本發(fā)明屬于海洋化工工程技術(shù)，具體涉及一種海洋生物多糖鋅復(fù)合物及其制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

金屬制劑由于其價(jià)格低廉、使用方法簡(jiǎn)單、不易產(chǎn)生抗藥性等諸多優(yōu)點(diǎn)而廣泛應(yīng)用于農(nóng)用殺菌劑方面。其主要為有機(jī)配位類型。依靠釋放出金屬離子與病菌體內(nèi)蛋白質(zhì)中的-sh、-nh2、-cooh、-oh等基團(tuán)起作用，導(dǎo)致病菌死亡。但傳統(tǒng)金屬制劑使用不當(dāng)極易產(chǎn)生重金屬污染。因此，金屬離子的含量和釋放能力是決定金屬制劑殺菌防病效果的主要因素，同時(shí)也是決定其對(duì)作物安全性高低的重要因素。

殼聚糖是一種可再生、無(wú)毒、生物相容性和降解性良好的海洋氨基多糖。殼聚糖對(duì)多種植物病原真菌均有抑制作用，在農(nóng)業(yè)中可以作為土壤改良劑防治土傳病害，用作種衣劑防治種傳病害、果蔬保鮮控制采后病害等，將其開(kāi)發(fā)為新型海洋生物源農(nóng)藥，無(wú)疑具有廣闊的應(yīng)用前景。然而殼聚糖作為單一活性組分直接使用存在藥效較差、用量大、成本高等問(wèn)題，因而推廣困難。

氨基吡啶類席夫堿作為天然氨基酸的類似物,其合成方法和生物活性受到科學(xué)家的廣泛關(guān)注,而其多變的結(jié)構(gòu)類型又為不斷合成新化合物奠定了基礎(chǔ)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明就是針對(duì)上述問(wèn)題，提供了一種海洋生物多糖鋅復(fù)合物及其制備方法和應(yīng)用。

為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案為：

一種海洋生物多糖鋅復(fù)合物，復(fù)合物如式i所示，

式i中，r為氫、甲基、氯或三氟甲基；n＝4-4000。

一種海洋生物多糖鋅復(fù)合物的制備方法：

1)將氨基吡啶溶于過(guò)量的溶劑中，而后再加入乙酰丙酮在加熱回流下進(jìn)行反應(yīng)生成單季胺配體；其中，氨基吡啶與乙酰丙酮的摩爾比為1:1-3；

2)全脫乙酰殼聚糖溶于過(guò)量的溶劑中，而后再加入步驟1)的單季胺配體在酸催化的條件下進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)物與氯乙酸反應(yīng)生成o-羧甲基殼聚糖乙酰丙酮氨基吡啶席夫堿衍生物；

3)將上述獲得o-羧甲基殼聚糖乙酰丙酮氨基吡啶席夫堿衍生物溶于過(guò)量溶劑中，再加入二水乙酸鋅在60-80℃攪拌下反應(yīng)即得式i所示復(fù)合物o-羧甲基殼聚糖乙酰丙酮氨基吡啶席夫堿鋅復(fù)合物；其中，o-羧甲基殼聚糖乙酰丙酮氨基吡啶席夫堿衍生物與二水乙酸鋅的質(zhì)量比為1:3-5。

所述步驟1)氨基吡啶溶于溶劑中，而后再加入乙酰丙酮在60-80℃回流下反應(yīng)6-12小時(shí)生成單季胺配體；其中，溶劑的體積與氨基吡啶質(zhì)量比為10-100:1；所述氨基吡啶為2-氨基吡啶、2-氨基-5-甲基吡啶、2-氨基-5-氯吡啶或2-氨基-5-三氟甲基吡啶；溶劑為甲醇和/或乙醇。

