本發(fā)明屬于工業(yè)生物技術領域，具體涉及采用惡臭假單胞菌通過pcr擴增得到腈水解酶基因，構建無需體外誘導的組成型重組表達體系，并研究其高密度發(fā)酵工藝及其在煙酸合成中的應用。

背景技術：

煙酸(nicotinicacid)，化學名為3-吡啶甲酸，又可叫尼克丁酸、維生素b3，對人體正常生長發(fā)育具有重要作用，常被應用于醫(yī)藥中間體、染料、發(fā)光材料、食品添加劑和動物飼料等生產中。煙酸在機體組織中的氧化還原過程中發(fā)揮重要作用，具有促進細胞新陳代謝和擴張血管的功能，能夠促進人和動物的生長發(fā)育。煙酸作為藥品可防治皮膚病和類似的維生素缺乏癥，具有擴張血管的作用，用于醫(yī)治末梢神經痙攣，動脈硬化等病癥。煙酸還可作為具有生理和化學活性的精細中間體、醫(yī)藥中間體，用它可以開發(fā)一系列高附加值的產品，如煙酸鉻、煙酸肌醇酯、ve煙酸酯、2-氯煙酸等。因此對煙酸的研究具有重要的實際應用價值。

最初，煙酸是通過氧化尼古丁制得，后來逐漸發(fā)展到以2-甲基-5-乙基吡啶、3-甲基吡啶以及喹啉等為原料制備；在我國，煙酸生產起步于上個世紀70年代，目前工業(yè)生產中主要以3-甲基吡啶為原料，通過氧化反應制備獲得煙酸，而其中氧化方法主要分為液相氧化法和氣相氧化法，以上方法具有氧化劑價格昂貴，過程復雜，產物難分離，污染高及對生產設備要求也高等缺點。

相比于傳統(tǒng)化學法生產煙酸，生物催化法因其反應條件溫和，無需在強酸、強堿、高溫、高壓等苛刻的條件下進行，因而倍受關注。傳統(tǒng)的重組菌產腈水解酶多數需進行體外誘導，增加了工藝步驟和生產成本，且iptg對菌體具有一定毒害。構建無需體外誘導的腈水解酶組成型重組表達體系，可避免iptg使用所導致的生產成本增加及對菌體造成的毒害作用。通過高密度發(fā)酵制備大量菌體用于生物催化反應，將進一步降低工藝的生產成本，對于工業(yè)規(guī)模煙酸的生物合成具有重要的研究意義。

技術實現要素：

本發(fā)明的目的是構建一種無需進行體外誘導的腈水解酶組成型重組大腸埃希氏菌escherichiacolinit-1，并研究其高密度發(fā)酵工藝，最終應用于煙酸的連續(xù)轉化合成。

本發(fā)明采用的技術方案是：一種產組成型重組腈水解酶的大腸埃希氏菌的構建，方法如下：

1)腈水解酶基因nit的擴增：提取惡臭假單胞菌pseudomonasputidacgmcc3830基因組，設計上下游引物2pu和3bd，pcr擴增獲得腈水解酶基因nit，引物序列如下：

2pu：5'-ggaattccatatgatggttacgtacacgaataagtt-3'

3bd：5'-attgctcagctcagctctcttcatggaccttaac-3'

2)pet-3b重組質粒的制備：利用限制性內切酶對pet-3b質粒進行雙酶切，將同樣酶切后的腈水解酶基因nit與pet-3b質粒相連，得到重組質粒pet-3b-nit；

3)重組質粒的轉化：將重組質粒pet-3b-nit轉入e.colibl21(de3)中，得到重組菌e.colibl21(de3)(pet-3b-nit)，命名為大腸埃希氏菌escherichiacolinit-1，現保藏于位于北京市朝陽區(qū)北辰西路一號院3號的中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為cgmccno.14254，保藏日期2017年6月19日。

