本發(fā)明屬于天然產(chǎn)物技術(shù)領(lǐng)域，涉及了一種黃顏木素的制備方法，更具體地說是涉及了從野漆樹枝條中提取純化黃顏木素的方法。

背景技術(shù)：

野漆樹(rhuspunjabensisvar.sinicarehd.)為漆樹科鹽膚木屬落葉小喬木，其根、莖、葉、皮、花和果實(shí)均入藥，且勿需與其它中藥配伍，單獨(dú)使用效果就很好，具有祛風(fēng)化濕，收斂解毒，生津潤肺，降火化痰等功效。該植物幼枝葉上形成的蟲癭俗稱五倍子，可作為重要的工業(yè)原料。黃顏木素(3，7，3，4-四羥基雙氫黃酮)是具有多種生物活性與藥用價值的黃酮類物質(zhì)。

近年來黃顏木素在歐、美、日、奧和新西蘭等國作為防癌、防治心血管等疾病藥物的主要藥效成分和安全無毒新型氧化酶抑制劑得到了廣泛應(yīng)用。使得國內(nèi)外對其需求量越來越大，但國內(nèi)外現(xiàn)僅依賴皂角刺及松柏等單一資源開發(fā)黃顏木素，已遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足市場對黃顏木素的需求，因此尋找新的黃顏木素含量高，又適合于工業(yè)化生產(chǎn)的植物資源已成研究熱點(diǎn)。武陵山片區(qū)野漆樹資源極其豐富，但僅僅開發(fā)其幼枝葉上形成的五倍子，其產(chǎn)量極高的果實(shí)還處于自生自滅狀態(tài)。

目前國內(nèi)外主要從豆科植物皂莢的皂角刺及松柏中提取黃顏木素，而從野漆樹中提取黃顏木素的研究國內(nèi)外還未見報道。目前黃酮類化合物的提取方法主要有水提取、加熱回流提取、堿提酸沉、乙醇提取、微波輔助提取、超聲波輔助提取、超臨界萃取等方法。酶解法為植物性中藥材藥效成分提取非常有效的技術(shù)，因?yàn)槊钢苿┠苡行У慕到庵参锛?xì)胞壁，使存在于胞內(nèi)藥效成分最大限度溶出，同時酶解反應(yīng)條件溫和，產(chǎn)物不易變性，保證了提取物的性質(zhì)和結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定。同時提取率也能較大的提高，并能大大縮短提取時間，是綠色高效的植物提取技術(shù)，可利用相關(guān)的酶制劑來提高提取物的極性，從而減少有機(jī)溶劑的使用，降低成本。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

針對野漆樹籽含有大量的纖維素和蛋白質(zhì)、黃顏木素極性小等問題，提出一種酶法制取黃顏木素的方法，并采用柱層析和結(jié)晶進(jìn)行分離出高純度的黃顏木素產(chǎn)品。

本發(fā)明采用的微生物菌種為枯草芽孢桿菌(bacillussubtilis)來源于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，編號分別為cgmccno.1.769。

本發(fā)明提供一種野漆樹中提取純化黃顏木素的方法，具體步驟包括如下：

(1)粉碎野漆樹籽，加入纖維素酶終濃度為50～200u/kg，再加入5～10％枯草芽孢桿菌液在25～30℃下發(fā)酵2～3天，得發(fā)酵液。

(2)將發(fā)酵液用氫氧化鈉調(diào)ph值至8～9，室溫放置4～6h，加入70％～80％乙醇水溶液，加熱至85～90℃進(jìn)行回流提取4～8h。

(3)將提取液陶瓷膜過濾一次，得濾液ⅰ，并在50～65℃條件下減壓回收乙醇，濃縮至稠膏狀，置真空干燥箱干燥至恒定質(zhì)量，得粗提取物。

(4)將粗提取物用等重量的75％～85％乙醇水溶液溶解，上大孔樹脂柱，用兩倍柱體積至三倍柱體積的20％乙醇水溶液，用四倍柱體積至六倍柱體積的60％～70％乙醇水溶液進(jìn)行洗脫，得洗脫液，在50～65℃條件下減壓回收乙醇，濃縮至原有體積的1/5～1/10，得濃縮液。

(5)將濃縮液置入-80℃冰箱冷凍結(jié)冰后，取出放入真空干燥機(jī)抽真空結(jié)晶，陶瓷膜過濾一次，得濾渣ⅰ，再其中加入45％乙醇水溶液溶解，再次置入冰箱0～5℃中進(jìn)行重結(jié)晶，陶瓷膜過濾一次，所得濾渣進(jìn)行25～35℃下真空干燥得黃顏木素純品。