所述步驟2)全脫乙酰殼聚糖溶于過(guò)量的溶劑中，而后再加入步驟1)的單季胺配體在60-80℃、酸催化的條件下反應(yīng)12-18小時(shí)生成殼聚糖乙酰丙酮氨基吡啶席夫堿衍生物，反應(yīng)物與氯乙酸在60-80℃6-12小時(shí)反應(yīng)，產(chǎn)物加入乙醇沉淀，過(guò)濾，濾餅用溶劑洗滌，在50-60℃下進(jìn)行干燥，即得o-羧甲基殼聚糖乙酰丙酮氨基吡啶席夫堿衍生物；其中，溶劑的體積與全脫乙酰殼聚糖質(zhì)量比為50-300:1；全脫乙酰殼聚糖的質(zhì)量與單季胺配體的質(zhì)量比為1:4-10；全脫乙酰殼聚糖的質(zhì)量與氯乙酸的質(zhì)量比為1:5-10；所述的酸催化劑為甲酸、乙酸、丙酸中的一種或幾種；溶劑為甲醇、乙醇、水中的一種或幾種。

所述步驟3)將上述獲得o-羧甲基殼聚糖乙酰丙酮氨基吡啶席夫堿衍生物溶于過(guò)量溶劑中，再加入一水乙酸鋅在60-80℃攪拌下反應(yīng)6-12小時(shí)反應(yīng)后過(guò)濾，濾餅用溶劑洗滌，在50-60℃下進(jìn)行干燥，即得式i所示復(fù)合物o-羧甲基殼聚糖乙酰丙酮氨基吡啶席夫堿鋅復(fù)合物衍生物；其中，溶劑的體積與o-羧甲基殼聚糖乙酰丙酮氨基吡啶席夫堿衍生物質(zhì)量比為100-300:1。

所述殼聚糖分子量為130萬(wàn)。用于洗滌溶劑為乙醇或甲醇。

一種海洋生物多糖鋅復(fù)合物的應(yīng)用，所述式i所示復(fù)合物用于制備農(nóng)用殺菌劑中的應(yīng)用。

所述式i所示復(fù)合物用于制備農(nóng)用真菌殺菌劑中的應(yīng)用。

原理：殼聚糖結(jié)構(gòu)中含有-nh2，可與單季胺配體發(fā)生席夫堿反應(yīng)在殼聚糖結(jié)構(gòu)中引入氨基吡啶，再用席夫堿中電子密度高的碳原子配位鋅離子，進(jìn)而與殼聚糖產(chǎn)生協(xié)同作用，顯著提高衍生物的生物活性。

本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)：

1.本發(fā)明復(fù)合物殼聚糖結(jié)構(gòu)中引入氨基吡啶基團(tuán)與鋅離子，當(dāng)只引入氨基吡啶的話抑菌活性遠(yuǎn)不及復(fù)合物，同時(shí)只引入鋅離子的產(chǎn)物不溶解于水，無(wú)法使用；只有同時(shí)引入三者才產(chǎn)生協(xié)同增效作用，顯著提高了殼聚糖的抑菌活性。

2.本發(fā)明制備的o-羧甲基殼聚糖乙酰丙酮氨基吡啶席夫堿鋅復(fù)合物具有良好的溶解性，可溶于多種溶劑，在提高抑菌效果的同時(shí)還避免了重金屬離子在土壤中殘留，擴(kuò)大了其應(yīng)用領(lǐng)域，在農(nóng)藥領(lǐng)域有著潛在的應(yīng)用價(jià)值。

附圖說(shuō)明

圖1為全脫乙酰殼聚糖的紅外光譜圖，其紅外特征吸收(cm^-1)：1588,1069。

圖2為本發(fā)明實(shí)施例提供的殼聚糖衍生物1的紅外光譜圖，其紅外特征吸收(cm^-1)：3297,2936,1730,1586,1404,1062。

圖3為本發(fā)明實(shí)施例提供的殼聚糖衍生物2的紅外光譜圖，其紅外特征吸收(cm^-1)：3294,2936,1733,1558,1397,1050。

圖4為本發(fā)明實(shí)施例提供的殼聚糖衍生物3的紅外光譜圖，其紅外特征吸收(cm^-1)：3297,2936,1732,1559,1397,1058。

圖5為本發(fā)明實(shí)施例提供的殼聚糖衍生物4的紅外光譜圖，其紅外特征吸收(cm^-1)：3302,2973,1733,1576,1397,1050。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合說(shuō)明書附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明，并且本發(fā)明的保護(hù)范圍不僅局限于以下實(shí)施例。