本發(fā)明還提供所述產組成型重組腈水解酶的cgmccno.14254的高密度發(fā)酵方法，具體如下：將斜面菌種進行活化，以2～5％的接種量轉接至新鮮的種子培養(yǎng)基中，在30～40℃條件下培養(yǎng)8～16h。按照5～20％接種量轉接至發(fā)酵罐中，利用ph電極和溶氧電極實時監(jiān)測發(fā)酵液的ph和溶氧值，通過調節(jié)轉速和通氣量，使溶氧維持在10～20％。在分批發(fā)酵階段，流加25％氨水(v/v)使發(fā)酵液ph不低于6.8，分批發(fā)酵階段葡萄糖消耗完后進入補料階段，采用ph-stat補料策略進行發(fā)酵，在補料前期，通過流加氨水的調控方式設置ph穩(wěn)定在6.8，每升高0.01即開始流加補料培養(yǎng)基；補料中期，設置ph每升高0.03即開始流加補料培養(yǎng)基；補料后期設置每升額高0.05開始補料。發(fā)酵轉速維持在600rpm以內。所述發(fā)酵罐內添加終濃度為100μg/ml的氨芐青霉素，所述發(fā)酵培養(yǎng)基組分為(g/l)：胰蛋白胨10～20，酵母粉5～15，nacl0.1～1，kcl0.1～0.5，mgcl20.5～1，葡萄糖5～20，微量元素1～5ml/l(微量元素溶液g/l：fecl3·6h2o6，znso4·7h2o0.58，cacl20.2，cucl2·2h2o0.2，mnso4·h2o0.3，edta0.5)，ph6.0～7.0。所述補料培養(yǎng)基組分為(g/l)：葡萄糖500～1000，mgso410～20，微量元素10～20ml/l。

本發(fā)明還提供所述產組成型重組腈水解酶的cgmccno.14254在連續(xù)轉化合成煙酸中的應用，所述應用為：以重組大腸埃希氏菌經發(fā)酵獲得的菌體為催化劑，以3-氰基吡啶為底物，在ph7.2的磷酸鹽緩沖液中構成轉化反應體系，在30℃條件下進行批次轉化反應，采用hplc檢測轉化液中底物殘留情況，反應完全后，繼續(xù)投入下一批次底物。

所述反應體系中底物投料濃度為100～300mm。

所述發(fā)酵培養(yǎng)獲得的含腈水解酶細胞用量以菌體干重計為1.5～5.0g/l。

本發(fā)明所述重組菌cgmccno.14254發(fā)酵培養(yǎng)獲得的含酶濕菌體的菌體干重測量方法為：測量單位菌濁度、單位體積的菌體細胞干重，得od600與菌體細胞干重的關系曲線，可以獲得不同光密度下的菌懸液干重。

本發(fā)明所述檢測底物3-氰基吡啶和產物煙酸的高效液相色譜條件為：dionex3000型高效液相色譜儀，色譜柱為waters公司的xbridgedc18柱(5.0μm，250mm×4.6mm)，柱溫30℃，流速為0.5ml/min，紫外檢測波長268nm，流動相為乙腈/0.02％三氟乙酸(3/2)等度洗脫。

本發(fā)明的有益效果主要體現在：(1)本發(fā)明首次成功構建了產組成型重組腈水解酶的大腸埃希氏菌cgmccno.14254，該菌株無需進行體外誘導便可高效表達重組腈水解酶，為生物催化合成煙酸提供大量廉價的催化劑；(2)本發(fā)明提供了一種產腈水解酶的大腸埃希氏菌cgmccno.14254的高密度發(fā)酵方法，該方法采用ph-stat策略進行流加補料，既保證了菌體的快速生長，又避免了菌體過快生長產酸所導致的抑制效應，而且在不同發(fā)酵階段采用不同的調控策略，使腈水解酶對3-氰基吡啶底物的酶活達到目前文獻報道的最高水平，為653.84u/ml，菌體最大od600為86.40，分別為分批發(fā)酵的14.87倍和6.69倍；(3)本發(fā)明將重組大腸埃希氏菌用于生物催化生產煙酸實驗，結果表明，該菌可有效生物催化連續(xù)生產煙酸，底物3-氰基吡啶投料濃度為200mm(20.8g/l)時，以3.51g/l的靜息細胞為催化劑時，平均轉化速率為26.97g/h，能在290min內完全轉化22批次底物，煙酸累積濃度可達541g/l，因此該菌株在生物催化連續(xù)生產煙酸的領域中具有廣泛的應用前景。