上述枯草芽孢桿菌液都可以通過常規(guī)枯草芽孢桿菌培養(yǎng)方法發(fā)酵獲得，纖維素酶可從市場購買獲得，酶活性在2000u/g以上。

上述陶瓷膜過濾的孔徑為0.22μm。

上述70％乙醇水溶液的配制方法為80ml乙醇與20ml水混合即可。

在一個具體實(shí)施方案中，步驟(2)中所述氫氧化鈉是指0.01～0.05mol/l氫氧化鈉水溶液。

在一個具體實(shí)施方案中，步驟(2)中所述70％～80％乙醇水溶液的量l與野漆樹籽的重量kg比為2～5：1。

在一個具體實(shí)施方案中，步驟(4)中所述大孔樹脂為xda-8、lsa-21等樹脂。

在一個具體實(shí)施方案中，步驟(5)中所述45％乙醇水溶液的量l與濾渣ⅰ的重量kg比為0.5～2：1。

技術(shù)效果

1、通過酶法與堿提取，大大提高了黃顏木素的提取率，降低了野漆樹籽中蛋白質(zhì)對提取的影響。

2、通過柱層析和結(jié)晶相結(jié)合進(jìn)行分離，大大提高了黃顏木素的純度，簡化了純化的操作步驟，降低了黃顏木素的生產(chǎn)成本。

具體實(shí)施方式

下面用本發(fā)明的實(shí)施實(shí)例來進(jìn)一步說明本發(fā)明的實(shí)質(zhì)性內(nèi)容，但并不以此限制本發(fā)明。

實(shí)施例1

粉碎野漆樹籽100kg，加入纖維素酶粉終濃度為150u/kg，攪拌均勻后再加入10％枯草芽孢桿菌液在28℃下發(fā)酵2天，得發(fā)酵液。將發(fā)酵液用0.03mol/l氫氧化鈉調(diào)ph值至8，室溫放置4h，加入80％乙醇水溶液400l，加熱至85℃進(jìn)行回流提取5h，將提取液陶瓷膜過濾一次，得350l濾液ⅰ，并在55℃條件下減壓回收乙醇，濃縮至稠膏狀，置真空干燥箱干燥至恒定質(zhì)量，得粗提取物6.43kg。將粗提取物用85％乙醇水溶液6.43kg溶解，上lsa-21大孔樹脂柱，用三倍柱體積的20％乙醇水溶液，用六倍柱體積的65％乙醇水溶液進(jìn)行洗脫，得40l洗脫液，在55℃條件下減壓回收乙醇，濃縮至5l，將濃縮液置入-80℃冰箱冷凍結(jié)冰后，取出放入真空干燥機(jī)抽真空結(jié)晶，陶瓷膜過濾一次，得3.21kg濾渣ⅰ，再向其中加入45％乙醇水溶液4l溶解，再次置入冰箱0～5℃中進(jìn)行重結(jié)晶，陶瓷膜過濾一次，所得濾渣進(jìn)行35℃下真空干燥得1.74kg黃顏木素純品。黃顏木素的hplc檢測條件：色譜柱:c18(4.6×250mm，5μm)；流動相乙腈-0.4％磷酸(19:81)；紫外檢測器檢測；流速：1.0mill/min；柱溫：30℃；進(jìn)樣量:10μl。所獲得樣品中黃顏木素的含量為97.45％。

實(shí)施例2

粉碎野漆樹籽200kg，加入纖維素酶粉終濃度為200u/kg，攪拌均勻后再加入10％枯草芽孢桿菌液在30℃下發(fā)酵3天，得發(fā)酵液。將發(fā)酵液用0.05mol/l氫氧化鈉調(diào)ph值至8.5，室溫放置6h，加入75％乙醇水溶液700l，加熱至85℃進(jìn)行回流提取6h，得提取液。將提取液陶瓷膜過濾一次，得約600l濾液ⅰ，并在55℃條件下減壓回收乙醇，濃縮至稠膏狀，置真空干燥箱干燥至恒定質(zhì)量，得粗提取物13.68kg。將粗提取物用80％乙醇水溶液13.68kg溶解，上xda-8大孔樹脂柱，用兩倍柱體積的20％乙醇水溶液，用六倍柱體積的70％乙醇水溶液進(jìn)行洗脫，得90l洗脫液，在50℃條件下減壓回收乙醇，濃縮至10l，得濃縮液。將濃縮液置入-80℃冰箱冷凍結(jié)冰后，取出放入真空干燥機(jī)抽真空結(jié)晶，陶瓷膜過濾一次，得6.75kg濾渣ⅰ，再向其中加入45％乙醇水溶液8l溶解，再次置入冰箱0～5℃中進(jìn)行重結(jié)晶，陶瓷膜過濾一次，所得濾渣進(jìn)行30℃下真空干燥得3.95kg黃顏木素純品。所獲得樣品按實(shí)施例1的檢測方法進(jìn)行測定，黃顏木素的含量為97.23％。

實(shí)施例3

粉碎野漆樹籽400kg，加入纖維素酶粉終濃度為180u/kg，攪拌均勻后再加入10％枯草芽孢桿菌液在28℃下發(fā)酵3天，得發(fā)酵液。將發(fā)酵液用0.04mol/l氫氧化鈉調(diào)ph值至8.5，室溫放置6h，加入70％乙醇水溶液1500l，加熱至85℃進(jìn)行回流提取5h，得提取液。將提取液陶瓷膜過濾一次，得1400l濾液ⅰ，并在55℃條件下減壓回收乙醇，濃縮至稠膏狀，置真空干燥箱干燥至恒定質(zhì)量，得粗提取物28.01kg。將粗提取物用75％乙醇水溶液28.01kg溶解，上xda-8大孔樹脂柱，用三倍柱體積的20％乙醇水溶液，用六倍柱體積的65％乙醇水溶液進(jìn)行洗脫，得160l洗脫液，在50℃條件下減壓回收乙醇，濃縮至20l，得濃縮液。將濃縮液置入-80℃冰箱冷凍結(jié)冰后，取出放入真空干燥機(jī)抽真空結(jié)晶，陶瓷膜過濾一次，得14.28kg濾渣ⅰ，再向其中加入45％乙醇水溶液20l溶解，再次置入冰箱0～5℃中進(jìn)行重結(jié)晶，陶瓷膜過濾一次，所得濾渣進(jìn)行30℃下真空干燥得7.84kg黃顏木素純品。所獲得樣品按實(shí)施例1的檢測方法進(jìn)行測定，黃顏木素的含量為97.62％。