本發(fā)明中氨基吡啶與乙酰丙酮發(fā)生反應(yīng)生成單季胺配體，單季胺配體與全脫乙酰殼聚糖c2位上的-nh2發(fā)生反應(yīng)生成殼聚糖席夫堿，之后與氯乙酸發(fā)生反應(yīng)生成o-羧甲基殼聚糖衍生物，該殼聚糖衍生物上共軛體系中的碳與乙酸鋅的鋅離子配位生成o-羧甲基殼聚糖鋅復(fù)合物衍生物，所得的衍生物經(jīng)紅外光譜分析確定其結(jié)構(gòu)，殼聚糖與接入的基團(tuán)有效地結(jié)合生成o-羧甲基殼聚糖乙酰丙酮氨基吡啶類席夫堿鋅復(fù)合物衍生物。

本發(fā)明采用活性亞結(jié)構(gòu)拼接原理，將氨基吡啶類席夫堿衍生物的生物活性基團(tuán)引入到天然產(chǎn)物殼聚糖骨架中，利用分子中的氨基絡(luò)合鋅離子，制備出抑菌和誘導(dǎo)抗病活性均提高的新型殼聚糖衍生物，為開(kāi)發(fā)新型生物農(nóng)藥的開(kāi)辟了新途徑。

實(shí)施例1衍生物1的制備

將4.7克2-氨基吡啶、5克乙酰丙酮加入到150ml無(wú)水乙醇中，回流反應(yīng)12小時(shí)，反應(yīng)物旋蒸，冷乙醇洗，60攝氏度下干燥，即得單季胺配體。

將1.5克分子量為130萬(wàn)的殼聚糖加入到60ml無(wú)水乙醇和75ml水中，攪拌下向其滴加1.5ml乙酸；2.5克單季胺配體加入到50ml無(wú)水乙醇中，滴加到反應(yīng)體系中，回流反應(yīng)15小時(shí)；將7.5克氯乙酸加入到20ml無(wú)水乙醇中，滴加到反應(yīng)體系中，60℃反應(yīng)6小時(shí)，冷卻至室溫，加入無(wú)水乙醇沉淀，沉淀抽濾，無(wú)水乙醇洗滌，60℃下干燥，得淡黃色粉末，即為o-羧甲基殼聚糖席夫堿衍生物。

將1.0克o-羧甲基殼聚糖席夫堿衍生物溶于60ml水中，1.16克zn(oac)2·2h2o溶于100ml水中，60℃攪拌下將乙酸鋅水溶液滴加到席夫堿水溶液中，反應(yīng)6小時(shí)，冷卻至室溫，加入無(wú)水乙醇沉淀，離心，無(wú)水乙醇洗滌洗，60℃干燥，得深黃色粉末，即為o-羧甲基殼聚糖鋅復(fù)合物衍生物1，結(jié)構(gòu)見(jiàn)通式i(r為氫；n＝4-4000)。殼聚糖席夫堿的制備可參考以下文獻(xiàn)：

zhanyongguo,r.x.,songliu,zhimeizhong,xiaji,linwang,pengchengli(2007)."antifungalpropertiesofschiffbasesofchitosan,n-substitutedchitosanandquaternizedchitosan."carbohydrateresearch342(10):1329-1332.

