本發(fā)明涉及一株分泌抗泰拉霉素單克隆抗體的雜交瘤細胞株1b3及其應(yīng)用，可用于食品中泰拉霉素殘留的檢測，屬于免疫化學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

泰拉霉素（tulathromycin，tula）是近年新上市的為動物專用的大環(huán)內(nèi)酯類半合成抗生素。我國農(nóng)業(yè)部在2008年第957號公告中首次批準(zhǔn)使用泰拉霉素。泰拉霉素主要用于放線桿菌、支原體、巴氏桿菌、副嗜血桿菌引起的豬、牛的呼吸系統(tǒng)疾病，具有用量少、一次給藥、低殘留、動物專用等優(yōu)點。我國廣泛使用的大環(huán)內(nèi)酯類藥物為泰樂菌素和替米考星,雖然這兩種藥物的使用效果良好,但隨著使用時間的延長,在很多地區(qū)出現(xiàn)了不同程度的耐藥性,而泰拉霉素藥效強于泰樂菌素、替米考星和氟苯尼考等市場廣泛使用的大環(huán)內(nèi)酯類藥物，因此，泰拉霉素必將在畜禽生產(chǎn)中大量使用。作為一種新藥，泰拉霉素的殘留檢測方法的研究尤為必要。

目前，大環(huán)內(nèi)酯類藥物殘留檢測方法有酶聯(lián)免疫分析方法（elisa）篩選法、薄層色譜法、氣質(zhì)聯(lián)用法、高效液相色譜和高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法等，關(guān)于泰拉霉素的殘留檢測多數(shù)都是借助于儀器。但是這些方法昂貴、耗時、需要專業(yè)的人員來操作。酶聯(lián)免疫分析方法（elisa）是一種半定量的、簡單、靈敏、快捷和高通量的檢測方法，對于食品中藥物殘留的檢測有重要意義。目前沒有關(guān)于抗泰拉霉素單克隆抗體的研究。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一株分泌抗泰拉霉素單克隆抗體的雜交瘤細胞株1b3及其應(yīng)用，并在此基礎(chǔ)上建立elisa方法。

抗泰拉霉素單克隆抗體是通過小鼠免疫泰拉霉素免疫原獲得。以泰拉霉素為原料，通過丁二酸酐法衍生出羧基，再利用羧基與載體蛋白偶聯(lián)獲得免疫原，包被原通過羰基咪唑法合成。篩選血清陽性高抑制好的小鼠取脾臟，將脾細胞與sp2/0瘤細胞融合。融合后用間接elisa方法檢測細胞上清，篩選對陽性高且對泰拉霉素抑制好的細胞進行亞克隆，進行三次亞克隆，獲得純的細胞株。將細胞株注射進打過石蠟油的小鼠的腹腔制備腹水，獲得的腹水用辛酸-硫酸銨方法進行純化。測定單克隆抗體對泰拉霉素的半數(shù)抑制濃度(ic50)，以及對其結(jié)構(gòu)類似物的ic50，計算交叉反應(yīng)率。將泰拉霉素藥物添加入牛奶中，進行樣本添加回收實驗，計算回收率。

本發(fā)明的技術(shù)方案：一株分泌抗泰拉霉素單克隆抗體的雜交瘤細胞株1b3，已保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，簡稱cgmcc，保藏編號cgmccno.13098，保藏日期2016年10月31日，分類命名單克隆細胞株。

抗泰拉霉素單克隆抗體，其是由保藏編號cgmccno.13098雜交瘤細胞株1b3分泌產(chǎn)生，其ic50為0.79μg/l。

所述抗泰拉霉素單克隆抗體的應(yīng)用，用于食品中泰拉霉素殘留檢測中的應(yīng)用。

本發(fā)明的有益效果：采用間接競爭elisa測定細胞株1b3分泌的單克隆抗體對泰拉霉素的ic50為0.79μg/l。對牛奶中泰拉霉素的回收率范圍為93.29%～112.31%。為動物性食品中泰拉霉素殘留的免疫檢測提供了原料，具有實際應(yīng)用價值。

生物材料樣品保藏：分泌抗泰拉霉素單克隆抗體的雜交瘤細胞株1b3，已保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，簡稱cgmcc，地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國科學(xué)院微生物研究所，保藏編號為cgmccno.13098，保藏日期2016年10月31日，分類命名單克隆細胞株。

附圖說明

圖1是1b3分泌的單克隆抗體對泰拉霉素的標(biāo)準(zhǔn)抑制曲線。

具體實施方式

本發(fā)明下面的實施例僅作為本發(fā)明內(nèi)容的進一步說明，不能作為本發(fā)明的限定內(nèi)容或范圍。下面通過實施例對本發(fā)明作進一步說明。

實施例1半抗原的合成

以泰拉霉素為原料，通過丁二酸酐引入羧基獲得半抗原。100mg泰拉霉素溶解于3ml無水吡啶中，加入150mg丁二酸酐，60℃回流反應(yīng)8h，氮氣吹干反應(yīng)液得到泰拉霉素衍生物，即為半抗原。