附圖說明

圖1為菌體干重與光密度od600之間的關系曲線；

圖2為ph-stat補料策略下cgmccno.14254產生重組腈水解酶的發(fā)酵過程曲線；

圖3為100mm投料底物濃度對連續(xù)轉化合成煙酸的影響；

圖4為200mm投料底物濃度對連續(xù)轉化合成煙酸的影響；

圖5為300mm投料底物濃度對連續(xù)轉化合成煙酸的影響；

圖6為1.50g/l(a)、2.26g/l(b)、3.51g/l(c)和4.57g/l(d)的cgmccno.14254靜息細胞進行批次轉化反應結果。

具體實施方式

下面結合具體實施例對本發(fā)明進行進一步描述，但本發(fā)明的保護范圍并不僅限于此。

實施例1：產組成型重組腈水解酶的大腸埃希氏菌cgmccno.14254的構建

下列實施例中未注明具體分子構建條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件如sambrook等人的《分子克隆實驗手冊》(newyork:coldspringharborlaboratorypress,1989)中所述的條件，或者按照制造廠商所建議的條件。

1)腈水解酶基因nit序列的擴增：從惡臭假單胞菌pseudomonasputidacgmcc3830中提取基因組dna，作為模版，設計上下游引物2pu、3bd及酶切位點，進行pcr擴增，引物：

2pu：5'-ggaattccatatgatggttacgtacacgaataagtt-3'

3bd：5'-attgctcagctcagctctcttcatggaccttaac-3'

pcr擴增體系：

pcr反應過程：在95℃預變性3min后開始循環(huán)，95℃變性30s，59℃退火30s，72℃延伸90s，共30個循環(huán)；于72℃下終延伸5min；12℃保溫獲得攜帶酶切位點的腈水解酶基因nit。

2)重組質粒的制備：利用限制性內切酶對pet-3b質粒進行雙酶切，酶切體系設計如下：

經瓊脂糖凝膠電泳分析回收獲得酶切后的pet-3b質粒。

3)腈水解酶基因與pet-3b質粒的連接：連接酶切后的腈水解酶基因與pet-3b質粒，得到重組質粒pet-3b-nit，連接體系設計如下：

4)重組質粒的轉化：將重組質粒pet-3b-nit轉入e.colibl21(de3)中得到重組菌e.colibl21(de3)(pet-3b-nit)，命名為大腸埃希氏菌escherichiacolinit-1，現保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為cgmccno.14254，保藏日期2017年6月19日。

實施例2：高密度發(fā)酵技術在重組腈水解酶發(fā)酵中的應用

將斜面菌種cgmccno.14254進行活化，以2％的接種量轉接至新鮮的種子培養(yǎng)基中，在37℃條件下培養(yǎng)8h。按照10％接種量轉接至發(fā)酵罐中，利用ph電極和溶氧電極實時監(jiān)測發(fā)酵液的ph和溶氧值，通過調節(jié)轉速和通氣量，使溶氧維持在10％。從分批發(fā)酵階段開始，通過流加氨水調節(jié)ph，使之不低于6.8；在補料階段，設置ph穩(wěn)定在6.8，(1)補料前期，ph變動0.01時開始流加補料培養(yǎng)基或氨水；(2)補料中期，ph變動0.03開始流加補料培養(yǎng)基或氨水；(3)補料后期，ph變動0.05即開始流加補料培養(yǎng)基或氨水。定期取樣監(jiān)測分批發(fā)酵階段的殘?zhí)菨舛?，當殘?zhí)腔鞠耐耆珪r進入補料培養(yǎng)階段。發(fā)酵培養(yǎng)至39h，測得菌體最高od600為86.4，是分批發(fā)酵的6.69倍；在發(fā)酵45h時，酶活達到最高值，為653.84u/ml，是分批發(fā)酵的14.87倍。根據已有資料來看，本研究所產腈水解酶總酶活為目前文獻報道的最高水平。

實施例3：游離細胞催化劑的制備及連續(xù)轉化

將cgmccno.14254于發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)8～10h的發(fā)酵液于12000×g離心1min后棄去上清液，再用磷酸鈉緩沖液(ph7.2,100mm)重懸菌體并洗滌2～3次，得到除去培養(yǎng)基殘液的菌體，最后用相同的磷酸鈉緩沖液重懸菌體得到靜息細胞懸浮液，測定菌體濃度后保存于4℃冰箱中備用。

將制備的細胞菌懸液(100ml，菌體干重為2.26g/l)與1.04g3-氰基吡啶(3-氰基吡啶初始濃度為100mm)混合，在30℃、220rpm條件下進行轉化反應，通過hplc檢測轉化液中殘留底物情況，當底物被完全轉化時，繼續(xù)投入下一批次的底物。