紅外光譜表明：o-羧甲基殼聚糖鋅復(fù)合物衍生物1的紅外譜圖(圖2)與全脫乙酰殼聚糖的紅外譜圖(圖1)相比，位于1588cm^-1的nh的特征吸收峰減弱，表明nh2已經(jīng)發(fā)生反應(yīng)；1404cm^-1為c-n的特征吸收峰；1586cm^-1為吡啶環(huán)的特征吸收；證明目衍生物1合成成功。

實(shí)施例2衍生物2的制備

將5.4克2-氨基-5-甲基吡啶、5克乙酰丙酮加入到150ml無(wú)水乙醇中，回流反應(yīng)12小時(shí)，反應(yīng)物旋蒸，冷乙醇洗，60攝氏度下干燥，即得單季胺配體。

將1.5克分子量為130萬(wàn)的殼聚糖加入到60ml無(wú)水乙醇和75ml水中，攪拌下向其滴加1.5ml乙酸；2.7克單季胺配體加入到50ml無(wú)水乙醇中，滴加到反應(yīng)體系中，回流反應(yīng)15小時(shí)；將7.5克氯乙酸加入到20ml無(wú)水乙醇中，滴加到反應(yīng)體系中，60℃反應(yīng)6小時(shí)，冷卻至室溫，加入無(wú)水乙醇沉淀，沉淀抽濾，無(wú)水乙醇洗滌，60℃下干燥，得淡黃色粉末，即為o-羧甲基殼聚糖席夫堿衍生物。

將1.0克o-羧甲基殼聚糖席夫堿衍生物溶于60ml水中，1.16克zn(oac)2·2h2o溶于100ml水中，60℃攪拌下將乙酸鋅水溶液滴加到席夫堿水溶液中，反應(yīng)6小時(shí)，冷卻至室溫，加入無(wú)水乙醇沉淀，離心，無(wú)水乙醇洗滌洗，60℃干燥，得深黃色粉末，即為o-羧甲基殼聚糖鋅復(fù)合物衍生物2，結(jié)構(gòu)見(jiàn)通式i(r為甲基；n＝4-4000)。紅外光譜表明：o-羧甲基殼聚糖鋅復(fù)合物衍生物2的紅外譜圖(圖3)與全脫乙酰殼聚糖的紅外譜圖(圖1)相比，位于1588cm^-1的nh的特征吸收峰減弱，表明nh2已經(jīng)發(fā)生反應(yīng)；1397cm^-1c-n的特征吸收峰；1558cm^-1為吡啶環(huán)的特征吸收；證明目衍生物2合成成功。

實(shí)施例3衍生物3的制備

將6.4克2-氨基-5-氯吡啶、5克乙酰丙酮加入到150ml無(wú)水乙醇中，回流反應(yīng)12小時(shí)，反應(yīng)物旋蒸，冷乙醇洗，60攝氏度下干燥，即得單季胺配體。

將1.5克分子量為130萬(wàn)的殼聚糖加入到60ml無(wú)水乙醇和75ml水中，攪拌下向其滴加1.5ml乙酸；2.9克單季胺配體加入到50ml無(wú)水乙醇中，滴加到反應(yīng)體系中，回流反應(yīng)15小時(shí)；將7.5克氯乙酸加入到20ml無(wú)水乙醇中，滴加到反應(yīng)體系中，60℃反應(yīng)6小時(shí)，冷卻至室溫，加入無(wú)水乙醇沉淀，沉淀抽濾，無(wú)水乙醇洗滌，60℃下干燥，得淡黃色粉末，即為o-羧甲基殼聚糖席夫堿衍生物。

將1.0克o-羧甲基殼聚糖席夫堿衍生物溶于60ml水中，1.16克zn(oac)2·2h2o溶于100ml水中，60℃攪拌下將乙酸鋅水溶液滴加到席夫堿水溶液中，反應(yīng)6小時(shí)，冷卻至室溫，加入無(wú)水乙醇沉淀，離心，無(wú)水乙醇洗滌洗，60℃干燥，得深綠色粉末，即為o-羧甲基殼聚糖鋅復(fù)合物衍生物3，結(jié)構(gòu)見(jiàn)通式i(r為氯；n＝4-4000)。紅外光譜表明：o-羧甲基殼聚糖鋅復(fù)合物衍生物3的紅外譜圖(圖4)與全脫乙酰殼聚糖的紅外譜圖(圖1)相比，位于1588cm^-1的nh的特征吸收峰減弱，表明nh2已經(jīng)發(fā)生反應(yīng)；1397cm^-1c-n的特征吸收峰；1559cm^-1為吡啶環(huán)的特征吸收；證明目衍生物3合成成功。