實施例2免疫原和包被原的合成

免疫原通過碳二亞胺法合成：20mg泰拉霉素半抗原溶解于4ml無水dmf溶液中，加入9.55mgedc和5.75mgnhs，室溫攪拌4h進行活化。40mg牛血清白蛋白溶解于5ml碳酸鹽緩沖溶液，將活化好的半抗原加入蛋白溶液中，反應(yīng)過夜。反應(yīng)結(jié)束后，透析3天，得到免疫原。

包被原通過羰基咪唑方法合成：10mg泰拉霉素（tula）溶解于2ml無水dmf中，加入3mg羰基咪唑（cdi），60℃活化30min。23mg雞卵清白蛋白（ova）溶解于4ml碳酸鹽緩沖溶液中，將活化好的泰拉霉素加入蛋白溶液中，60℃反應(yīng)6h。反應(yīng)結(jié)束后，透析三天，得到包被原tula-cdi-ova。

實施例3小鼠免疫

免疫原用生理鹽水稀釋到合適的濃度，再與等量的弗氏佐劑乳化，在6～8周齡的balb/c小鼠的背上進行多點注射。首次免疫用的是弗氏完全佐劑，劑量為100μg。后面的四次加強免疫用的是弗氏不完全佐劑，免疫劑量為50μg，免疫間隔為21天。第三次免疫后，通過小鼠的尾靜脈采血，并通過間接elisa來檢測血清。第五次免疫后篩選效價高抑制好的小鼠進行腹腔沖刺免疫，三天以后取出小鼠脾臟進行細胞融合。

實施例4細胞融合與篩選

小鼠脾細胞和瘤細胞在peg1500的作用下融合形成雜交瘤細胞。融合后第七天進行檢測，篩選效價高且對泰拉霉素識別性好的細胞株進行亞克隆，以此類推，進行3次亞克隆獲得純的細胞株1b3。

實施例5單克隆抗體的純化

篩選出的細胞株擴大培養(yǎng)后，注射進已經(jīng)打過石蠟油的小鼠腹腔內(nèi)，7到14天后可以從小鼠腹腔抽取腹水。腹水用辛酸-硫酸銨方法進行純化，儲存在-20℃。

實施例6單克隆抗體的性質(zhì)

抗體的靈敏度和特異性通過間接elisa來測定。

1、單克隆抗體的交叉

將包被原tula-cdi-ova用0.05mph9.6碳酸鹽緩沖液稀釋，100μl/孔，37℃反應(yīng)2h。包被原濃度為（0.5μg/ml）和單克隆抗體濃度（0.8μg/ml）通過棋盤法確定。將板內(nèi)溶液傾去，甩干，并用洗滌液pbst洗滌3次，每次3min。拍干后，加入200μl/孔封閉液，37℃反應(yīng)2h。洗滌后烘干備用。酶標(biāo)板的每孔里加入50μl標(biāo)準(zhǔn)物（tula）溶液和50μl抗體，在37℃下培養(yǎng)30min后洗滌三次后拍干，每孔加入1︰3000稀釋二抗100μl，在37℃下培養(yǎng)30min后洗滌4次后拍干，加入已配制好的tmb顯色液100μl，37℃培養(yǎng)15min,最后每孔加入50μl2m硫酸溶液終止反應(yīng)。用酶標(biāo)儀測定在450nm處的吸光值。

單克隆抗體的交叉實驗測定了其他的大環(huán)內(nèi)酯類抗生素：泰樂菌素(tylosin),替米考星(tilmicosin),紅霉素(erythromycin),羅紅霉素(roxithromycin),螺旋霉素(spiramycin),克拉霉素(clarithromycin),吉他霉素(kitasamycin),阿奇霉素(azithromycin),阿維菌素(avermectin),伊維菌素(ivermectin)和多拉菌素(doramectin)交叉反應(yīng)率為類似物的ic50與泰拉霉素ic50的比值。其交叉實驗如表1所示。

表1.1b3分泌的單克隆抗體的交叉

2.添加回收實驗

向陰性牛奶中添加泰拉霉素，用單克隆抗體進行檢測，計算回收率。添加回收實驗見表2。

表2.添加回收實驗

溶液配制：

碳酸鹽緩沖液（cbs）：稱取na2co31.59g，nahco32.93g，分別溶于少量雙蒸水后混合，加雙蒸水至約800ml混勻，調(diào)ph至9.6，加雙蒸水定容至1000ml，4℃貯存?zhèn)溆茫?/p>

磷酸鹽緩沖液（pbs）：8.00gnacl，0.2gkcl，0.2gkh2po4，2.9gna2hpo4·12h2o，溶于800ml純水中，用naoh或hcl調(diào)ph到7.2～7.4，定容至1000ml；

pbst：含0.05%吐溫20的pbs；

tmb顯色液：a液：na2hpo4·12h2o18.43g，檸檬酸9.33g，純水定容至1000ml；b液：60mgtmb溶于100ml乙二醇中。a、b液按體積比1︰5混合即為tmb顯色液，現(xiàn)用現(xiàn)混。

綜上所述僅為本發(fā)明的較佳實施例而已，并非用來限定本發(fā)明的實施范圍。即凡依本發(fā)明申請范圍的內(nèi)容所作的等效變化與修飾，都應(yīng)為本發(fā)明的技術(shù)范疇。