當投料底物終濃度為100mm時，大腸埃希氏菌游離細胞能夠在865min內完全轉化34批次底物，其中，在前14次補料中，游離細胞均能夠在20min內將底物完全轉化，隨著投料反應的繼續(xù)以及產物累積濃度的增加，轉化時間逐漸延長，至第34次補料，底物轉化時間延長至60min，煙酸終濃度達到418g/l。hplc未檢測出任何底物殘留，且反應過程無副產物煙酰胺生成，單位菌體對底物3-氰基吡啶的平均轉化速率為10.85g/h。

實施例4：改變投料底物濃度，連續(xù)轉化合成煙酸

將實施例3制備的菌懸液(100ml，菌體干重為2.26g/l)與2.08g3-氰基吡啶(3-氰基吡啶初始濃度為200mm)混合，在30℃、220rpm條件下進行轉化反應，通過hplc檢測轉化液中殘留底物情況，當底物被完全轉化時，繼續(xù)投入下一批次的底物。

當底物投料濃度為200mm時，轉化前期每批次補料的底物均能在20min內完全轉化，第11批次補料后，底物轉化時間延長至25min，在第17批次補料后，底物轉化時間延長至60min。最終，游離細胞能夠在410min內完全轉化17批次底物，煙酸終濃度約為418g/l。hplc未檢測出任何底物殘留，單位菌體對底物3-氰基吡啶的平均轉化速率為22.90g/h。

實施例5：改變投料底物濃度，連續(xù)轉化合成煙酸

將實施例3制備的菌懸液(100ml，菌體干重為2.26g/l)與3.12g3-氰基吡啶(3-氰基吡啶初始濃度為300mm)混合，在30℃、220rpm條件下進行轉化反應，通過hplc檢測轉化液中殘留底物情況，當底物被完全轉化時，繼續(xù)投入下一批次的底物。

按照3-氰基吡啶終濃度300mm的投料量進行批次轉化實驗，重組菌游離細胞能夠在365min內完全轉化8批次底物，在前6次補料中，菌體均能夠在30min內將底物完全轉化，在第8次投料后，底物完全轉化時間延長至115min，煙酸終濃度為295g/l。hplc未檢測出任何底物殘留，單位菌體對底物3-氰基吡啶的平均轉化速率為18.15g/h。

實施例6：改變靜息細胞濃度，連續(xù)轉化合成煙酸

將實施例3制備的菌懸液(100ml，菌體干重為1.50g/l)與2.08g3-氰基吡啶(3-氰基吡啶初始濃度為200mm)混合，在30℃、220rpm條件下進行轉化反應，通過hplc檢測轉化液中殘留底物情況，當底物被完全轉化時，繼續(xù)投入下一批次的底物。

1.50g/l的靜息細胞能夠在400min內完全轉化14批次底物，煙酸濃度達到344g/l，前12批次補料的底物均能在25min內被完全轉化，直至第14批次補料后，底物在60min左右才被完全轉化。單位大腸埃希氏菌菌體對底物3-氰基吡啶的平均轉化速率為29.12g/h。

實施例7：改變靜息細胞濃度，連續(xù)轉化合成煙酸

將實施例3制備的菌懸液(100ml，菌體干重為3.51g/l)與2.08g3-氰基吡啶(3-氰基吡啶初始濃度為200mm)混合，在30℃、220rpm條件下進行轉化反應，通過hplc檢測轉化液中殘留底物情況，當底物被完全轉化時，繼續(xù)投入下一批次的底物。

3.51g/l的靜息細胞能夠在290min內完全轉化22批次底物，煙酸濃度達到541g/l，前20批次補料的底物均能在10min內被完全轉化，至第22批次補料，底物轉化時間延長至60min左右，每克菌體對底物3-氰基吡啶的平均轉化速率為26.97g/h。

實施例8：改變靜息細胞濃度，連續(xù)轉化合成煙酸

將實施例3制備的菌懸液(100ml，菌體干重為4.57g/l)與2.08g3-氰基吡啶(3-氰基吡啶初始濃度為200mm)混合，在30℃、220rpm條件下進行轉化反應，通過hplc檢測轉化液中殘留底物情況，當底物被完全轉化時，繼續(xù)投入下一批次的底物。

4.57g/l的靜息細胞可在280min內完全轉化24批次的底物，煙酸濃度達到了590g/l，在前22次的投料反應當中，每批次投入的底物均能在10min內被完全消耗，至第24批次補料時，底物轉化時間延長到30min。每克菌體對底物3-氰基吡啶的平均轉化速率為23.41g/h。

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