實(shí)施例4衍生物4的制備

將8.1克2-氨基-5-三氟甲基吡啶、5克乙酰丙酮加入到150ml無(wú)水乙醇中，回流反應(yīng)12小時(shí)，反應(yīng)物旋蒸，冷乙醇洗，60攝氏度下干燥，即得單季胺配體。

將1.5克分子量為130萬(wàn)的殼聚糖加入到60ml無(wú)水乙醇和75ml水中，攪拌下向其滴加1.5ml乙酸；3.4克單季胺配體加入到50ml無(wú)水乙醇中，滴加到反應(yīng)體系中，回流反應(yīng)15小時(shí)；將7.5克氯乙酸加入到20ml無(wú)水乙醇中，滴加到反應(yīng)體系中，60℃反應(yīng)6小時(shí)，冷卻至室溫，加入無(wú)水乙醇沉淀，沉淀抽濾，無(wú)水乙醇洗滌，60℃下干燥，得淡黃色粉末，即為o-羧甲基殼聚糖席夫堿衍生物。

將1.0克o-羧甲基殼聚糖席夫堿衍生物溶于60ml水中，1.16克zn(oac)2·2h2o溶于100ml水中，60℃攪拌下將乙酸鋅水溶液滴加到席夫堿水溶液中，反應(yīng)6小時(shí)，冷卻至室溫，加入無(wú)水乙醇沉淀，離心，無(wú)水乙醇洗滌洗，60℃干燥，得深綠色粉末，即為o-羧甲基殼聚糖鋅復(fù)合物衍生物4，結(jié)構(gòu)見(jiàn)通式i(r為三氟甲基；n＝4-4000)。紅外光譜表明：o-羧甲基殼聚糖鋅復(fù)合物衍生物4的紅外譜圖(圖5)與全脫乙酰殼聚糖的紅外譜圖(圖1)相比，位于1588cm^-1的nh的特征吸收峰減弱，表明nh2已經(jīng)發(fā)生反應(yīng)；1397cm^-1c-n的特征吸收峰；1576cm^-1為吡啶環(huán)的特征吸收；證明目衍生物4合成成功。

抑菌活性測(cè)定

采用生長(zhǎng)速率法測(cè)定樣品對(duì)立枯絲核病原菌的抑菌活性。測(cè)試在3個(gè)樣品濃度下即：100μg/ml，200μg/ml，400μg/ml對(duì)立枯絲核菌的抑制效果。

實(shí)驗(yàn)以相同濃度的噻菌銅藥劑(市售為20％的懸浮劑)為陽(yáng)性對(duì)照，以蒸餾水為陰性對(duì)照。以蒸餾水為陰性對(duì)照。將培養(yǎng)基均勻倒入1個(gè)直徑為9cm的培養(yǎng)皿中，待完全凝固后，在每個(gè)培養(yǎng)皿中接種3塊直徑為5mm的菌餅。在27℃下培養(yǎng)72小時(shí)后，測(cè)量菌落直徑，計(jì)算樣品的抑菌率。每次處理設(shè)置1個(gè)培養(yǎng)皿，每皿接種3個(gè)菌落，對(duì)每個(gè)菌落測(cè)定最大直徑(dmax)和最小直徑(dmin)，取平均值為樣品抑菌圈直徑d樣品，全部試驗(yàn)重復(fù)一次。根據(jù)下式計(jì)算抑菌率(參見(jiàn)表1)。

抑菌率(％)＝(d空白－d樣品)/(d空白－5)×100

表1部分通式1殼聚糖衍生物對(duì)立枯絲核菌的抑制活性

由上述表1中實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明o-羧甲基殼聚糖乙酰丙酮氨基吡啶類席夫堿鋅復(fù)合物衍生物無(wú)論低濃度還是高濃度下對(duì)立枯絲核菌都有良好的抑菌效果，低濃度時(shí)好于現(xiàn)在已有的堿式硫酸銅產(chǎn)品。