和攪拌，使黃曲霉毒素m1單克隆抗體與活化樹脂充分偶聯(lián)，靜置，收集偶聯(lián)樹脂；3）封閉：將偶聯(lián)樹脂加入平衡緩沖液（0.1mol/l，ph8.0，tris-hcl），中室溫封閉2h；4）洗滌：然后用200ml的醋酸溶液（0.1mol/l，ph4.0）和平衡緩沖液（0.1mol/l，tris-hcl，ph8.0）先后交替洗滌4～6次，洗滌后用平衡緩沖液（0.1mol/lph8.0，tris-hcl）平衡，即制得抗黃曲霉毒素m1單克隆抗體免疫吸附劑。實(shí)施例3一種裝載有抗黃曲霉毒素m1單克隆抗體免疫吸附劑的免疫親和柱，其制備方法包括以下具體步驟：取柱管，墊好篩板，將權(quán)利要求3制備的偶聯(lián)抗黃曲霉毒素m1單克隆抗體的免疫吸附劑裝入柱管中，滴入平衡緩沖液（0.1mol/l，ph8.0，tris-hcl）使膠面穩(wěn)定，封住口底。實(shí)施例4免疫吸附劑的吸附性能測(cè)定方案添加有100ng、200ng、300ng、400ngafm1鮮乳溶液500ml全部通過偶聯(lián)有1mg抗黃曲霉毒素m1單克隆抗體的免疫吸附劑的免疫親和柱，每個(gè)濃度3次重復(fù)，洗滌、洗脫、收集洗脫液,ic-elisa檢測(cè)收集液中的afm1含量，最后計(jì)算免疫吸附容量，由表3可知添加afm1含量在200ng以下時(shí)吸附率在90%以上，吸附容量接近100ug/mg抗體。表3afm1單克隆抗體免疫親吸附劑的最大吸附量添加量(ng)自制免疫吸附劑的吸附率（%）10093.120092.630081.5當(dāng)前第1頁12